Abstract
CD44 er et trans hyaluronsyre reseptor genet som koder over 100 forskjellige vev-spesifikk protein isoformer. Den mest utbredte, CD44 standard, har vært brukt som en kreft stamcelle markør i ovarier og andre kreftformer. Ekspresjon av epiteliale CD44-variant som inneholder eksoner v8-10 (CD44v8-10) har blitt assosiert med mer kjemoresistent og metastatiske tumorer i gastrointestinale og brystkreft, men dens rolle i eggstokkreft er ukjent; vi undersøkt, og derfor dens anvendelse som et prognostisk markør i denne sykdommen. De genuttrykk profiler av 254 tumorprøver fra Kreft Genome Atlas RNAseqV2 ble analysert for tilstedeværelse av CD44-isoformer. En trend for lengre overlevelse ble observert hos pasienter med høyt uttrykk av CD44-isoformer som inneholder eksoner v8-10. Immunhistokjemisk (IHC) analyse av svulster for tilstedeværelse av CD44v8-10 ble utført på en uavhengig kohort av 210 pasienter med høy grad av serøs eggstokkreft ved hjelp av en svulst vev microarray. Pasientutvelgelse basert på programvare analyse av farging viste en statistisk signifikant økning i overlevelse hos pasienter med de høyeste nivåene av trans protein uttrykk (topp 10 eller 20%) sammenlignet med de med lavest uttrykk (nederst 10 og 20%) (p = 0,0181 , p = 0,0262 henholdsvis). Uttrykk av CD44v8-10 i primær eggstokkkreft cellelinjer ble korrelert med en overveiende epitelial fenotype preget av høy uttrykk for epiteliale markører og lavt uttrykk av mesenchymale markører ved qPCR, Western blot, og IHC. Motsatt, påvisning av proteolytisk spaltet og løselig ekstracellulære domene av CD44v8-10 i pasient ascites prøver ble korrelert med vesentlig dårligere prognose (p 0,05). Derfor kan nærværet av transmembrane CD44v8-10 på overflaten av primær tumorceller være en markør for en meget epitelial tumor med bedre prognose mens enzymatisk spaltning av CD44v8-10, som påvist ved nærvær av det oppløselige ekstracellulære domene i ascites fluid, kan være indikasjon på en mer metastatisk sykdom og dårligere prognose
Citation. Sosulski A, Horn H, Zhang L, Coletti C, Vathipadiekal V, Castro CM, et al. (2016) CD44 Splice Variant v8-10 som en markør av Serous Eggstokkreft Prognose. PLoS ONE 11 (6): e0156595. doi: 10,1371 /journal.pone.0156595
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN
mottatt: 28 september 2015; Godkjent: 17 mai 2016; Publisert: 02.06.2016
Copyright: © 2016 Sosulski et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer eller på TCGA hjemmeside https://cancergenome.nih.gov/
finansiering:. forfatterne fikk ingen spesifikke midler til dette arbeidet
konkurrerende interesser. han forfattere har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den vanligste dødsårsaken blant kvinner med gynekologisk kreft på verdensbasis, med høy dødelighet knyttet til avansert stadium hvor det er diagnostisert, vanligvis lenge etter intraperitoneal metastatisk spredning har skjedd [1]. For at metastasering skal skje, eggstokkreft celler ofte forandre ekspresjon av proteiner involvert i ekstracellulær matriks interaksjoner, så som CD44, for å modulere invasjon [2, 3]. Som et cellulært adhesjonsmolekyl og en større ekstracellulære glycoprotein, har hyaluronsyre-reseptoren CD44 vært implisert i tumorinvasjon og metastase i bryst, lunge, og gastrointestinal-kreft [2].
CD44 kodes for av maksimalt 20 eksoner, hvorav 10 er referert til som variant eksoner. Standarden isoform (CD44s) bare inneholder 10 eksoner, inkludert de første 5 eksoner av 5′-enden og de siste 5 eksoner fra 3′-enden, og således mangler de variante eksoner i midten, referert til som v1-V10 eller exoner 5a -15 i standard nomenklatur [1, 4, 5]. CD44s er den mest utbredte isoform, allment uttrykt på overflaten av de fleste vev og alle hematopoieitic celler hvor den er ansvarlig for lymphocyte homing og andre celle-celle og celle-ekstracellulær matriks-interaksjoner. Et stort antall alternative spleising isoformer av CD44 eksisterer som inneholder en kombinasjon av eksoner variant (V1 gjennom V10) er satt inn i juxtamembrane ekstracellulære region under kontroll av epiteliale spleise regulatoriske proteiner (ESRP) 1 og 2 [6]. Mange CD44-isoformer variant har vev-spesifikk ekspresjon; CD44v8-10 er uttrykt i epitelvev og i epitel-type karsinomer i bukspyttkjertel, prostata, bryst, lunge og [7], hvor det har blitt omfattende studert som en spesifikk markør av maligne celler, med øket ekspresjon observert i løpet av gastrisk carcinogenesis in en murin modell, og i adenom til karsinom progresjon i human kolorektal kreft [8-10] og gastrisk kreft [11].
CD44s og CD44-isoformer variant har vært implisert i legemiddelresistens og identifisert som stamcellemarkører [ ,,,0],12]. I eggstokkreft, studier med uttrykk for CD44s og dets variant isoformer i å vurdere prognose har produsert motstridende resultater, med noen som viste nedsatt prognose, og andre forbedret prognose, eller ingen effekt [13]. Men studier på isoformer som inneholder forskjellige individuelle variant eksoner i eggstokkreft har generelt foreslått økt total overlevelse assosiert med skjøte isoformer av CD44 [14]. Den epitel spleisevariant 8-10, uttrykker v8, v9 og v10 sammen, har ikke blitt undersøkt i høyverdig serøs eggstokkreft; Derfor er det pålitelighet og gjennomførbarhet i å forutsi prognose ble undersøkt i denne studien.
Materialer og metoder
The Cancer Genome Atlas (TCGA) dataanalyse
Expression data (Nivå 3 ) på dokumenterte CD44s og CD44 variant isoformer for svulster i eggstokkene serøs cystadenocarcinoma ble analysert i en kohort av 255 pasienter i TCGA (etter å sensurere prøver fra tilbakevendende svulster og fokusere bare på høyverdig sykdom (G2 og G3)). Vi brukte Nivå 3 data for å unngå re-analysere rå datasett; For ytterligere informasjon vennligst se den opprinnelige publikasjonen [15]. Basert på kommentaren filen for RNAseqV2 analyse (S1 Table), vi definert en CD44 isoform som v8-10 inneholder eksoner chr11: 35229652-35229753: +, chr11: 35231512-35231601: + og chr11: 35232793-35232996: +. Overlevelsesanalyse av den nederste og øverste 10% basert på bety ekspresjon av de tre (v8-10) eksoner, ble kjørt ved hjelp av «overlevelse» og «survMisc» pakken i R. Spesielt vi brukte supremum (Renyi) versjon av log-rank test som er utviklet for analyse av krysset overlevelseskurver.
svulstvev Micro-matrise analyser
En annen kohort av 210 høyverdig ovarian serøs cystadenocarcinoma pasienter innlagt ved Massachusetts general Hospital og Brigham and Women Hospital Dana Farber Cancer Center mellom 1993-2009 [16] ble studert under intern gjennomgang brett (IRB) godkjente protokoller (MGH2007P00001918 eller DFCI 02-051). Tumor kjerneprøver (3 mm) ble oppnådd ved første debulking kirurgi, scoret i henhold til Fédération Internationale de Gynécologie Obstétrique (Figo) retningslinjer, og ble formalinfiksert og parafininnebygd. Alle svulster biopsier, forkastet avidentifiserte ascites prøver, og tilsvarende pasientinformasjon ble samlet etter IRB-godkjente protokoller etter skriftlig informert samtykke ble innhentet. Hver ny parafin blokk inneholdt 24 tilfeldig fordelt tumor kjerner, med minst 2 kjerner per pasient, og ble seksjonert på 7 mikron tykkelse som tidligere beskrevet [17]. Immunhistokjemi ble utført på objektglass med tumormikroarray (TMA) seksjoner som tidligere er publisert [16] før den blir blokkert ved hjelp av en oppløsning av 1% bovint serumalbumin (BSA) med 2% esel serum i fosfatbufret saltvann (PBS) i 1 time ved værelses temperatur, inkubert med et antistoff til CD44v8-10 (CD44v9 RV3) [4] ved 1: 12500 over natten i et fuktet kammer ved 4 ° C, vasket med PBS, og inkubert ved hjelp av et sekundært geite-anti-rotte-pepperrot peroksydase (HRP) konjugert antistoff ( Santa Cruz bioteknologi, Dallas, TX) ved 1: 200 i 1,5 timer ved romtemperatur. Lysbilder ble skylt og farget med en diaminobenzidine (DAB) løsning, teller beiset med Hematoxylin (Dako, Carpinteria CA), dehydrert, og coverslipped før de blir skannet og digitalisert med en Scanscope (Leica, Buffalo Grove IL) og analysert med Aperio Imagescope programvare (Leica, Buffalo Grove IL). Positivitet og Intensitet (PI) score ble beregnet som produktet av farget område fraksjon (positivitet) og dens intensitet. For formålet med fargingen analysen var bare kjerner i hvilken mer enn 50% av det vev forble intakt på glass-slide. Basert på dette kriteriet hadde vi 6 pasienter for hvem vi beregnet PI ranger med en enkelt kjerne, og 203 hvor vi tok gjennomsnittlig PI score fra 2 kjerner, for totalt 209 pasienter som ble analysert. Pasient overlevelse ble beregnet fra diagnosedato til dødsdato, eller inngangen til hospice omsorg når den ikke er tilgjengelig og konvertert fra dager til måneder ved å dele antall dager etter 30. Total overlevelse ble analysert ved Kaplan-Meier plott og statistisk signifikans utledes av log-rank tester. Korrelasjoner til kliniske parametre ble gjort ved hjelp av chi-kvadrat analyse. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av Prism 6 programvare (Graphpad, La Jolla CA).
Cellelinjer
En serie av primær eggstokkkreft cellelinjer ble hentet fra pasient ascites, per IRB-godkjent protokoll (# 2007P001918 /MGH) [16]. I korthet ble etter sentrifugering av ascitesvæsken, ble cellepelletene som innføres i vevskultur under to forskjellige forhold (adherente og sfæroide). I adherente kulturer, ble cellene holdt ved fullstendig konfluens i flere uker til flere måneder før tett epitele cellekloner ble observert. Forurensende celletyper (leukocytter, mesothelial, og fibroblast-celler) ble fjernet ved gjentatt partiell fordøyelse trypsin inntil det ikke forurensende celletyper kunne observeres. Deretter ble cellene passeres minst 5 ganger ved 1:10 fortynning for å utlede stabil homogen cellelinje. Alternativt, for sfæroide kulturer (betegnet med suffiks-SPH), ble cellene sådd ut i vanlige flasker for 24 timer og ikke-adherente celler ble oppsamlet og overført til nye ultra-lav feste kolber, mens festede celler ble kastet. Sfæroide kulturer ble passert ved dissosiasjon og fortynnet 1:10 i minst 5 passeringer for å utlede stabile homogene cellelinjer. Panelet av primære cellelinjer består av 16 serøse epitelial eggstokkreft (ptAB, ptAB-SPH, ptAF, ptAF-SPH, PTW, PTW-SPH, ptAO, ptAO-SPH, PTD, PTH, ptAI, PKD1, PKD2, ptAL- SPH, ptAM-SPH, PTAK-SPH), en endometrioid epiteliale kreftformer (ptAP-SPH), og en mucinous ovarialcancer (PTG) dyrket i tilhenger og /eller sfæroide dyrkningsforhold.
Primære cellelinjer var opprettholdes i cellekultur i monolag i DMEM: F12 medium med 10% FFBS 1% penicillin /streptomycin, 1% L-glutamin (Corning, New York, NY), eller som ikke-adherente kuler i serumfritt tumor sfære medier [16] i 37C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO2. I tillegg, eggstokkreft etablerte cellelinjer OVCAR5 [18] og OVCAR8 [19], ble holdt i DMEM medier med 10% føtalt bovint serum (FBS) 1% penicillin /streptomycin, 1% L-glutamin (Corning, New York, NY).
Q-PCR og Principle Component Analysis
Kvantitativ PCR ble utført på primære cellelinjer avledet fra pasientenes ascites (ptAB, ptAB-SPH, ptAF, ptAF-SPH, PTW, PTW-sph , ptAO-SPH, PTG, PTD, PTH, PKD1, PKD2, ptAL-SPH, ptAP-SPH, ptAM-SPH) og på de etablerte ovarialcancer cellelinjer ovčar-5 og ovčar-8. Cellepelletene ble oppnådd etter sentrifugering, vasket med fosfatbufret saltvann (PBS), og frosset ved -80C, inntil RNA-ekstraksjon ved hjelp av et Qiagen RNeasy Mini Kit (Germantown, MD) og kvantifisert ved Nanodrop. cDNA var revers transkribert ved hjelp av 500 ng av RNA per prøve med Hevet III First Strand Synthesis Super Mix (Invitrogen, Carlsbad CA), og qPCR ble utført for etablerte produsentene av epitelial til mesenchymale transformasjon (EMT), og pluripotency inkludert CD44s, CD44v8-10 [ ,,,0],20], vimentin, E-cadherin, ESRP1, Zeb1, Lin-28, Sox-2, Oct-4, N-cadherin, og EpCAM, med GAPDH som en intern standard. Relativ ekspresjon ble utledet ved å bestemme syklus terskel (Ct) og beregnet ved hjelp av 2 ^ -ΔCt transformasjon normalisert til GAPDH Ct. Prinsipp komponentanalyse (PCA) ble utført ved hjelp av disse genuttrykk verdiene etter log transformasjon ved hjelp av «FactoMineR» pakken i R. PCA med mesenchymale samt epiteliale markører klart adskilt på den første komponenten, mens EMT og pluripotente markører var vinkelrett på den andre komponent, men umulig å skille fra hverandre.
Western Analyse
Cell pellets høstet fra et panel av primære pasient ascites cellelinjer (ptAB, ptAB-SPH, ptAF, ptAF-SPH, PTW, PTW -sph, ptAO, ptAO-SPH, PTD, PTH, ptAI, PKD1, PKD2, ptAL-SPH, ptAP-SPH, ptAM-SPH, PTAK-SPH) og 2 etablerte kreftcellelinjer (OVCAR-5 og OVCAR-8) ble vasket to ganger med 10 ml iskald PBS og hele celleekstrakter fremstilt i 1x lyseringsbuffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) i sterilt vann inneholdende en protease inhibitor cocktail (Roche Indianapolis, iN) og fosfatase-hemmer tabletter (Roche, Indianapolis iN). Total protein per lysat ble innhentet ved hjelp av en Pierce bicinchoninic syre analysen (BCA) protein kvantifisering kit (Thermoscientific, Rockford IL), og like mengder proteiner (15ug) redusert, lagt i hvert kjørefelt, og adskilt av NuPage 4-12% geler ( life-teknologi, Carlsbad CA). Proteiner ble overført til Immobilon polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, MA), blokkert i 5% ikke-fettholdig melk oppløst i en tris-bufret saltløsning og tween 20 (TBST) løsning, og deretter inkubert over natten ved 4 ° C for å detektere komplett lengde transmembran eller intracellulær protein med primært antistoff rotte-anti CD44v8-10 (RV3) (1: 1000) [8], eller mus anti CD44s (R + D, Minneapolis MN) (1: 500), kanin-anti vimentin (Abcam, Cambridge MA) (1: 1000), eller kanin anti-E-cadherin (Abcam, Cambridge MA) (1: 10.000) antistoffer, hver fortynnet i 5% fettfri melk i TBST. PVDF-membranene ble deretter vasket med TBST og inkubert med en passende sekundært antistoff, enten et anti kanin (Cell Signaling teknologi, Danvers, MA), anti-mus (Jackson Laboratories, Bar Harbor MA), eller anti-rotte (Santa Cruz Bioteknologi, Dallas, TX) -antistoff konjugert til et pepperrotperoksidase indikator, hver på 1: 10.000 i 5% melk i TBST-løsning i 1 time ved romtemperatur. Membraner ble igjen vasket i TBST og behandles med Pico ECL ™ chemiluminescence substrat for protein visualisering (Thermoscientific, Rockford IL). Relativ protein overflod ble målt ved densitometri av Western blot band og normalisert for likt protein lasting ved hjelp av B-aktin tetthet av Image J programvare analyse.
Pasient ascites ble hentet fra ferske terapeutiske paracenteses, per IRB-godkjent protokoll (# 2007P001918 /MGH). 1 ml av ascitesvæske supernatantprøver ble sonikert, sentrifugert ved maksimal hastighet i 10 minutter for å fjerne, og fortynnet 1:50 i lyseringsbuffer før innkjøring på et western blot som beskrevet ovenfor. Membraner ble inkubert med rotte anti CD44v8-10 (RV3) (1: 1000) eller mus anti CD44s (R + D, Minneapolis MN) (1: 500) over natten ved 4C og utviklet som ovenfor bruker femto ECL ™ chemiluminescence substrat (Thermoscientific, Rockford IL) for å bestemme tilstedeværelsen av oppløselige spaltet og utskilt ekstracellulære domene av CD44v8-10 og CD44s felle inn i pasienten ascitesvæske. Som et laste kontroll vi brukte anti-human IgG-tung og lettkjede pepperrot-peroksidase-konjugat 1: 20000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Bilder ble tatt av BioRad XR Gel Doc bilde lab programvare (BioRad, Hercules, CA) og analysert ved hjelp av bilde-J som en prosent av IgG-lettkjede overflod. Shed protein nivået ble deretter korrelert med pasientens overlevelse, med endepunkter være dødsdato, eller inngangen til hospice omsorg når den ikke er tilgjengelig.
Immunohistochemistry av epitel og mesenchymale markører i PDXa Eksplanterte svulster
pasient- avledet xenografter fra ascites (PDXa) hvor etablert ved implantering av 5 millioner celler med lav passasje primære linjer (ptAP-SPH, PTW, ptAM-SPH, PTH, ptAB-SPH, PTD) resuspendert 1: 1 i Matrigel (Corning, New York NY ) og implantert subkutant i flankene av NOD /SCID /IL2RGamma Jax ™ mus (Jackson Laboratory, Bar Harbor ME) under en IACUC-godkjent forsøksprotokoll (# 2009N000033) [16]. OVCAR5 svulster ble utledet ved hjelp av en identisk xenografting protokollen med 1 million celler. Dannede svulster ble fiksert i 4% paraformaldehyde, i parafin, og seksjonert 7 mikrometer tykkelse på Fisher Scientific
Probe På pluss
objektglass (Fisher Scientific, New York NY). Glass ble deparaffinized i xylen, rehydrert i alkohol, og varmes i mikrobølgeovn i bufret natriumsitrat (0,01 M) for antigen gjenfinning i 5 minutter ved høy effekt, i 10 minutter ved 10% kraft og 10 minutter ved 20% kraft, deretter skylt i destillert vann . Objektglassene ble behandlet med 3% -ig hydrogenperoksyd, vasket og blokkert ved hjelp av en oppløsning av 1% BSA med 2% føtalt kalveserum (FCS) i PBS i 1 time ved romtemperatur, deretter inkubert med CD44v8-10 antistoff (RV3 rotte monoklonalt) (1: 12500), og sammenlignet med de inkubert med CD44s (R + D, Minneapolis, MN, muse-monoklonalt 16ug /ml), anti-E-cadherin antistoff (Abcam, Cambridge MA, kanin) (1: 500), eller anti vimentin antistoff (Abcam, Cambridge, MA, kanin) (1: 500) over natten i en fuktet kammer ved 4C. Etter inkubering med et geit anti-rotte-HRP-antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), esel anti-muse-HRP, eller esel-anti-kanin HRP-antistoff (1: 200) (Jackson Laboratories, Bar Harbor MA) i 1,5 timer ved værelse temperatur, lysbilder ble skylt og farget med en DAB-løsning (Sigma Aldrich, St. Louis MO), og teller beiset med Hematoxylin (Dako, Carpinteria CA), dehydrert, og coverslipped. Representative mikrobilder ble oppnådd for romlig sammenlikning av proteiner som tidligere er påvist ved Western-analyse av de primære cellelinjer fra hvilke tumorene ble dyrket.
Resultatene
Ekspresjon av CD44 variant isoformer inneholdende ekson 8 til 10 ( V8-10) mRNA i kreft~~POS=TRUNC Genome Atlas (TCGA) RNAseqV2 eggstokkreft datasett
for å bestemme mRNA uttrykk nivåer av CD44s og dets variant V8-10 inneholder isoformene (fig 1A) i serøs ovarietumorer, vi analysert den RNAseqV2 ressurs fra TCGA, som omfatter en kohort av 255 Grad 2 og 3 tumorprøver. Ekspresjonen av de enkelte eksoner V8, V9, V10 og korrelerer sterkt i løpet av alle prøvene, som også kan observeres for «standard» eksoner 1-5 og 15-18 (S1 figur), noe som tyder på at de er hovedsakelig uttrykt som en blokk med v8 -10. Videre eksoner V8-10 synes å være den mest tallrike av alle de variable eksoner, noe som tyder på cd44v8-10 inneholdende isoformene er de dominerende alternativt spleisede transkripsjoner av CD44 (figur 1B). Pasientene ble stratifisert basert på gjennomsnitts mRNA-ekspresjonsnivåene av eksoner V8-10 i sin tumor og delt i høye og lave uttrykkende grupper (topp og bunn 10%), hvorfra og Kaplan-Meier-overlevelseskurver ble generert som indikerer en betydelig bedre prognose i høy expressers (p = 0,035) (figur 1C). For å bestemme den relative bidraget fra hver distinkt isoform inneholder eksoner v8-10 vi sammenlignet deres totale uttrykk og estimerte innflytelse på overlevelse. En utvikling i retning av økt overlevelse ble observert for alle unntatt ett CD44 isoformer inneholder V8-10, selv om ingen var betydelig isolert (S2 fig). Multivariat analyse ved hjelp av Cox proporsjonale hasardratio modell funnet at bare alder hatt en betydelig innvirkning på total overlevelse (tabell 1).
A) Skjematisk fremstilling av alternative spleise isoformer uttrykker variable eksoner v8-v10. B) Fordeling av RNAseq2 uttrykk data over 254 prøver for alle CD44 eksoner i TCGA eggstokkreft datasett. Prøver med ingen ekspresjon ble utelatt fra denne figur. C) Kaplan-Meier plot av overlevelseskurven sammenligne høy og lav CD44v8-10 uttrykkende eksempler og tilsvarende tabell med antall pasienter på hvert gitt tidspunkt. Vi definerte den høye uttrykker sett (rød) og lav uttrykker sett (svart) som prøvene med høyest og lavest uttrykk henholdsvis ved hjelp av topp /bunn 10% av expressers, med handlingen strekker seg til 5 år. Barer representerer sensurert datapunkter.
CD44v8-10 flekker i primærsvulster er assosiert med lengre overlevelse i en uavhengig kohort av 210 høyverdig serøs kreftpasienter på eggstokkene analysert av svulst microarray immunhistokjemi
for å bekrefte de trendene som observeres i analysen av TCGA data tyder på en bedre prognose var forbundet med CD44v8-10 uttrykk, bestemte vi oss for å undersøke proteinnivåer CD44v8-10 i tumor biopsier. Surface uttrykk for trans CD44v8-10 protein ble analysert i høyverdig serøs ovarialcancer ved immunhistokjemi å bruke en bestemt CD44v8-10 antistoff i en svulst microarray som inneholder primærtumorprøver fra en kohort av 210 pasienter. Alle svulster var av høy klasse serøs histologi med de aller fleste (71%) scoret som minst FIGO stadium III, og grad 3 (89%) ved diagnose (tabell 2). Alle primære tumormicroarray undersøkte prøvene ble tatt ved tidspunktet for innledende debulking kirurgi. Diffus og fokal farging ble observert i søyle epitel i papiller, ofte i basallaget (piler) (figur 2A, 2B og 2C) av epitel, men ikke i tumoren stroma i en hvilken som helst av kjernene (figur 2D), og alltid på celleoverflaten i stedet for et intracellulært eller cytoplasmiske plassering (figur 2B, innsats). Total intensitet av positive bildeelementer og det totale antall positive bildeelementer, som bestemt ved Imagescope programvare, ble slått sammen til en positiv intensitet (PI), som ble fordelt på tvers av de to representative kjerner per pasient, og som brukes til pasient lagdeling. Vi valgte topp og bunn 10 og 20 prosent av pasientene for å sammenligne overlevelses forskjeller mellom lave og høye expressers av CD44v8-10 transmembran-overflateprotein, og fant en betydelig økning i overlevelse for både topp 10% og 20% av pasientene som uttrykker høye nivåer av CD44v8-10, med en median overlevelse av 30 og 29 måneder når sammenlignet med pasienter som uttrykker den laveste 10% (p = 0,0181) og 20% (p = 0,0262), med henholdsvis en median overlevelse på 49 år og 52 måneder (fig 2E) . Sammensetningen av den nederste og øverste 10% og 20% av pasientene var lik når undersøke kliniske parametere av FIGO karakter, scene, og alder (S2 tabell), med unntak av en forskjell i det lille antallet av klasse 2 pasienter. Når denne befolkningen i klasse 2 ble ekskludert fra analysen for å utelukke påvirkning av disse sjeldne lavere klasse svulster, forble overlevelse forskjellen betydelig mellom høyeste og laveste expressers av CD44v8-10 protein (S3 figur).
faste parafininnebygd vev microarray kjerner ble farget av immunhistokjemi hjelp av et antistoff mot CD44v9, skannet med en Aperio Scanscope, og analysert ved hjelp av Aperio Imagescope programvare positive pikselantallet algoritme. Representative bilder tatt ved høy (40x) makt showet basal epithelial flekker i a og c, mer diffus overflate epitel flekker i b, og negative stroma med isolerte positive epitelceller i d. e.) Total overlevelse av pasienter med høy grad av serøs ovarialcancer av CD44 variant uttrykk. Venstre- høyeste og laveste 10% uttrykk variant og Høyre- høyeste og laveste 20% av uttrykk for variant, demonstrerer betydelig total overlevelse i de høyeste expressers med p = 0,0181 og p = 0,0262, henholdsvis.
multivariat analyse av registrerte kliniske parametre som alder, klasse, scene, debulking status, og CD44v8-10 fargeintensitet ble analysert for deres effekt på prognosen (Tabell 3).
Age hadde den sterkeste innflytelse på prognosen fulgt av CD44v9 fargeintensitet av svulsten mens FIGO iscenesettelse eller gradering og debulking status var ikke signifikant. Siden cox proporsjonal hasardratio (tabell 3) viste en avhengighet for alder og CD44v8-10 overflate markør uttrykk, ønsket vi å utforske variable sammenheng bruker en objektiv pasientutvelgelse til å generere et beslutningstre som maksimerer prognostiske forskjeller (figur 3). Vi stratifisert pasientgrupper basert på alder, FIGO stadium, Grading, debulking status, og CD44v8-10 uttrykk. Den resulterende klassifisering viste at pasienter med 59,2 år ikke vesentlig nytte av høyere CD44 uttrykk. Yngre pasienter viser en sterk korrelasjon på bedre overlevelse når du har høye CD44 overflate markør. Disse observasjonene avgrense funnene fra cox hasardratio modell og definere en beslutning treet som kunne brukes klinisk for å maksimere den prognostiske makt CD44v8-10 svulst farging (figur 3).
Pasientene fra svulsten rekke sampleset ble stratifisert ved hjelp av alder, CD44v9 fargeintensitet (σ av CD44v9 uttrykk), klasse, debulking status, og FIGO poengsum. Multivariat analyse ble utført og virkning size rangert til å generere et binært beslutningstre å maksimere prognostisk effekt på en objektiv måte og tildele statistisk signifikans. Bare statistisk signifikante variabler (alder og CD44v9 farging) vises sammen med deres effekt på pasientene, overlevelse på Kaplan-Meier plott. Barer representerer sensurert datapunkter.
Uttrykk for CD44v8-10 korrelerer med en epitelial fenotype
Vi utførte prinsipp komponent analyse (PCA) (FactoMiner) på mRNA uttrykk, som definert av qPCR verdier av to
-ΔCt normalisert til GAPDH, i en serie av forskjellig epitel (EpCAM, ESPR1, E-cadherin) og mesenchymale (ZEB1, vimentin, N-cadherin) markører i et panel av 15 primære (ptAB, ptAB- SPH, ptAF, ptAF-SPH, PTW, PTW-SPH, ptAO-SPH, PTG, PTD, PTH, PKD1, PKD2, ptAL-SPH, ptAP-SPH, ptAM-SPH) og to etablerte eggstokkreft cellelinjer (OVCAR5, OVCAR8). PCA bekreftet at CD44v8-10 mRNA uttrykk forbinder med andre epiteliale markører, mens CD44s uttrykk korrelerer med mesenchymale markører i eggstokkreft (fig 4A). Uttrykk for pluripotency markører (LIN28, SOX2, OCT4) var assosiert med verken epitel eller mesenchymale markører, noe som tyder stemness er uavhengig av epitel eller mesenchymale status (fig 4A).
A) Prinsipal komponent analyse ved hjelp av qPCR relativ kvantifisering av uttrykket av epiteliale, mesenchymale og pluripotency markører i primær eggstokkkreft cellelinjer. Fargede piler indikerer retninger for hver gruppe av markører. B) Western analyse av primære cellelinje proteinlysatene for uttrykk av CD44v8-10 protein ved hjelp av en rotte monoklonalt antistoff mot humant CD44v8-10.
Tilsvarende uttrykk for CD44v8-10 protein i pasient avledet celle linje lysatene av western blot viste en trend med co-uttrykk for CD44v8-10 med E-cadherin, eller CD44s med vimentin, i et gjensidig utelukkende mote (figur 4B), bekrefter qPCR data som indikerer at CD44v8-10 er en epitelial markør og CD44s en mesenchymale markør i høy klasse serøs eggstokkreft.
for å bestemme den romlige uttrykk for CD44v8-10, og dens forhold til de epiteliale eller mesenchymale tumor histologier, pasient avledet xenografter av ascites (PDXa s) [16] ble analysert ved hjelp av immunhistokjemi (IHC). Totalt sett svulster vokst
in vivo
rekapitulert epitel eller mesenkymale heterogenitet observert i den primære cellelinje
in vitro plakater (figur 4). Tumorer med et høyt epiteliale fenotype uttrykte lave nivåer av vimentin, som var begrenset til stromale celler (AT, OVCAR5) og høye nivåer av ekspresjon CD44v8-10, som var spesifikke for celle overflaten av kreftceller i svulsten (fig 5A sette inn). Omvendt, jo flere mesenkymale tumorer (PTH, PtAM kuler, og PtAB kuler) uttrykt vimentin i både den epiteliale kreftceller så vel som de stromale celler i tumoren, og hadde meget lav ekspresjon av CD44v8-10 (figur 5B). Tumorer i mellomliggende fenotype med både epitel og mesenkymale karakteristika hadde ekspresjon av CD44v8-10 og vimentin i epitelceller samt stroma (figur 5C).
antistoff farging av vevssnitt fra tumorer utviklet in vivo etter injeksjon av 1 til 5 millioner primære pasient-avledet eggstokkkreftceller. Representative seksjoner fra svulster avledet fra OVCAR5, ptAP-SPH, Pt W (A), ptAM-SPH, PTH, ptAB-SPH (B) og PTD (C) er vist. CD44v8-10, og vimentin immunhistokjemisk flekken er vist med hematoksylin counterstain på 100x forstørrelse. CD44v8-10 etiketter overflaten av epitelceller kreftceller (innsats), mens vimentin etiketter stromale celler i flere epiteltumorer og de fleste celler i flere mesenchymale svulster (innsats). Svulster ble gruppert i epitel (A), mesenchymale (B) eller blandet fenotype (C) basert på farging.
Oppløselig CD44v8-10 kan påvises i supernatanten av ascites prøver og korrelerer med dårligere prognose
Vi evaluerte potensial til å oppdage den løselige ekstracellulære domenet av CD44v8-10 som en spaltet fragment i ascites fluid supernatant ved hjelp av Western blot av 28 ulike pasientprøver ascites. Løselig kløyvet CD44S er homogent uttrykk i alle ascites prøver, inkludert godartede kontroller, noe som tyder på det er en allestedsnærværende blod protein. Interessant, spaltes og skur oppløselige ekstracellulære domenet av CD44v8-10 var påvisbart i 27 av 28 prøver av pasienteggstokk ascites, med svært variable nivå, men var ikke detekterbare i benigne ascites, noe som tyder det kan være kreftspesifikke. En representativ Western blot av 6 pasient ascites er vist i fig 6A. Proteinet overflod av løselig ekstracellulære domenet til CD44v8-10 ble målt ved densitometri av Western blot band og normalisert for likt protein lasting ved hjelp av IgG lett kjede tetthet av Image J programvare analyse. Etter stratifisering av pasienter basert på CD44v8-10 nivåer, bemerket vi en betydelig redusert overlevelse hos pasienter med høye nivåer av løselig CD44v8-10 (topp 50%) med en median overlevelse på 39 måneder versus 59,27 måneder for den nederste 50% (p . = 0,0481) (figur 6B)
A) Ascites prøver (N = 28; 6 prøver vist som representative) ble oppnådd fra pasienter som gjennomgår terapeutisk paracentesis, og probet ved western blotting for CD44v8-10, CD44s, og anti human IgG lettkjede som en lasting kontroll. Protein Tetthetsmåling ble utført, og prøvene ble analysert for nivåer av ekspresjon av oppløselig CD44v8-10 og delt i to like grupper med høye og lave CD44v8-10 nivåer.
