Abstract
Celler med sfære dannende evne, sfæroide celler, er til stede i de ondartede ascites av pasienter med ovarialcancer (EOC) og utgjør en betydelig hindring for effektiv behandling på grunn av deres antatte rolle i progresjon, metastase og kjemoterapi motstand. De eksakte mekanismene som ligger til grunn EOC metastase og narkotika motstand er ikke klart. Forstå biologi sfære dannende celler kan bidra til identifisering av nye terapeutiske muligheter for metastatisk EOC. Her genereres vi sfæroide celler fra menneskelige eggstokkreft cellelinjer og primære eggstokkreft. Xenoengraftment av så få som 2000 dissosiert sfæroide celler i immunmangelfull mus tillates full gjentagelse av den opprinnelige tumor, mens 10
5 modertumorceller forble ikke-tumorigen. De sfæroide Cellene ble funnet å være anriket for celler med kreftstamcellelignende egenskaper som oppregulering av stamcelle-gener, selvfornyelse, høy proliferativ og differensiering potensial og høy aldehyddehydrogenase (ALDH) aktivitet. Videre sfæroide celler var mer aggressive i vekst, migrasjon, invasjon, scratch utvinning, klonogene overlevelse, forankringsuavhengig vekst, og mer motstandsdyktig mot kjemoterapi
in vitro
.
13C-glukose metabolske studier viste at sfæroide celler ruten glukose hovedsakelig til anaerob glykolyse og pentose sykle til skade for omdirigering glukose for anabole formål. Disse metabolske egenskaper av kuledannende celler ser ut til å gi økt resistens mot apoptose og bidra til mer aggressiv tumorvekst. Kollektivt, viste vi at sfæroide celler med kreftstamcellelignende egenskaper bidratt til tumor generasjon, progresjon og kjemoterapi motstand. Denne studien gir innsikt i forholdet mellom tumor spredning og metabolske egenskaper av humane kreftstamceller og har kliniske implikasjoner for kreftbehandling
Citation. Liao J, Qian F, Tchabo N, Mhawech-Fauceglia P, Beck A , Qian Z, et al. (2014) Eggstokkreft spheroid Celler med stamcelle-lignende egenskaper Bidra til Tumor Generation, metastaser og kjemoterapi Resistance gjennom Hypoksi-Resistant Metabolism. PLoS ONE 9 (1): e84941. doi: 10,1371 /journal.pone.0084941
Redaktør: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, USA
mottatt: 10 september 2013; Godkjent: 29 november 2013; Publisert: 07.01.2014
Copyright: © 2014 Liao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Cancer Research Institute Eggstokkreft Working Group Grant, Cancer Vaccine Collaborative Grant of Cancer Research Institute og Ludwig Institute for Cancer Research, Anna-Maria Kellen Clinical Investigator Award of Cancer Research Institute (til KO), Roswell Park Cancer Institute Alliance Foundation, NIH P30 CA016056; NIH R01CA158318-01A1 og RPCI-UPCI Eggstokkreft SPORE P50CA159981-01A1. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer (EOC) er den ledende dødsårsaken fra gynekologiske kreftformer. Det er mer enn 23.000 tilfeller årlig i USA, og 14.000 kvinner kan forventes å dø av sykdommen [1]. Til tross for beskjedne forbedringer i responsrate, progresjonsfri og median overlevelse ved bruk av adjuvant platina og taxan kjemoterapi etter cytoreduserende kirurgi, generelle overlevelse for pasienter med avansert EOC og eggstokkreft-lignende maligniteter (primær peritoneal) forbli skuff [2]. Dette har blitt tilskrevet flere grunner. Først, i motsetning til de fleste andre faste tumorer, mer enn 75% av EOC at pasienten har avansert stadium sykdom (FIGO III eller IV). For det andre, selv om de fleste pasientene ved svare på platina og paclitaxel kjemoterapi inkludert fullstendige svar, er tilbakefallsrate ca. 85%. Innen 2 år cytoreduserende kirurgi og systemisk kjemoterapi, svulster vanligvis gjenta seg, og når tilbakefall skjer, er vanskelig kurativ behandling. Derfor er det viktig å forstå mekanismen (e) av EOC metastase og kjemoterapi motstand for å bedre kliniske resultater i denne sykdommen.
primære modusen for fjernmetastaser i EOC omfatter avgivelse av celler fra den primære tumor, inn i bukhulen, etterfulgt av implantering på mesothelial slimhinnen i peritoneum [3], [4]. For tiden er det data for å demonstrere at «sfære forming celler» eller «kuler» vanligvis finnes i ascites og er i stand til tumorigenesis
in vivo
, har en redusert respons på cellegifter
in vitro,
og kan spille en viktig rolle i metastatisk sykdom [5] – [9]. Fordi metabolske endringer kan gi en fordel på evnen av kreftceller til å overleve, spre seg, og invadere [10] – [12], hypotese vi at kuledannende celler sannsynligvis vil utvise metabolske egenskaper som fremmer deres evne til å overleve og metastasere. I foreliggende studie, ble generert vi sfæroide celler fra EOC cellelinjer og fra pasienter med primær eggstokkreft. Vår
in vivo Hotell og
in vitro
biologiske studier antydet at disse sfære forming celler er anriket i kreft stilk-lignende celler (CSCL) som kritisk bidrar til eggstokkreft tumorigenesis, metastaser og kjemoterapi motstand. Vi utnyttet isotop-basert dynamisk metabolsk profilering [13], [14], for å vurdere samtidig underlaget fluks innenfor og mellom store metabolske veier av makromolekyl syntese og energiproduksjon under ulike fysiologiske forhold. Vi fant ut at sfæroide celler øker anaerob glykolyse og pentosefosfateveien syklusen og redusere re-ruting av glukose for anabole formål. Denne studien gir innsikt i forholdet mellom tumor spredning og metabolske egenskaper i ovarier CSCL celler, og har kliniske implikasjoner for kreftbehandling.
Materialer og metoder
Isolering av tumorceller fra menneske Eggstokkreft
vevsprøver og ascitesvæske ble innhentet fra pasienter som gjennomgår svulst debulking kirurgi for ovarialcancer (EOC) ved Roswell Park Cancer Institute (RPCI), Buffalo, NY. Alle prøvene ble samlet under en godkjent protokoll CIC 02-15 fra Institutional Review Board på RPCI, og informert skriftlig samtykke ble innhentet fra hver pasient. Tumorceller fra ascites ble oppnådd fra sentrifugert cellepelleter av ascitesvæske. Pelletene ble vasket to ganger i PBS, plassert på gradienter Ficoll-Hypaque tetthet og sentrifugeres på nytt for å høste tumorceller. For å få kreftceller fra solid svulstvev, ble vevsprøver fint hakket i cellekulturmedium og enkeltcellesuspensjoner ble vasket to ganger i PBS etterfulgt av Ficoll-Hypaque rensing.
Cell Culture
Primær EOC cellelinjer ble etablert fra fast tumor og ascites ved å dyrke celler i 13 forskjellige betingelser [15], [16] fra 30 EOC pasienter over en periode på 2 år. Spheroid celler ble samlet inn nye EOC cellelinjer og fra en etablert eggstokkreft cellelinje, OV2774, som ble hentet fra Sloan Kettering Institute, New York, New York (courtesy of Lloyd J. Old, Ludwig Institute for Cancer Research, NY), ved den metode som er beskrevet [17] med modifikasjoner ved resuspendering 8 x 10
4 celler med serumfritt DMEM /F12 supplert med 10 ng /ml humant rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF; Invitrogen), 10 ng /ml basisk fibroblastvekstfaktor faktor (bFGF, Invitrogen), og N2 supplement-A (Stemcell Technologies Inc) i Ultra Low Vedlegg 6-brønners plater (Corning) og påfølgende organisasjon til sfærer
in vivo
xenograft eksperimenter.
Alle dyrestudier følges protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité RPCI. Dissosiert sfæroide eller modertumorceller ble tellet, resuspendert i 50 pl 1:01 RPMI /Matrigel (BD Biosciences) og injisert subkutant (sc) inn i høyre ben av 3 til 4 ukers gamle hunn SCID-mus (CB-igh -1blcrTac-Prkdcscid /Ros) levert av RPCI Animal Facility (stammer fra Taconic Farms, Hudson, New York). Innpodet mus ble inspisert to ganger i uken for svulst utseende ved visuell observasjon og palpasjon, og kreft latenstid ble bestemt. Mus ble avlivet ved cervikal dislokasjon ved en tumor diameter på 1 cm, eller i 6 måneder etter transplantasjonen. Xenografttumorer ble resected, fiksert i 10% nøytral bufret formalin, og i parafin for seksjonering (5 mm) på en rotasjonsmikrotom, etterfulgt av lysbilde montering, H E flekker, og histologisk vurdering av en patolog for tumortype, klasse , og scenen. For å bestemme xenograft gjentagelse av foreldrenes svulst fenotype, ble den samme prosessen utføres på humane tumorer. For å evaluere dannelse av ovarietumorer i sitt opprinnelige miljø, ble SCID-mus injisert intraperitoneal (ip) med ulike mengder av sfæroide-avledet celler eller sine foreldre svulster, overvåket annenhver uke for vektendring og ascites formasjon, og avlives ved overdreven abdominal oppblåsthet eller håndgripelig svulst vekst.
Stem Cell Marker Gene Expression Profilering
Signosis human stamcelle markør cDNA plate utvalg ble brukt for å undersøke stamcelle relatert genuttrykk på sfæroide celler og stamceller i henhold til produsentens protokoll. I korthet total RNA isolert fra celler ved Tri Reagent (Molecular Research Center, Inc.) ble reverstranskribert inn i cDNA, som ble hybridisert med gen-spesifikk oligonukleotid pre-belagt i individuelle brønner. Uttrykket nivå av gener ble oppdaget av kjemiluminescerende signaler av en plateleser.
Kvantitativ PCR
Total RNA ble avkrevet fra sfæroide eller ikke-sfæroide celler ved hjelp av Qiagen sin RNeasy Mini Kit per produksjon prosedyre og revers transkribert til cDNA ved iScript cDNA Synthesis Kit fra Bio-Rad. Kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp av Bio-Rad iQ SYBR Grønn Supermix per selskapets protokoller i et iCycler iQ system også fra Bio-Rad. Real-time PCR primersekvenser er vist i tabell 1. Termisk sykling ble utført ved en innledende denaturering trinn ved 95 ° C i 3 minutter etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 10 sekunder, deretter 60 ° C i 1 min for gløding og datainnsamling. Smelt-kurve analyse ble utført umiddelbart etter amplifikasjonsprotokoll under følgende forhold: 80 sykluser på 0,5 ° C intervaller (10 sek hver) som starter på 57,5 ° C (datainnsamling trinn). Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer, med normalisering til ribosomalt protein L4 (RPL4) genet som en intern kontroll, og target genekspresjon nivået ble beregnet ved ΔΔC
t-metoden ved bruk av Bio-Rad største iQ5 kvantitativ PCR-analyse-programvare.
ALDH aktivitet Analyse
ALDEFLUOR kit (StemCell Technologies, Vacouver, Canada) bruker en fluorescerende substrat som akkumuleres i cellene etter oksideres av ALDH enzymet. Celler i en konsentrasjon på 2 x 10
5 /ml ble farget med 5 pl ALDEFLUOR reagens ved 37 ° C i 45 min. I hvert forsøk ble en prøve av celler beiset under identiske betingelser med spesifikk ALDH inhibitor diethylaminobenzaldehyde (DEAB) som negativ kontroll for å sette opp flowcytometri gate. Den BioVision ALDH Activity Assay kit (BioVision) kvantifiserer ALDH enzymatisk aktivitet ved absorbans lesing på 450 nm. Acetaldehyd oksyderes av ALDH generering av NADH, som deretter reduserer en fargeløs sonde til et farget produkt. Sfæroide celler eller parentale celler (1 x 10
6) ble lysert med 200 ul ALDH målingsbuffer og 10 ul av cellelysatet ble anvendt for analysen. OD450s ble lest på 10 min og 1 time intervaller og ALDH aktiviteter ble beregnet i henhold til produsentens protokoll. Alle testene ble utført i duplikat.
Proliferation Assay
Foreldre og sfæroide EOC celler ble dyrket i komplett medium (CM, 10% FBS + RPMI) eller usupplerte RPMI i 24 timer. Da de samme mengder av celler ble sådd i vevskulturplate med CM, halvparten av mediet ble skiftet hver 3. dag, og cellevekst ble detektert ved CellTiter-Glo Luminescent celleviabilitet-analysen som beskrevet [18] (Promega Corp.). De spredning analysene ble utført i tre eksemplarer.
Migrasjon analysen
Foreldre og sfæroide EOC celler ble behandlet med usupplerte RPMI i 24 timer. I et transwell plate, 2 x 10
5 /brønn cellene ble satt inn i innsatsen med 0,2% BSA-RPMI-medium, har kammeret ingen celler bortsett fra RPMI-medium med 2,5% FBS. Etter dyrking i 1, 2, og 3 dager, antall celler som passerte gjennom membranen samt celler falle inn i kammeret ble beregnet under mikroskop etter 10% formaldehydfiksering i 20 minutter, etterfulgt av 0,1% krystall blåfarging i ytterligere 20 min begge ved romtemperatur (RT). Alle testene ble utført i duplikat.
Wound Healing (Scratch) Analyse
Foreldre og sfæroide EOC celler ble dyrket i CM i 24 timer. Da celler ble sådd inn i 6-brønns plater til 80-90% konfluens, og cellemonolaget ble skrapet i en rett linje med en 200 ul pipette for å lage en «scratch». Avfallet ble fjernet med PBS og deretter kultur ble på nytt tilført friskt medium. Bilder ble tatt ved 0 og 24 timer etter at grunnen for å beregne cellemigrering hastighet.
invasjon Assay
sperre og sfæroide EOC-celler ble behandlet med RPMI eneste medium i 24 timer. I et transwell plate, ble 40000 /brønn celler satt inn i innsatsen som er belagt med matrigel i 0,2% BSA-RPMI-medium, har kammeret ingen celler bortsett fra RPMI-medium med 5% FBS. Etter dyrking i 1, 2, og 3 dager, ble innsatser oppsamlet og overflaten av membranene ble renset, celler i matrigel ble fiksert med 10% formaldehyd i 20 minutter romtemperatur og antallet av celler som invaderte inn i matrigel ble bestemt etter farging med 0,1 % krystallblå 20 min RT. Alle forsøk ble utført i duplikat.
forankrings-uavhengig vekst Assay
Fem hundre celler ble sådd ut i triplikat i 6-brønners plater inneholdende et øvre lag av 0,3% myk agar og 0,5% agar base i DMEM, 10% FBS. Tjuefire timer senere, ble det gjennomsnittlige antall celler sådd i hvert felt bestemmes ved å telle celler i 5 forskjellige områder under lysmikroskop. Kolonier dannet ( 0,1 mm i diameter) etter 3 uker med vekst i myk agar ble talt; 10 forskjellige felt ble kvantifisert per brønn og gjennomsnittlig antall kolonier pr feltet beregnes. AIG (forankrings-uavhengig vekst) Indeksen ble uttrykt i forhold til det antall celler sådd.
Chemotherapy motstands Assay
sfærer ble dissosiert ved trypsinering og pipettering, og cellene ble sådd ut ved 5000 celler per brønn (96-brønners plater; Corning) i 200 ul CM medium. Alle celler ble behandlet i 24 timer med på 0 til 6 mikrogram /ml cisplatin (BD Biosciences) eller fra 0 til 18 pg /ml paclitaxel (Sigma; n = 5 pr medikament dose). Relative celletall ble bestemt av CellTiter-Glo Lysende celleviabilitet analyse [18]. Dose-respons-eksperimenter ble utført i duplikat. Prosentvis celleoverlevelse er uttrykt i forhold til ubehandlet kontroll. Sfæroide legemiddel celle Cytotoksisiteten ble sammenlignet etter 48-timers behandling med cisplatin (4 ug /ml). Etter medikamentell behandling, ble cellene inkubert i 8 dager i stoffrie CM mellomstore og cellekolonier ble undersøkt under mikroskop.
klonogene Survival Analyse
Celler ble behandlet med ulike mengder av Cisplatin i 24 timer . Etter fjerning av medikamentet, ble cellene vasket med PBS, høstet og 300 overlevende celler /brønn ble på ny tilført CM medium i 6-brønns plate. 10-14 dager senere, kolonier ble farget med 0,1% krystallfiolett og telles.
Immunohistochemistry
vevsprøver ble fiksert med formalin og innstøpt i parafin. Seksjoner (5 um) ble plassert på objektglass, oppvarmet ved 60 ° C i 20 min, og deretter deparaffinized med xylen og etanol. For antigen gjenfinning, ble vevsprøver montert på objektglass nedsenket i forvarmet antigen henting løsning (DAKO høy pH løsning; DAKO, Carpinteria, CA) i 20 minutter og fikk avkjøles i 20 minutter ved romtemperatur. Etter inaktivering av endogen peroksidase, renset spesifikt monoklonalt antistoff CA125 (Ov 185:1, Novocastra) (1:200 fortynning) og CK7 (Dako) (1:20 fortynning eller 75 ug /ml) ble deretter tilsatt, og inkubert over natten ved 4 ° C. Det primære antistoff ble påvist med et biotinylert anti-muse IgG (DAKO). Diaminobenzidintetrahydroklorid ble deretter tilsatt for utvikling i 10 minutter, etterfulgt av kontra med hematoksylin oppløsning.
Biokjemiske analyser
Anvendelse av [U-
13C
6] glukose tracer i kombinert med massespektrometri tillater evaluering av metabolsk fluks gjennom hovedveier som letter energiproduksjon og biosyntetisk metabolisme av cellen. Normale eggstokkreft celler (RPNLOv78) ble vennlig levert av Dr. T Pejovic [19]. Cellene ble dyrket i 01:01 blanding av RPMI og DMEM (glukose-fri) + 10% FBS 10 ug /ml Insulin 10 ng /ml EGF + 0,1% Gentamicin + [U-
13C
6] glukose (180 mg /ml). Mors celler (RP-OV17534) ble dyrket i RPMI (glukose-fri) + 10% FBS + [U-
13C
6] glukose (180 mg /ml). RP-OV17534 sfæroide-celler ble dyrket i DMEM /F12 (glukose-fri) + N2 Supplement-A + EGF 10 ng /ml + bFGF 10 ng /ml + [U-
13C
6] glukose (180 mg /ml). Etter 24 timer med inkubering ble cellene sentrifugert (1500 rpm i 5 minutter) og inkubasjonsmediet og cellepelleter ble oppnådd. Glukose og laktat inkubasjonsmediet Konsentrasjoner ble bestemt som tidligere beskrevet [20]. Laktat fra cellekulturmediene ble ekstrahert med etylacetat etter surgjøring med HCl. Laktat ble avledet av sin propylamid-heptafluorobutyric form og
m /z
330 og 331 (karboner 2-3 av laktat, kjemisk ionisering) ble overvåket for påvisning av
m2 plakater (
13C dobbeltmerket laktat) og
m3 plakater (trippel-merket laktat) for estimering av pentose syklus aktivitet versus anaerob glykolyse [21]. Glutamat ble separert fra mediumet ved hjelp av ionebytter-kromatografi [22]. Glutamat ble omdannet til
n
-trifluoroacetyl-
n
butyl derivat og ion klynger
m /z
198 (karboner 2-5 av glutamat, elektron innvirkning ionisering ) ble overvåket.
13CO
2 meldingen ble målt med en Finnegan Delta-S ion forholdet massespektroskopi, og ble brukt til å beregne glukose karbon utnyttelse gjennom oksidasjon av cellelinjer [23]. Masse spektrale analyser ble utført av tre frittstående injeksjoner av sampler og akseptert bare hvis standard sample avviket var. 1% av normalisert peak intensitet
Data Analysis og statistiske metoder
statistiske analyser ble gjort ved hjelp av parametrisk uparet, tosidige uavhengig prøve
t
test med 99% konfidensintervall.
Resultater
Generering av spheroid Celler fra Primær Eggstokkreft Prøver og etablerte EOC cellelinjer
Stabile cellelinjer ble etablert med suksess fra 3 av 30 (10%) kulturer initiert fra primær EOC eksemplarer over en periode på 2 år. RP-OV15526 ble avledet fra solid svulst mens RP-OV17534 og RP-OV313777 ble avledet fra EOC ascites. Disse cellene har blitt dyrket
in vitro
for 465, 312, og 125 dager med 68, 65 og 17 passasjer, henholdsvis. Alle linjer var fra sent stadium (IIIC eller IV) eggstokkene serøs adenokarsinom kreftpasienter. Konfluent monolag av primære humane celler EOC avbildet typisk epitelial brostein morfologi med 3-dimensjonal vokser oppover i celle-kondenserte områder (Fig. 1A). Undersøkelse av epiteliale markører CK-7 og CA-125 ytterligere bekreftet den epiteliale naturen til disse primære cellelinjer (Fig. 1C). For å generere sfæroide celler, ble eggstokk-kreft cellelinje OV2774 eller primære EOC celler enzymatisk dissosiert og inokulert på ultralave feste kulturplater i serumfritt medium med EGF, bFGF, og N2-supplement-A. I denne kulturen tilstanden noen celler døde av serum sult, mens andre ble tvunget inn i suspensjon og dannet aggregater. Tre uker etter pletter enkelte aggregater komprimeres til sfærer som ikke kan bli dissosiert ved pipettering. Noen av kulene også aggregert for å danne sfære klynger. Flytende kuler og klynger ble dissosiert ved pipettering, og replated to ganger i uken, med de resulterende cellene genererer sekundære sfærer, fremstår som tydelige prototypiske kuler (fig. 1B, 1E), tilsvarende de som finnes i pasient ascites [5], [6] . Ved hjelp av denne tilnærmingen, fikk vi bærekraftige kuler fra etablert cellelinje OV2774 (fig. 1D og 1E) og primær EOC celler RP-OV17534 (fig. 1A og 1B) under stilk-selektive betingelser. Vi har dyrket den OV2774 og RP-OV17534 celler som sfæroider i 6 måneder, som viser selv-fornyende evne til sfæroide cellene.
(A) Tre primære cellelinjer generert fra EOC pasienter viser epitelceller morfologi. (B) En av primær EOC cellelinje generert 3-D uavhengige, selvfornyende sfæroide cellene under stamcelle utvalg medier. (C) Primære cellelinjer som uttrykker ovarialcancer markør CA-125 og epitelial da CK-7, slik som vist ved IHC for RP-OV17534. (D) EOC-cellelinje OV2774 er i stand til å generere OV2774 sfæroide-celler (E). Alle skala bar enhet i dette tallet og følgende tall er i mikrometer.
spheroid Cells tumorigenicity og metastaser i Immune-mangelfull mus
Neste, vi undersøkt tumorigenitet av sfæren dannende celler . Vi undersøkte hvorvidt eksponentielt mindre tall (sammenlignet med foreldrecancerceller) var i stand til tumorgenese, som tidligere vist for andre epiteliale kreft initiere celler (CIC) [24] – [28]. Sfæroide celler eller tilsvarende foreldre bulk-tumorceller ble injisert s.c. inn i høyre ben av SCID-mus. Med injeksjoner av bare 2000 celler per mus, sfæroide cellene tumorigent i 4 av 4 SCID mus for RP-OV17534 sfæroide celler og 2 av 2 for OV2774 sfæroide celler, noe som gjenspeiles ved palpable svulster på injeksjonsstedet (figur 2A. Tabell 2 ). Median tumor-tidsforsinkelse i denne gruppen var 31 til 90 dager for RP-OV17534 sfæroide og 50 til 57 for OV2774 sfæroide, lik eller mindre enn CIC fra andre ondartede sykdommer [24] – [27]. Tilsvarende injeksjoner av 5000 og 10000 RP-OV17534 sfæroide celler ble også tumorigen i tre på tre mus med kortere tumor latenstid (figur 2A;. Tabell 2). Uten ikke-klebende sfæroide markering, bulktumorceller ikke klarte å danne svulster selv på 40.000 celler for RP-OV17534 innpoding (tabell 2). Alle subkutane xenografttumorer avledet fra sfæroide celler ble kategorisert som serøse adenokarsinomer av moderat /dårlig differensiering (grad 2 /grad 3), i likhet med foreldre primære pasient tumorer (H E farget seksjoner; Fig. 2C). Det ble ikke observert arkitektoniske /cytologic forskjeller mellom primær- og pode svulster.
(A) forskjellig mengde sfæroide celler subkutant injisert i SCID-mus dannet tumorer. (B) spheroid celler i.p. injisert i SCID-mus som dannes blodige ascites og tumorer i forskjellige organer som vist ved pilene. (C) Representant H E flekker seksjoner (øvre panel) viser RP-OV17534 primærtumor, subkutan pode svulst fra kulene, intraperitoneal pode svulst fra kulene, og serie intraperitoneal pode svulst fra SCID-mus ascites. Histologisk analyse (nedre panel) viser hyppig metastase av kreftceller i ulike organer sfæroide celler mottakere.
En viktig begrensning av studier av CIC er engraftment til ikke-innfødte microenvironments [29], [30]. For å fastslå at CIC trofast rekapitulere de veletablerte progresjon av eggstokkreft i sin opprinnelige innstilling, ble forsøkene utført med intra-peritoneal (i.p.) injeksjoner. Den i.p. injeksjon av bare 10.000 celler per mus av RP-OV17534 sfæroide celler resulterte i utvikling av blodige ascites i 4 av 4-SCID-mus (Fig 2B;. tabell 2), med tumor latenstid på 75 til 84 dager, tilsvarende eller mindre enn CIC av andre kreftformer [17]. Tilsvarende, i.p. injeksjoner av 20.000 og 40.000 sfæroide celler ble også tumorigen i tre på tre mus med kortere tumorventetider (tabell 2). Uten ikke-klebende sfæroide markering, bulktumorceller ikke klarte å danne blodige ascites og tumorer, selv ved 80000 celler per injeksjon, mens en av ett og tre av 3 mus i.p. injisert med henholdsvis 1,7 x 10
7 og 2 x 10
7 paren primære EOC-celler ble tumorigen, men med forlenget latenstid (92-105 dager, tabell 2). I.p. injeksjon av kule-dannende celler resulterte i utvikling av blodige ascites og peritoneal metastasering til omentum, lever, tykktarm, mage, og nyre (Fig. 2B), og intraperitoneal tumorhistologi lik både subkutan xenograft og primære pasient tumorer (fig. 2C ). I samsvar med resultatene for RP-OV17534, vi også observert høyere tumorigenicity av OV2774 sfæroide celler i forhold til sine foreldre celler, i lignende i.p. engraftment dyreforsøk bruker OV2774 avledet celler (tabell 2).
Et annet viktig kriterium for CIC er deres evne til å serielt forplante svulster i fortløpende innpodet dyr [31]. For å undersøke dette definitive stemness karakteristisk, engraftments serie av xenotransplantater ble utført. 2 x 10
4 av sfæroide celler i.p. injisert i SCID-mus og ascites var som forventet i 3 av tre mus i ca 60 dager. Transplantasjon av 8 x 10
4, 1 x 10
5, og 5 x 10
5 slike ascites celler i SCID-mus resulterte i ascites og tumorer, med en ventetid betydelig kortere enn foreldre pasientens tumorceller ( henholdsvis 66/63/49 dager for passering 2 xenografter versus ingen svulst utvikling for foreldre tumorceller av 8 × 10
4 transplantasjon i 0 av 3 SCID mus). Patologi i omental massen var lik den i s.c. tumorer (Fig. 2C). Disse resultatene indikerer at kule-dannende celler er tumorigen mer enn foreldretumorceller, noe som viser at en svært tumorigen subpopulasjon av celler som er tilstede innenfor de kule-dannende celler, og kan ligge innenfor eggstokkene neoplasmer. Siden RP-OV17534 sfæroide celler og OV2774 sfæroide celler viste tilsvarende egenskaper, er følgende resultater vist for RP-OV17534 avledet celler med tilsvarende observasjoner for OV2774 celler.
Ovarian tumor Sphere dannende celler uttrykker Stem Cell Gener
for å undersøke uttrykket av genet spesifikke embryonale stamceller, ble total RNA fra sfæroide celler og stamceller analysert av en menneskelig Stem Cell Marker cDNA Plate Array. Blant 32 gener testet, sfæroide celler oppregulert Notch1, Nanog, Cdcp1, CD34, og Myc uttrykk (Fig. 3A). Hver av disse genene er avgjørende for utviklingsmessige prosesser (embryogenese, nevrogenesen, stamcelle ekspansjon, og hematopoese [32] – [34]). Disse resultatene ble bekreftet ved kvantitativ sanntids-PCR-data. Uttrykket nivåer av Notch1, Nanog, Cdcp1, CD34, og Myc i sfæroide celler var tilnærmet 10 til 2000 ganger høyere enn den til ikke-sfæroide celler som detekteres av sanntids-PCR (fig. 3B, rød bar). Når sfæroide celler ble dyrket i CM uten vekstfaktorer, en differensierende tilstand, flytende celler klebet og vokste inn i epitelceller. Neste vi sammenlignet de samme sett av genuttrykk nivå av real-time PCR i sfæroide celler, dyrking i enten stamcelle-selektiv eller differensierende vilkår i 14 dager. Ekspresjon av CD34 og Nanog var tilnærmet en fold av den av ikke-sfæroide celler, Cdcp1 og Myc redusert til 9 og 500 ganger i henholdsvis. Notch1 uttrykk nivå i sfæroide celler bodde på 12 ganger høyere enn for ikke-sfæroide cellene etter dyrking i CM i 14 dager (Fig. 3B, grønn bar). Stamcellefaktor reseptor CD117 (c-kit) er rapportert i tidligere studier på eggstokkreft tumor stamceller [17], [35]. Derfor undersøkte vi CD117 uttrykk ved FACS i disse sfæroide celler. I samsvar med tidligere rapporter, vi også oppdaget CD117 oppregulering i sfæroide celler sammenlignet med moderceller. Ettersom et stort antall av sfæroide celler drept av cytostatika ble differensiert ikke-stamceller, mens stilk-lignende celler som overlevde (se nedenfor), har vi funnet at CD117 ekspresjon ytterligere øket i sfæroide celler etter cisplatinbehandling i 24 timer (fig. 3C) . Disse data indikerer at sfæroide celler fra ovarie cancer som overuttrykker stamcelle-genene i henhold til stamcelle-selektive betingelser og mister eller redusere disse genekspresjon i henhold til differensierings betingelser.
(A) Total RNA isolert fra sfæroide celler og stamceller ble undersøkt for deres genuttrykk av et menneske stamcellemarkører cDNA utvalg og stamcelle-gener viste høyere uttrykk nivåer i sfæroide celler til ikke-sfæroide celler. (B) overekspresjon nivåer av Notch1, Nanog, Cdcp1, CD34, og Myc i sfæroide celler sammenlignet med ikke-sfæroide celler ble bekreftet av kvantitativ real-time PCR. Disse stamcelle-genenes ekspresjon ble mistet eller nedregulert når sfæroide cellene ble differensiert ved dyrking i CM uten vekstfaktorer i 14 dager. Ekspresjonsnivåer er representert som brette endringer i forhold til disse av ikke-sfæroide celler. (C) FACS undersøkelse av CD117 uttrykk på sfæroide celler og stamceller viser høy CD117 uttrykk i sfæroide celler. Noen sfæroide celler ble behandlet med cisplatin i 24 timer før den planlagte overflaten flekker av CD117 Abs. Feilfelt: SD, N = 3. *: p. 0,05
Økt ALDH Aktiviteten i spheroid Cells
ALDH spiller en viktig rolle i mobilnettet avgiftning. Nyere studier viser at økt ALDH aktivitet fører til flere typer kreftformer, fungerer som en kreftstamcelle markør og korrelert med dårlig prognose [36] – [39]. Vår ALDEFLUOR analyse viste mer ALDH
+ -celler i sfæroide-celler i fravær av ALDH inhibitor DEAB (Fig. 4A). Den økte ALDH-funksjonen i sfæroide-celler ble bekreftet ved en ALDH-aktivitet kolorimetrisk analyse, viser betydelig forbedret aktivitet i sfæroide celler (Fig. 4B).
(A) ALDEFLOUR kit etiketter befolkningen med en høy ALDH enzymatisk aktivitet i sfæroide celler. En alikvot av hver prøve av celler ble behandlet med ALDH inhibitor DEAB som negativ kontroll for innstilling FACS gate. (B) Den BioVision ALDH kolo analysen oppdaget forbedret ALDH aktivitet i spheroid cellelysat. Feilfelt: SD, N = 2. *: p. 0,05
spheroid Cells har høy spredning og migrasjon potensial enn sine foreldre Cells
Forholdet mellom spheroid dannelse og cellevekst potensiale ble undersøkt i en kinetisk undersøkelse celleproliferasjon. Forsøkene ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. Fig.
