Abstract
I et forsøk på å omgå motstand mot rapamycin – en mTOR-hemmer – vi søkte etter nye rapamycin-nedstrøms-mål som kan være sentrale aktører i respons på kreftceller til terapi. Vi fant at rapamycin, ved nM konsentrasjoner, økt fosforylering av eukaryotisk initiering faktor (EIF) 2α i rapamycin-sensitive og østrogenavhengige MCF-7-celler, men hadde bare en minimal effekt på eIF2α fosforylering i rapamycin-insensitive trippel-negativ MDA -MB-231 celler. Tilsetning av salubrinal – en inhibitor av eIF2α defosforylering – redusert ekspresjon av en overflatemarkør assosiert med evne til selvfornyelse, økt begynnende alderdom og indusert klonogene celledød, noe som antyder at overdreven fosforylering av eIF2α er skadelig for cellenes overlevelse. Behandling av celler med salubrinal forbedret stråling-indusert økning i eIF2α fosforylering og klonogene død og viste at bestrålte celler er mer følsomme for økt eIF2α fosforylering enn ikke-bestrålte seg. I likhet med salubrinal – den phosphomimetic eIF2α variant – S51D – økt følsomhet for stråling, og begge opphevet stråling-indusert økning i brystkreft type 1 mottakelighet genet, og dermed impliserer økt fosforylering av eIF2α i modulering av DNA reparasjon. Faktisk salubrinal hemmet ikke-homolog ende begynte samt homolog rekombinasjon reparasjon av doble trådbrudd som ble indusert av I-SCEI i grønne fluorescerende protein reporter plasmider. I tillegg til dens effekt på strålingen, salubrinal forbedret eIF2α fosforylering og klonogene død i respons til histone deacetylase inhibitor – vorinostat. Til slutt, den katalytiske kompetitiv hemmer av mTOR – Ku-0063794 – økt fosforylering av eIF2α demonstrere ytterligere involvering av mTOR-aktivitet i moduler eIF2α fosforylering. Disse forsøk antyder at overdreven fosforylering av eIF2α minker overlevelse av kreftceller; gjør eIF2α et verdig mål for legemiddelutvikling, med potensial til å forbedre den cytotoksiske effekten av etablerte antineoplastiske terapier og omgå motstand mot rapalogues og eventuelt til andre legemidler som hemmer oppstrøms komponenter av mTOR pathway
Citation.: Tuval-Kochen L, Paglin S, Keshet G, Lerenthal Y, Nakar C, Golani T, et al. (2013) Eukaryote Initiation Factor 2α – en Nedstrøms Effector av mammalian target of Rapamycin – modulerer DNA Repair og kreft behandlingsrespons. PLoS ONE 8 (10): e77260. doi: 10,1371 /journal.pone.0077260
Redaktør: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, USA
mottatt: 29 april 2013; Godkjent: 30 august 2013; Publisert: 25 oktober 2013
Copyright: © 2013 Tuval-Kochen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskningen ble støttet av en generøs donasjon fra boet av Miss HARAN ESTER av velsignet minne gjennom Keren Izvonot, Israel, helsedepartementet (SP) og ved Medical Research Infrastructure Development Fund – Sheba Medical Center (YL). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
phosphatidylinositol 3-kinase – protein kinase B – mammalian target of rapamycin (PI3K-Akt-mTOR) pathway regulerer cellevekst og spredning. Dereguleringen av veien ligger til grunn for onkogene transformasjoner og dens modulering av antineoplastiske behandlinger påvirker deres utfall. MTOR er hemmere – rapamycin og dets derivater – redusere kreftcelle spredning og har blitt testet som anti-kreft agenter i kliniske studier [1-3]. Rapamycin er blitt brukt for belegning av stenter for å forhindre angiografisk-restenose [4], og har fått FDA-godkjenning som en immunosuppressant. Dets derivater – temsirolimous og everolimous er godkjent for behandling av forskjellige typer kreft [5,6]
Rapalogues binder deres intracellulære reseptor FK506-bindende protein 12 (FKBP12), som danner et kompleks som hemmer mTOR kompleks 1. (mTORC1) ved å binde mTOR er FKBP12 rapamycin-bindende domene [7]. Dessuten kan langvarig inkubasjon med rapalogues hemme dannelsen av mTOR kompleks 2 (mTORC2) [8]. Imidlertid er virkningen av rapalogues på mTORC1 og mTORC2 celletypespesifikk og kan avhenge av den relative overflod av molekyler som deltar i sammensetningen av mTORC sin makromolekylære komplekser [8,9]. Følgelig hemmende resultatet av rapalogues på tumorvekst er ikke universell [7].
Derfor, i rapamycin-sensitive kreftceller, ved å avgrense rapamycin nedstrøms Effektor som modulerer tumorvekst og respons til anti-neoplastisk behandling er egnet til å føre til oppdagelsen av nye forbindelser som vil hemme tumorvekst og /eller øke følsomheten til etablerte behandlingsformer. Slike molekyler er forventet å omgå motstand av kreftceller til narkotika som er rettet mot oppstrøms komponenter av PI3K-Akt-mTOR veien mens du har bare en delvis effekt på sin globale virksomhet.
I denne studien rapporterer vi at hemming av mTOR fører til økt fosforylering av eIF2α – en underenhet av eIF2. Hittil har kontrasterende rapporter blitt publisert om involvering av mTOR i eIF2α fosforylering [10-16]. Imidlertid viser foreliggende studien som i østrogenavhengige rapamycin-sensitive brystcancer MCF-7-celler, så vel som i trippel negative rapamycin-insensitive MDA-MB-231-celler, inhibering av mTOR av rapamycin og ved spesifikk katalytisk inhibitor (Ku-0063794 ) henholdsvis fører til økt fosforylering av eIF2α. Når bundet til GTP, rekrutterer eIF2 Møtte · tRNA
MET til ribosomet som deretter skanner avkortet mRNA. Etter anerkjennelse av initieringskodonet og GTP hydrolyse, den inaktive eIF2 · BNP frigjøres og gjenvinnes til en aktiv eIF2 · GTP kompleks via interaksjon med guanin nukleotid utveksling faktor eIF2B [17]. Under normale fysiologiske forhold, letter eIF2α interaksjonen av eIF2 med eIF2B [18]. Men fosforylering av eIF2α på sitt Ser
51 svinger eIF2 fra et substrat av eIF2B i sin kompetitiv hemmer, som fører til en reduksjon i nivået av eIF2 · GTP · Møtte · tRNA
MET kompleks og til demping av global protein oversettelse. Viktigere, fordi det cellulære nivået av eIF2 er i overkant av eIF2B, kan en svak økning i fosforylering eIF2α beslaglegge en hovedfraksjon av eIF2B [17]. I pattedyrceller eIF2α blir fosforylert av fire forskjellige kinaser som reagerer forskjellig på forskjellige spenningssignaler [17], og dens defosforylering er utført av den katalytiske subenhet av fosfo-proteinfosfatase 1 (PP1c) i kompleks med spesifikke regulatoriske subenheter f.eks det konstituerende repressor av eIF2α fosforylering (CREP) eller stress-indusert vekst arrest og DNA-skader induserbar protein (GADD34) [19]. Salubrinal – hemmer eIF2α defosforylering – forstyrrer foreningen av PP1c og dets regulatoriske subenheter, og dermed føre til økt eIF2α fosforylering. Sin søknad til ulike cellesystemer in vitro har vært ansatt for å belyse fysiologiske betydningen av økt eIF2α fosforylering til celle overlevelse [20,21].
Den molekylære utfall og fysiologiske betydningen av økt eIF2α fosforylering har blitt grundig studert under endoplasmatiske retikulum (ER) overbelastning hvor det er generelt antatt å utøve en beskyttende rolle. Som svar på økt ER belastning PKR-like ER-lokaliserte eIF2α kinase (PERK) er aktivert og en forbigående økning i eIF2α fosforylering følger [22]. Dette fører til en global demping av protein oversettelse som kan gå hånd i hånd med økt oversettelse av spesifikke mRNA som besitter en intern-ribosom-entry-site element [23] eller korte åpne leserammer i sin 5 «leder [17]. Den globale demping av protein oversettelse avtar ER belastning, mens spesifikke proteiner som oversettelse er økt aktivere transkripsjon av gener som modulerer cellulær respons på stress. Lindring av eIF2α fosforylering er nødvendig for å aktivere oversettelse av den nye transkriptomet [24]
Eksponering av mus embryonale fibroblaster (MEF) til anti-kreft agenter – for eksempel doxorubicin eller histondeacetylase hemmere – også ledet til økt fosforylering av eIF2α, om enn en vedvarende snarere enn en forbigående on [25,26]. I disse studiene modifiserte MEF som bærer de ikke-phosphorylatable eIF2α A /A-mutasjoner viste høyere følsomhet for medikamenter enn deres S /S vill-type motparter som fører til den konklusjon at den medikament-indusert økning i fosforylering eIF2α er beskyttende mot celledød. Men mens strengt regulert fosforylering av eIF2α kan være beskyttende, kan en overdreven og vedvarende eIF2α fosforylering være like skadelig som total oppheve. Faktisk har det blitt bemerket at mens tett regulert fosforylering av eIF2α er nødvendig for riktig embryoutvikling, en mangel på fosforylerte eIF2α signalering, på grunn av homozygositet for eIF2α A /A i tillegg til overdreven fosforylering som følge av en utstansing av CREP, en mutasjon som fører til hemming av eIF2α defosforylering, er forbundet med føtal anemi og vekstretardasjon [22]. Også mutasjon i PERK og hemming av eIF2α fosforylering resultat i beta-cellene død og Wolcott-Rallison syndrom, og tilsvarende overdreven eIF2α fosforylering i TSC muterte celler etter eksponering for ER stressor hemmer uttrykk for stress-indusert transkriptomet fører til celledød [24] .
Våre studier impliserer vedvarende og overdreven eIF2α fosforylering i hemming av DNA-reparasjon, utvikling av begynnende alderdom og redusert ekspresjon av en overflatemarkør assosiert med evne til selvfornyelse, for derved å tilveiebringe en begrunnelse for assosiasjon med økt følsomhet overfor anti- neoplastiske behandlinger som ioniserende stråling og histondeacetylase hemmere (HDACi). Våre resultater tyder på at utvikling av legemidler som øker eIF2α fosforylering kan gi ekstra midler for å øke følsomheten til etablerte antineoplastiske terapier og /eller omgå motstand mot narkotika som er rettet mot oppstrøms komponenter av PI3K-Akt-mTOR veien.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP
MCF-7 og MDA-MB-231 brystkreftcellelinjer, fra American Type Culture Collection (Manassas, VA), ble sådd ut i en tetthet på 4 · 10
3 per cm
2 og vedlikeholdes som beskrevet tidligere [27]. Celler ble bestrålt 48 timer etter plating i en Cs
137 irradiator (Gammacell 1000 Elite /3000 Elan) ved en dose på 475 cGy /minutt eller i røntgenstråle (Polaris sc-500 serie II) med en dose hastighet på 100 cGy /minutt. Rapamycin, Vorinostat (LC laboratorier, Boston, MA), Ku-0063794 (Selleck, Houston, Texas) og salubrinal (Calbiochem-Merck4Biosciences, Tyskland) ble lagt til kulturer fra stamløsninger i dimetylsulfoksid (DMSO). Kontrollkulturer mottok like mengder av kjøretøyet. DMSO-konsentrasjonen i mediet ikke overstige 0,08%. Legemidlene ble tilsatt til kulturen umiddelbart etter bestråling.
Colony overlevelse analyse
plating for kolonien overlevelse analyse, kolonitelling, og beregning av overlevende fraksjoner ble utført i tre paralleller som beskrevet tidligere [28]. Med mindre annet er angitt, ble kolonier fiksert, farget og tellet 8-10 dager etter plettering, når 90-95% av koloniene i styre har mer enn 50 celler. Den teoretiske additive effekten, av kombinerte anti-neoplastiske behandlinger, på celle-overlevelse ble beregnet i henhold til følgende formel: 100 x SFA x SfB (SFA = overlevende fraksjon av celler behandlet med midlet «a»; SfB = overlevende fraksjon av celler behandles med agenten «b»). En eksperimentelt bestemt overlevende fraksjon som er lavere enn den beregnede ene indikerer at de to midler har en forbedret heller enn en additiv hemmende virkning på celleoverlevelse. Den underliggende antagelse av denne ligningen er at midlene virker uavhengig av hverandre i den samme populasjonen. Den cellulære fraksjonen i prosent som ikke overlever behandling (IF)% er lik: [1-overlevende fraksjon] x100 og den teoretiske additive inhiberende effekt av midler A og B på størrelsen av drept cellefraksjon i prosent – (IFAB)% er lik [29]: 100 x [1- (1-Ia /100) x (1-Ib /100)] = 100 x (1-x SFA SFB).
Western blotting-analyse
Klargjøring av cellelysatene og analyse av behandlingsinduserte endringer i proteinnivå og fosforylering ble gjort som beskrevet tidligere [27] med mindre endring. Proteininnholdet ble bestemt med en bicinchoninic syre-reagens (Bio-Rad, Hercules, CA), og lik belastning ble bekreftet ved å måle absorbansen ved 520 nm av Ponceau S (Sigma, St-Louis, MO) ble ekstrahert med PBS fra individuelle strimler av en tvilling løp. Blottene ble utsatt for røntgenfilm for chemiluminescence etter behandling med West Pico ECL-reagens (Thermo Scientific Rockford, IL). Verdier for integrerte lys tetthet av autoradiogrammene ble oppnådd med bilde J NIH programvare og ble anvendt for bestemmelse av behandlings-induserte endringer i proteinnivåer, og i forholdet av fosforylert eIF2α (p-eIF2α) til det totale nivå av proteinet. Kaniner antistoffer som gjenkjenner enten p-eIF2α eller begge de fosforylerte og ikke-fosforylerte eIF2α var fra cellesignalisering Technologies (Boston, MA) og antistoffer mot BRCA1 (klone D9) og til CD2 var fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX)
Karakterisering av epitel spesifikt antigen (ESA) uttrykk ved FACS analyse
Kontroll og salubrinal behandlede celler ble frittliggende med ikke-enzymatisk celledissosiasjon løsning (Sigma, Israel), inkubert med humant serum og FcR blokkerende reagens og deretter med fluorescerende isotiocyanat (FITC) -anti-ESA eller med isotypekontroll (Miltenyi Biotec, Tyskland). 7-Aminoactinomycin D (7AAD, eBiosciences, San Diego, California) fungerte som levedyktighet fargestoff. Påvisning av cellefarging ble utført ved FACSCalibur hjelp Quest Software (BD Biosciences, San Jose, CA) som beskrevet av Keshet et al. for farging av overflate MDR1 [30].
Farging for surt β-Galacotosidase
Cell flekker kit fra Cell Signaling Technologies ble brukt til cellefarging og photomicrographs av fargede celler ble oppnådd med Nikon TS100 Eclipse invertert mikroskop og Nikon DS kamera.
Analyser for DNA-reparasjon
Ikke-homolog ende bli (NHEJ) reparasjon ble analysert i HeLa celler og homolog rekombinasjon reparasjon (HRR) ble analysert i U2OS celler stabilt transfektert med pEJSSA og PDR-GFP henholdsvis [31,32]. Den HeLa [33,34] celler var en gave fra Dr. Dahm-Daphi, Universitetet i Hamburg og U2OS var en gave fra Dr. Scully, Harvard Medical School [32,34]. Analysen ble utført hovedsakelig som beskrevet av Moyal et al. og Seluanov et al. [34,35], bortsett fra at celler ble behandlet med 4,5 uM salubrinal 6 timer før transfeksjon med plasmider som uttrykker I-SCEI (eller tom vektor i kontroller). For måling av NHEJ,-celler ble ko-transfektert med I-SCEI uttrykkende vektor og pDsRed2-N1 i et forhold på 10: 1. Transfeksjon ble utført med LT1 DNA transfeksjon reagens (Mirus Bio LLC.) I henhold til produsentens instruksjoner. Parallell, villtype GFP og DsRed uttrykker celler samt negative kontroller ble brukt for FACS kalibrering (justering spenning og fargekompensasjon). NHEJ aktivitet ble fulgt på den angitte tids etter transfeksjon med I-SCEI ved å overvåke GFP uttrykk i DsRed uttrykker celler. Deteksjon ble utført ved FACSCalibur på 50.000 hendelser per prøve. For bestemmelse av HR aktivitet brøkdel av I-SCEI avhengig GFP uttrykkende celler ble delt ved transfeksjonseffektiviteten i disse celler som beskrevet av Moyal et al. [34]. Under våre forsøksbetingelser virkningen av salubrinal på gjennomsnittlig fluorescensintensitet i GFP uttrykkende celler var alltid mindre enn 10%, noe som indikerer at den kjente effekten av salubrinal på DNA-reparasjon ikke er en følge av hemming av translasjon. Også, som vist i tabell S1 i File S1, salubrinal endret ikke det cellesyklusfordelingen av U2OS celler som indikerer at den inhiberende effekt av salubrinal på HRR aktivitet etter transfeksjon med I-SCEI resulterer fra direkte hemming av reparasjon og ikke fra en effekt på fraksjonen av celler i S-fasen.
Transfeksjon av celler med plasmider som koder for eIF2α varianter
heIF2α S51A og heIF2α S51D i pcDNA3.CD2 [36,37] var en gave fra Dr. Ron laboratorium New York, NY. Transient transfeksjon ble gjennomført med JetPei (Polyplus, New York, New York) i henhold til produsentens instruksjoner. Ved transfeksjon ble utført i 10 cm kulturskåler – 10 ug plasmider ble inkubert i 6 ml vekstmedium uten antibiotika i 24 timer før tilsetning av 4 ml medium, og fortsetter med den eksperimentelle protokollen. Ved transfeksjon ble utført i 6-brønners skåler, ble de angitte mengder av plasmider ble inkubert i 2 ml vekstmedium uten antibiotika i 24 timer før tilsetning av 0,5 ml medium, og fortsetter med den eksperimentelle protokollen. Uttrykk av reporter protein ble overvåket i Western blot med anti-CD2.
Statistisk analyse
Uparet Student
t
test eller en prøve
t
test etter logaritmisk transformasjon ble ansatt for statistisk analyse.
p
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultatene
Det har tidligere blitt vist at østrogenavhengige MCF-7 brystkreftceller er svært følsomme for rapamycin (IC
50 – ~ 10 nM). . I motsetning til dette trippel negative MDA-MB-231 er ufølsomme overfor medikamentet (IC
50 -5900 nM) [38] på grunn av forholdsvis høy grad av fosfatidinsyre som konkurrerer med rapalogues for binding til FRB domenet [9] . Våre resultater viser også at mens i MCF-7 celler rapamycin induserer klonogene død med en IC
50 av ~ 50 nM, i MDA-MB-231 celler konsentrasjoner opp til 2 mikrometer ikke signifikant påvirker celle overlevelse (tabell S2 i File S1).
eIF2α er en nedstrøms target of rapamycin og bestråling
På nM konsentrasjoner rapamycin ført til økt fosforylering av eIF2α som var mye mer uttalt i MCF-7 enn i MDA-MB-231 (figur 1 ab). Ioniserende stråling, på den annen side økte eIF2α fosforylering både i MCF-7 og MDA-MB-231 (Figur 2 a-c) celler. I MDA-MB-231 celler økt nivå av p-eIF2α samt økt forholdet mellom p-eIF2α å eIF2α ble opprettholdt gjennom 48 timer etter bestråling. I noen forsøk ble en reduksjon i det totale nivået av eIF2α i bestrålte celler ble bemerket, men denne forskjellen var ikke statistisk signifikant. I MCF-7-celler nivået av p-eIF2α så vel som av det totale nivå av eIF2α redusert i stor grad ved 48 timer etter bestrålingen, men den forhøyede forholdet mellom p-eIF2α til eIF2α oppnådd ved 24 timer etter bestråling ble opprettholdt.
a. Celler ble inkubert i 24 timer med 50 nM rapamycin, høstet og bearbeidet for bestemmelse av endringer i eIF2α fosforylering b. Gjennomsnitt ± SEM gangers forandring i forhold til kontroll av eIF2α (e), p-eIF2α (p), og forholdet mellom p-eIF2α /eIF2α (p /e) i rapamycin behandlede celler. Analysen viser 6 separate bestemmelser for MCF-7 celler og 3 for MDA-MB-231-celler. * Betegner vesentlig endring i forhold til kontroll –
p
0,05.
a. MCF-7 og b. MDA-MB-231-celler ble bestrålt med den indikerte stråledose og behandlet for analyse av eIF2α fosforylering ved den angitte tids post-bestråling. c. Middelverdi ± SEM av gangers forandring i forhold til kontroll av eIF2alpha (e), p-eIF2α (p), og forholdet mellom p-eIF2α /eIF2α (p /e) i bestrålte MCF-7 og MDA-MB-231-celler. Analyse for MCF-7 ved 24 timer etter bestråling med 1,5 og 9,5 Gy betegner 2 og 3 separate bestemmelser henholdsvis og etter 48 timer 3 separate bestemmelser for hver dose. Analyse for MDA-MB-231-celler ved 24 timer representerer 3 bestemmelser for hver dose, og etter 48 timer 5 bestemmelse for 1,5 Gy og 6 til 9,5 Gy. * Betegner vesentlig endring i forhold til kontroll –
p
0,05
Økt fosforylering av eIF2α er skadelig for celle overlevelse
For å bestemme relevansen av økt eIF2α fosforylering til celle overlevelse vi behandlet MDA-MB-231 celler med salubrinal -. En inhibitor av eIF2α defosforylering. Salubrinal førte til en doseavhengig økning av eIF2α fosforylering som var forbundet med øket klonogene død (figur 3 a, b, tabell 1). Kombinere behandling av salubrinal – i en konsentrasjon som ikke påvirker celle overlevelse (4,5 mm) – og stråling førte til økt fosforylering av eIF2α som ble assosiert med økt klonogene død (figur 3 c, d, Tabell 2, Tabell S3 i File S1) . Interessant, i celler som fikk kombinasjonsbehandling på 4,5 uM salubrinal og 1,5 Gy, fosforylering av eIF2α var lik den som ble oppnådd i celler behandlet med salubrinal alene, noe som antyder at bestrålte celler er mer utsatt for økt eIF2α fosforylering enn ikke-bestrålte celler. Forbedret følsomhet for stråling ble også bemerket i salubrinal behandlet MCF-7 celler (tabell S4 i File S1).
a. Cellene ble behandlet for analyse av eIF2α fosforylering 48 timer etter tilsetning av salubrinal (Sal). b. Gjennomsnitt ± SEM ganger endring i forhold til kontroll av eIF2α (e), p-eIF2α (p) og av forholdet p-eIF2α /eIF2α (p /e) i salubrinal (Sal) behandlede celler. Forsøket ble gjengitt 3 ganger i 4,5 mikrometer og to ganger for 16 mikrometer. * Betegner vesentlig endring i forhold til styre – P . 0,05
c. Celler ble bestrålt med den kjente stråledose før tilsetning av 4,5 pM Salubrinal (Sal). d. Gjennomsnittlig ganger endring i forhold til kontroll av eIF2α (e), p-eIF2α (p) og forholdet p eIF2α /eIF2α (p /e) sikret Forsøket ble gjengitt en gang med samme resultat (Verdier for e, p, og p /e fra begge forsøk er presentert i Tabell S3 i File S1).
Salubrinal (mm)
IF (%)
00 ± 0.64.50 ± 5938 ± 216.5100Table 1. Salubrinal induserer doseavhengig klonogene død.
MDA-MB-231 celler ble belagt og behandlet for klonogene analysen. Tall er IF (%) ± SEM av tredoble prøver. Effekten av salubrinal på celledød 9 og 16,5 mikrometer var signifikant (
p
0,05). CSV Last ned CSV Gy
-Sal IF (%)
+ Sal IF (%)
Beregnede Additive
00 ± 10 ± 313 ± 0.38 ± 2.631.517 ± 0,630 ± 1.6172.548 ± 166 ± 2.648Table 2. Salubrinal forbedrer klonogene celledød i bestrålte celler.
MDA-MB-231 celler ble sådd for klonogene overlevelse analyse. Salubrinal (Sal) (4,5 pM) ble tilsatt til cellene umiddelbart etter bestråling. Tall er midler IF (%) ± SEM av triplikate prøver fra et representativt eksperiment som ble gjengitt to ganger med samme resultat. Teoretisk additiv effekt av salubrinal og stråling på størrelsen av drept cellefraksjonen er presentert under «beregnet additiv «. Effekten av salubrinal på økt klonogene død innen 1,5 Gy og 2,5 Gy stråle gruppene var signifikant (
p
0,05). CSV Last ned CSV
I likhet med effekten av salubrinal, transient transfeksjon med phosphomimetic eIF2α S51D variant redusert – i et plasmid-doseavhengig måte – klonogene overlevelse i forhold til det som ble observert i celler transfektert med ikke-phosphorylatable S51A variant. Ved høye plasmid-konsentrasjoner (figur 4 a) overlevelse av celler som uttrykker phosphomimetic varianten var lavere enn den til celler som uttrykker ikke-phosphorylatable variant. Imidlertid ved en lavere konsentrasjon plasmid eIF2α S51D ikke påvirke overlevelsen i forhold til eIF2α S51A (figur 4 b), men førte til økt klonogene død i bestrålte celler (Figur 4 c, tabell 3). Under våre eksperimentelle forhold stråling-indusert økning i fosforylering av endogent eIF2α var lik i eIF2α S51A og eIF2α S51D uttrykker celler (figur S1), noe som indikerer at lik salubrinal den skadelige effekten forårsaket av uttrykk for eIF2α S51D resultater fra en økt cellenivå hemmet eIF2α dvs. eIF2α S51D og fosforylert endogent protein.
a. Celler transfektert med 2 mg /2 ml eIF2α S51A (SA) eller med eIF2α S51D (SD) ble behandlet for analyse 17 dager etter plating. Ved denne konsentrasjonen SD redusert klonogene overlevelses. b, c. Celler transfektert med 1.5μg /2 ml SA eller med SD. Celler i b ble ikke bestrålt, mens cellene i c ble bestrålt med 1,5 Gy 24 timer etter transfeksjon. Celler i b og c ble behandlet for analyse 10 dager etter bestråling. Ved denne konsentrasjonen SD i seg selv ikke påvirker klonogene overlevelses men gjorde øke følsomheten for stråling. Eksperimentet ble gjengitt en gang med lignende resultater.
SA IF (%)
SA + 1,5 Gy IF (%)
SD IF (%)
SD + 1,5 Gy IF (%)
0 ± 348 ± 0,50 ± 462 ± 1.5Table 3. phosphomimetic eIF2α variant øker klonogene død i bestrålte celler.
cellene ble transfektert med 1.5μg /2 ml eIF2α S51A eller eIF2α S51D. Bestråling med 1,5 Gy fant sted 24 timer senere. Kolonier ble behandlet for analyse 10 dager etter bestråling. Tall er midler IF (%) fra triplikatprøvene ± SEM. Eksperimentet ble gjengitt en gang med lignende resultater. Forskjeller mellom kontroll- og bestrålte grupper samt mellom de to gruppene av bestrålte varianter var betydelig
p
0,05. SA – ikke-phosphorylatable eIF2α, S51A, SD – phosphomimetic eIF2α S51D. CSV Last ned CSV
Salubrinal påvirker uttrykket av overflaten ESA
Det har blitt rapportert at tumorigene brystkreft stamceller er beriket med en sub-populasjon av celler som uttrykker CD
44 + /CD
24 – /lav /ESA
+ på deres overflate [39], og at en sub-populasjon som uttrykker et tilsvarende kombinasjon av celleoverflatemarkører blitt identifisert i brystkreftcellelinjer (for eksempel MDA-MB-231), og har vist seg å ha høy evne til selvfornyelse og startfasen [40]. Siden over 90% av MDA-MB-231-celler er CD
44 + /CD
24- /lav, sortering for celleoverflate ESA-ekspresjon i disse cellene kan tjene som en indikator for endringer i størrelsen av cellulær fraksjon med selvfornyelse kapasitet [40]. Som angitt i figur 5, å behandle cellene med salubrinal redusert ekspresjon av ESA på cellenes overflate, noe som antyder at den skadelige effekt av overdreven eIF2α fosforylering kan redusere deres evne til selvfornyelse.
Celler ble inkubert med 24 mikrometer salubrinal i 96 timer før høsting, ble Cell farging med FITC-anti-ESA eller med isotype-matchet kontroller oppdaget med FACSCalibur. Eksperimentet ble gjengitt to ganger med lignende resultater. 7AAD – levedyktighet fargestoff, FITC -. Anti-ESA
Salubrinal induserer senescence i brystkreftceller
Colonies av bestrålte og salubrinal behandlede celler inneholder forstørret og senescent jakt celler. Vi telles disse cellene i kolonier dannet etter eksponering for en Gy, til 4,5 uM salubrinal til en kombinasjon av stråling og salubrinal og i ubehandlede kontroller. Interessant, selv om kombinasjonsbehandling på 4,5 mikrometer salubrinal og en Gy ikke førte til økt klonogene død (tabell 2) det gjorde føre til forbedret utseende av senescent jakt celler (figur 6). Farging av sure β-Galacotosidase viste at disse store celler uttrykker enzymet indikerer at faktisk salubrinal forbedrer begynnende alderdom i bestrålte celler (figur 6).
Celler ble sådd for kolonien overlevelse analyse. Salubrinal (4,5 mm) eller kjøretøyet ble innført umiddelbart etter stråling med en Gy. Surt β-galaktosidase-aktivitet gjenspeiles i den blå flekk. Tallene er gjennomsnittet av senescent leter celler /koloni ± SD i tre eksemplarer plater og forskjeller mellom de kombinerte behandlinger og hver og en av de eneste behandlinger samt mellom hver behandling og kontroll var statistisk signifikant
p
0,05. Bar, 100 mikrometer.
Økt eIF2α fosforylering modulerer DNA-reparasjon
Stråling førte til økt nivå av BRCA1, et protein som deltar i DNA-reparasjon etter stråleskader [41]. Økningen i BRCA1 ble opphevet ved salubrinal og ved forbigående ekspresjon av den phosphomimetic eIF2α S51D hvilket antyder at overdreven eIF2α fosforylering modulerer DNA-skade reparasjon (figur 7). Faktisk eksperimenter med HeLa-celler og U2OS celler som uttrykker reporter plasmider for NHEJ og HRR viste henholdsvis at salubrinal hemmet reparasjon av I-SCEI-indusert DSB via begge mekanismer (Figur 8).
Øvre panel: Kontroll og bestrålte celler (1,5 Gy) ble behandlet med 4,5 mikrometer salubrinal eller kjøretøyet. Cellene ble høstet 48 timer etter bestråling og behandlet for western blot-analyse av endringer i nivået av BRCA1.
Nedre paneler: Celler transfektert med 10 mikrogram /ml av S51A og S51D eIF2α varianter eller med transfeksjon reagenser alene (SHAM). Celler ble bestrålt med 9,5 Gy 24 timer etter transfeksjon og behandlet for analyse BRCA1 24 timer post-stråling. CD2 ble uttrykt i transfekterte celler som indikerer en vellykket transfeksjon. Sal – 4,5 mikrometer salubrinal.
a. Måling av NHEJ aktivitet ble utført 24 timer etter transfeksjon med I-SCEI. Forsøket ble gjengitt en gang med samme resultat, dvs. 4% reparasjon aktivitet for kontroll og 3% for salubrinal behandlede celler. b. Måling av HR-aktivitet ble utført 36 timer etter transfeksjon med I-SCEI. Eksperimentet ble gjengitt en gang med tilsvarende resultater, dvs. 2,35% aktivitet for kontroll og 1,6% aktivitet for salubrinal behandlede celler ved 24 timer etter transfeksjon med I-SCEI. Sal -. 4,5 mikrometer salubrinal
Økt og vedvarende fosforylering påvirker respons av brystkreft celler til Vorinostat
I likhet med stråling, HDACi – Vorinostat fører også til økt eIF2α fosforylering. Denne økningen har vært tenkt på som et gjennomsnitt av cellulær beskyttelse mot skader [26]. Men å kombinere lave konsentrasjoner av salubrinal og Vorinostat, i konsentrasjoner som hver for seg neppe påvirke eIF2α fosforylering, resulterte i økt fosforylering av eIF2α, som igjen var assosiert med økt klonogene død (Figur 9, Tabell 4, Tabell S5 i File S1).
a. Cellene ble høstet 48 timer etter påføringen av kjøretøyet (D), 4,5 pM salubrinal (S), 0.75 uM Vorinostat (V) eller begge deler (V + S) og behandlet for Western blot-analyse av eIF2α fosforylering. b. Gjennomsnittlig ganger endring i forhold til kontroll av eIF2α (e), peIF2α (p) og av forholdet peIF2α /eIF2α (p /e). b.
