Abstract
Bakgrunn
MIR-18a er en av de mest up-regulerte mirnas i kolorektal kreft (CRC) basert på miRNA profilering. I denne studien undersøkte vi den funksjonelle betydningen av MIR-18a i CRC.
Metoder
Uttrykk av MIR-18a ble undersøkt hos 45 pasienter CRC. Potensielle målgener av MIR-18a ble spådd av
i silico
søke og bekreftet av luciferase aktivitetsanalyse og Western blot. DNA-skade ble målt ved kometmetoden. Genfunksjon ble målt ved celle-levedyktighet, kolonidannelse og apoptose-analyser.
Resultatene
oppregulering av MIR-18a ble validert og bekreftet i 45 primær CRC-tumorer sammenlignet med tilstøtende normale vev
(
p
0,0001). Gjennom
i silico
søk, den 3’UTR av
Ataxia telangiectasia mutert (ATM)
inneholder en konservert MIR-18a bindingssete. Uttrykk for ATM ble nedregulert i CRC svulster (p
0,0001) og negativt korrelert med MIR-18a uttrykket (r = -0,4562, p
0,01). Over-ekspresjon av MIR-18a i kolon kreftceller reduseres betraktelig luciferaseaktiviteten av konstruksjonen med vill-type ATM 3’UTR, men ikke så med mutant ATM 3’UTR, å utlede en direkte interaksjon mellom MIR-18a med ATM 3’UTR . Dette ble ytterligere bekreftet ved nedregulering av ATM-proteinet ved MIR-18a. Som ATM er et viktig enzym i DNA-skade reparasjon, vurderte vi effekten av MIR-18a på DNA dobbelttrådbrudd. Ektopisk uttrykk for MIR-18a vesentlig hemmet reparasjon av DNA-skader indusert av etoposid (p
0,001)., Som fører til opphopning av DNA-skader, økt celle apoptose og dårlig klonogene overlevelse
Konklusjon
MIR-18a demper mobilnettet reparasjon av DNA dobbelttrådbrudd ved direkte undertrykke minibank, et viktig enzym i DNA-skade reparasjon
Citation. Wu CW, Dong YJ, Liang QY, han XQ, Ng SSM, Chan FKL, et al. (2013) mikroRNA-18a Demper DNA Damage Repair gjennom å undertrykke uttrykket av Ataxia telangiectasia mutert hos tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (2): e57036. doi: 10,1371 /journal.pone.0057036
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 15 november 2012; Godkjent: 16 januar 2013; Publisert: 21 februar 2013
Copyright: © 2013 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av en Natural Science Foundation National of China (NSFC) (Prosjekt kode 81101488), en Kina 863 program (2012AA02A506) og Hong Kong ITF fondet (ITS /276/11). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mirnas er 18- til 25-nukleotid ikke-kodende RNA-molekyler som regulerer mRNA oversettelse. De utøver effektene ved å målrette den RNA-induced Slå kompleks (RISC) til komplementære områder i 3 «ikke-translatert område (UTR) av sine mål gener [1]. Binding av en miRNA belastet RISC til en komplementær sekvens vil føre til enten translasjonell undertrykkelse eller nedbrytning av den målrettede mRNA [2]. Gjennom dette mirnas regulere en rekke cellulære prosesser inkludert apoptose [3], [4], differensiering [5] og celleproliferasjon [6]. Endrede miRNA uttrykk profiler som ble funnet i de fleste tumortyper inkludert kolorektal cancer (CRC) [7], [8], [9], [10]. Manipulering av spesifikke mirnas ble funnet å være i stand til å modulere tumorutvikling i dyremodell [6], [11], [12]. Tidligere gjennom profilering uttrykket av 667 miRNAs i menneskelige kolorektal kreft vev, identifiserte vi MIR-18a som en av de mest regulerte mirnas i menneskelig CRC [13]. Et høyt nivå av MIR-18a kan påvises i avføring fra CRC pasienter sammenlignet med personer med normal koloskopi. Ved fjerning av svulsten, avføring nivå av MIR-18a falt betydelig [13].
MIR-18a tilhører MIR-17-92 klynge, som ligger på kromosom 13q31.1 regionen. Den onkogene rolle MIR-17-92 klyngen er godt dokumentert. Over-ekspresjon av klyngen er forbundet med akselerert tumorvekst [6] og celleproliferasjon [14]. Kromosomkopiantall gevinst på MIR-17-92 klynge regionen ble assosiert med neoplastiske progresjon fra adenom til karsinom [15]. Høy uttrykk for MIR-18a har vært innblandet i brystkreft [16], blærekreft [17] og bukspyttkjertelkreft [18]. Men den funksjonelle rollen til mir-18a i CRC er fortsatt uklar. I denne studien ønsket vi å identifisere målet genet og sin kritiske rolle i CRC.
metoder og materialer
Menneskelig vevsprøver
Rektal svulst og tilstøtende ikke-tumor vev ble oppnådd fra 45 pasienter med histologisk bekreftet ved endetarmskreft når de gjennomgikk kirurgi på Prince of Wales Hospital, Hong Kong i 1999 til 2003. Normal rektal mukosa ble hentet fra friske kontroller under koloskopi på Prince of Wales Hospital i løpet av 2009. Alle fag gitt sitt skriftlige samtykke før prøven samlingen. Studien protokoll og samtykke prosedyre ble godkjent av etikkomiteen av det kinesiske universitetet i Hong Kong.
cellekultur, miRNA forløpere og Transfeksjon
CRC cellelinjer HCT-116 og HT-29 var vedtatt for
in vitro
analyser fordi disse to cellelinjene uttrykke funksjonell ATM som svar på DNA dobbel tråd pause (DSB sin) [19], [20]. Begge cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection og dyrket i McCoys 5A medium (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 5% CO
2 ved 37 ° C. Forløperen av MIR-18a (pre-MIR-18a) og negativ kontroll (pre-MIR-ctrl) ble kjøpt fra Applied Biosystems (Foster City, CA). Transfeksjon ble utført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens veiledning.
Dual-luciferase reporter analysen
Potensialet MIR-18a bindingssetet i ATM 3 «untranslation region (3’UTR) ble spådd av targetscan (www.targetscan.org) og Miranda (www.microRNA.org). Sekvenser med villtype eller mutant frø regioner ble klonet inn pMIR-RAPPORT luciferase vektor (Applied Biosystems). Mutant ATM 3’UTR sekvensen ble utarbeidet av mutere 5 nukleotider i frøet regionen. De syntetiserte oligonukleotider ble vist som følger:
Wild-type følelse strand:
5′-CTAGTTGTGTCCCAATTTCAAGTATTTTAATTGCACCTTAATGAAATTATCGAGCT-3 «
Wild-type anti-sense tråden.
5′-CGATAATTTCATTAAGGTGCAATTAAAATACTTGAAATTGGGACACAA-3 «
Mutant følelse strand.
5′-CTAGTTGTGTCCCAATTTCAAGTATTTTAATTTCGTATCAATGAAATTATCGAGCT-3′
Mutant anti-sense tråden.
5′-CGATAATTTCATTGATACGAAATTAAAATACTTGAAATTGGGACACAA-3 «.
celle~~POS=TRUNC linjene~~POS=HEADCOMP forbigående transfektert med pre-MIR-18a eller pre-Mir negativ kontroll (ved 15 nM endelig konsentrasjon) i 24-brønners plater var co- transfektert med
Renilla
luciferase rapport vektor (195 ng /brønn) og
Firefly
luciferase vektor (5 ng /brønn) med Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Cellene ble høstet 48 timer posttransfection og luciferase aktiviteter ble analysert ved dual-luciferase reporter analysen system (Promega, Madison, WI).
miRNA Kvantifisering av kvantitativ revers transkripsjon Polymerase Chain Reaction
Kvantitativ revers transkripsjon polymerase chain reaction (QRT-PCR) av individuelle miRNA ble utført ved hjelp av TaqMan miRNA revers transkripsjon kit (Applied Biosystems) og TaqMan menneskelige miRNA analysen (RNU6B: 001093, MIR-18a: 002422, MIR-16: 000391) basert på en modifisert protokoll fra Applied Biosystems [21]. miRNA uttrykket nivået ble normalisert til intern kontroll. Eksperimentet operatører var uvitende om kliniske data på tidspunktet kvantifisering av miRNA ble gjennomført.
QRT-PCR for mRNA
For ATM mRNA kvantifisering, total RNA ble revers transkribert med tilfeldig primer bruker Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), og real-time PCR ble satt med Power SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems). ATM-ekspresjon var normalisert til glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) Primer-sekvenser er som følger: ATM: Spiss: 5′- GGAGAGCTGGAAAGCATTGG-3 «; Omvendt: 5’TGAGAAGCTGGGAGTGTTTCTG-3 «. GAPDH: Spiss: 5»-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 «Revers: 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3»
Western Blot analyse
Total protein ble ekstrahert, og proteinkonsentrasjonen ble målt ved Bradford-DC-proteinet. analyse (Bio-Rad, Hercules, CA). 20 til 40 pl av protein fra hver prøve ble separert på 8% Bis /Tris-polyakrylamid-gel gjennom elektroforese og blottet på nitrocellulosemembraner (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Blottene ble immunfarget med primære antistoffer ved 4 ° C over natten og sekundære antistoff ved romtemperatur i 1 time. Anti-ATM (2C1) antistoff ble kjøpt fra Genetex (Irvine, California). Anti-fosfor-Checkpoint kinase 2 antistoff (Thr68) ble kjøpt fra Cell Signaling (Danvers, MA). Anti-GAPDH (SC-25778) antistoff ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California).
Comet Assay
HCT-116 celler ble transient transfektert med pre-MIR-18a eller pre-MIR negativ kontroll (15 nM endelig konsentrasjon) i 24-brønners plater. Etter en times inkubasjon med 2 uM etoposid eller DMSO, ble cellene høstet, enten eller byttet til medium uten etoposid i 2 timer for å tillate DNA-skade reparasjon. Ved slutten av forsøket ble cellene høstet for kometmetoden i henhold til produsentens guide (Trevigen, Gaithersburg, MD). Halen øyeblikk av celle kometer ble analysert automatisk ved hjelp av en komet analyseprogramvare, CometScore (Tri Tek Corp, Sumerduck, VA). Tail øyeblikk av 50 eller flere celler per lysbilde ble bestemt.
Colony Forming og celleviabilitet analysen
Cells (1 × 10
5 per brønn) ble belagt i en 24-brønns plate og transfektert med pre-MIR-18a eller pre-MIR-ctrl på 15 nM. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene inkubert med 2 uM etoposid eller DMSO i 1 time, oppsamlet og utsådd (500-1000 /brønn) i et friskt 24-brønners plate i 9 dager. Kolonier ble talt etter farging med
Harris hematoxylin
løsning. Celleviabilitet ble bestemt av 3- (4,5-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse (Promega) i henhold til produsentens veiledning. I korthet ble MTT-løsning tilsatt til hver brønn i en sluttkonsentrasjon på 1 mg /ml per brønn, og platene ble inkubert ved 37 ° C i ytterligere 3 timer. Etter inkubering ble 200 ul DMSO tilsatt til hver brønn for å oppløse formazanet dannet og absorbansen ble avlest ved 570 nm ved anvendelse av et spektrofotometer. Alle forsøkene ble triplicated.
Annexin V apoptose Analyse
Cells (1 × 10
5 per brønn) ble sådd i en 24-brønns plate og transfektert med pre-MIR-18a eller pre-MIR-ctrl på 15 nM. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene inkubert med 2 uM etoposid eller DMSO i 1 time. Apoptose ble bestemt ved flow-cytometri etter farging med Annexin V (FITC-konjugert) (BD Biosciences, Erembodegem, Belgia) og 7-amino-actinomycin (7-AAD; BD Biosciences)
statistikker og
sammenheng mellom MIR-18a og ATM uttrykk ble analysert ved Spearman r korrelasjon test. Forskjellen mellom to grupper i luciferase reporter analysen ble komet analyse og kolonidannelsesbestemmelsen bestemmes av student t-test. Sammenslutninger av MIR-18a uttrykk nivå med clinicopathological funksjoner ble analysert ved Fisher eksakt test. Regresjonsanalyse ble analysert ved SPSS (IBM, New York, USA). Forskjellen i celle-vekstkurver ble bestemt ved gjentatte målinger ANOVA. Progresjonsfri overlevelse analyse ble gjort av Kaplan-Meier metoden og resultatene ble testet ved hjelp av Log-rank test. p 0,05 ble tatt som statistisk signifikans. Alle statistiske tester unntatt regresjonsanalyse ble utført av Graphpad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, California).
Resultater
MIR-18a er oppregulert i rektal Tumor
Blant de 45 parene av endetarmskreft vevsprøver, 44 parene hadde høyere MIR-18a uttrykk i svulst enn i tilstøtende normalt vev (p 0,0001, figur 1A), med en median forskjell på 11.46-dobling (IQR 4.73- 26.00). En høy uttrykk for MIR-18a i tumor var assosiert med høyere tilbakefall, hvorav 9 av 15 tilfeller med høy tumor MIR-18a dukket sammenlignet med bare seks av 29 tilfeller med lav tumor MIR-18a dukket opp igjen etter kirurgisk reseksjon (p 0,0001, figur 3C). Den relative luciferase aktiviteten av villtype-konstruksjon av ATM 3’UTR i HCT-116 ble betydelig redusert i nærvær av MIR-18a (p 0,001; Mann-Whitney-test), mens en slik undertrykkende effekt av MIR-18a på luciferase aktivitet ble ikke observert i nærvær av mutant ATM 3’UTR (figur 3D), noe som indikerer en direkte og konkret interaksjon av MIR-18a på ATM 3’UTR. Interaksjonen ble ytterligere bekreftet ved observasjonen at over-ekspresjon av MIR-18a var i stand til å redusere ATM protein nivå og fosforylering av Checkpoint Kinase (CHK-2), en direkte nedstrøms fosforylering Målet ATM
in vitro
(Figur 3E). Under etoposid behandling for en time, pCHK-2 nivået var signifikant oppregulert uavhengig av MIR-18a over-uttrykk.
(A) Mir-18a justering stedet (understreket) innen ATM 3’UTR av forskjellig arten er bevart. (B) Eldre menneske MIR-18a sekvens og region av 3′-UTR av menneskelig ATM inneholder gjenkjenningssete, som ble klonet inn i en konstruksjon med
Renilla
luciferase. Mutant 3′-UTR inneholder et frø region med 5 muterte nukleotider (understreket). (C) Uttrykk for MIR-18a i HCT-116 celler transfektert med miRNA forløper kontroll (pre-MIR-ctrl) eller MIR-18a forløper (pre-MIR-18a) på 15 nM. (D) Luciferase aktivitet i HCT-116 celler ko-transfektert med
Renilla
luciferase konstruksjon (som inneholder hvete eller mutant MIR-18a frø region),
Firefly
luciferase konstruere og pre-speil ctrl eller pre-MIR-18a 15 nM. Aktivitetsnivået ble beregnet ved å normal
Renilla
luciferase til
Firefly
luciferase. NS betegner ingen statistisk signifikans. p-verdi ble bestemt ved student t-test. Gjennomsnitt og standardavvik (SD) ble beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter. (E) Immun av endogen ATM uttrykk i HCT-116 celler 48 timer etter transfeksjon av pre-MIR-ctrl og pre-MIR-18a. (F) Immun av fosforylert form av CHK-2 protein, en direkte nedstrøms mål for ATM, i HCT-116 celler, etter transfeksjon av pre-MIR-ctrl eller pre-MIR-18a under behandling med DMSO eller 2 mikrometer etoposid for en time.
ATM er nedregulert i rektal tumor og CRC cellelinjer
ATM uttrykk ble evaluert i 45 par med rektal svulst og nærliggende normalt vev. I motsetning til MIR-18a, ekspresjon av ATM var signifikant lavere i tumorer enn i ikke-tumorvev (p 0,0001; figur 1B), med en median forskjell av 0,369 ganger (IQR 0,127 til 0,575). Uttrykk av MIR-18a og at ATM ble omvendt korrelert med en Spearman r = -0,4562 (p 0,01; figur 1C). Den avvikende nedregulering av ATM ble også observert i CRC cellelinjer sammenlignet med vanlig kolon biopsier (p 0,05, figur 1D).
MIR-18a Regulerer dobbel tråd DNA Damage Recovery
ATM aktivering representerer en tidlig og viktig begivenhet for DNA reparasjon i respons på DNA DSB sin [24]. Som MIR-18a er i stand til å undertrykke ATM uttrykk, hypoteser vi over-uttrykk for MIR-18a i celler ville hemme utvinning mekanisme. Nivået på DSB sin ble undersøkt av kometmetoden. Uten induksjon av DNA-skader, HCT-116 celler hadde en baseline hale øyeblikk av 7,75 ± 4,37 enheter. Eksponering for 2 mikrometer etoposid i 1 time resulterte i en betydelig høyere hale øyeblikk (15.46 ± 6.07 enheter, p 0,0001), noe som indikerer induksjon av DNA DSB sin av etoposid. Når tillates i 2 timer i normal medium supplert med 10% FBS for gjenvinning, hale øyeblikk av etoposid behandlet HCT-116-celler gjenopprettet til basislinjenivå (7,69 ± 5,14 enheter), mens halen minuttet HCT116-celler overuttrykkende MIR-18a forble signifikant høyere enn baseline nivå (p 0,001), noe som indikerer MIR-18a indusert en effekt av å forby DNA-reparasjon (figur 4)
(A) tidslinjen i størrelsesorden behandling (B) Prøver av komethaler fra. hver gruppe, fra venstre til høyre, celler transfektert med miRNA kontroll forløper (pre-MIR-ctrl) og uten medikamentell behandling, celler transfektert med pre-MIR-ctrl og behandlet med 2 mikrometer etoposid, celler transfektert med pre-MIR-ctrl og behandlet med 2 uM etoposid, og cellene transfektert med pre-MIR-18a og behandlet med 2 uM etoposid, ble to siste grupper av celler tillates i to timer i normal medium etter medikamentbehandling. (C) Box plot hale øyeblikk av celler under annen behandling basert på analyse av 50 celler fra tilfeldige mikroskopiske felt. Boksen representerer interkvartilt område, linjen over Boksen indikerer medianverdier og kinnskjegg representerer 5-95 persentil verdier. p-verdier ble evaluert av ikke-parametrisk t-test.
MIR-18a Øker Sensibilisering av CRC Cells å Genotoxin
Uten rask respons og reparasjon, DNA-skade akkumulerer og reduserer cellevekst og celle levedyktighet. Vi undersøkte effekten av MIR-18a på CRC-cellevekst ved kolonidannelsesbestemmelsen i to CRC-cellelinjer (HT-29 og HCT116). Uten induksjon av DNA-skade, over-ekspresjon av MIR-18a ikke har signifikant effekt på cellevekst sammenlignet med celler transfektert med kontroll-forløper både i HT-29 (figur 5A) og i HCT-116 (figur 5C). Eksponert til 2 uM etoposid, ble de dannede koloniene betydelig redusert i HT-29 (figur 5A) og i HCT-116 (figur 5C). Konsekvent, ektopisk uttrykk for MIR-18a undertrykte betydelig celle levedyktighet i forhold til forløperen kontroll over-uttrykke HT-29 (p 0,001; figur 5B) og HCT-116 (p 0,05, figur 5D).
effekten av ektopisk ekspresjon av MIR-18a på cellevekst av (A) HT-29-celler, eller (C) HCT-116-celler, med eller uten behandling av 2 uM etoposid. Mean ± SD ble beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter. Signifikant forskjell ble bestemt ved student t-test. NS betegner ingen statistisk signifikans. Effekt av MIR-18a på (B) HT-29 og (D) HCT-116 cellelevedyktigheten etter behandling med 2 uM etoposid. Mean ± SD ble beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter. Signifikant forskjell ble bestemt ved gjentatt tiltak ANOVA.
MIR-18a Fremmer Genotoxin apoptose
Uten induksjon av DNA-skader, over-uttrykk for MIR-18a fremkalte ikke signifikant effekt i celle apoptose i HT-29 og HCT-116 (figur 6). Eksponering for 2 mikrometer etoposid betydelig indusert mengden av apoptotiske celler i begge HT-29 og HCT-116 celler (begge p 0,001; figur 6A2 og 6B2). Over-uttrykk for MIR-18a videre indusert apoptose synergi med etoposid i både HT-29 (p 0,0001) og HCT-116 (p 0,01). Celler
(A) HT-29 celler eller (B ) HCT-116 celler, med eller uten behandling av to mikrometer etoposid. Mean ± SD ble beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter. Signifikant forskjell ble bestemt ved student t-test. NS betegner ingen statistisk signifikans.
Diskusjoner
I denne studien en klar sammenheng mellom MIR-18a og genet ATM ble etablert. Luciferase reporter-analysen og western blot-analyse bekreftet interaksjonen, som var gjennom bindingen av MIR-18a til den 3′-ikke-translaterte område av ATM-mRNA og deretter undertrykket dens proteintranslasjon og dens aktivitet. Denne assosiasjonen var mest tydelig fra det omvendte korrelasjon mellom MIR-18a og ATM i endetarm tumorvev (p 0,01).
ATM er et høymolekylært protein kinase som spiller en sentral og tidlig rolle i å fremme reparasjon av DNA DSB, som er en form for de cytotoksiske DNA-lesjoner som oppstår gjennom både endogene (f.eks oksidativt stress) og eksogen (f.eks ioniserende stråling og genotoksiske midler) kilder. I ustimulert celle, ATM foreligger for det meste som en inaktiv homodimer eller multimer, med kinasedomenet av en ATM-proteinet bundet til det indre området av en annen ATM-proteinet inneholdende serin 1981-fosforyleringssetet [24]. Denne strukturen er viktig å holde ATM-proteinet aktiv og stabil når det ikke er noen skade på DNA. Derfor under noen ytre stimuli som fører til DNA-skader, MIR-18a over-uttrykk induserte ingen signifikant fenotypisk endring i HT-29 og HCT-116 celler som fremgår av celle levedyktighet, spredning og apoptose analyse sammenlignet med kontrollgrupper. Men som svar på DNA-skade indusert av etoposid, en gentoksisk stoff som spesifikt induserer DSB sin, fant vi at celler over-uttrykker Mir-18a var mindre i stand til å gjenopprette fra skade enn celler transfektert med miRNA kontroll forløper, noe som reflekterer en kompromittert DNA DSB sin reparasjon mekanisme. Under DNA-skader stimulus, kinasedomenet av en ATM-proteinet fosforylert den 1981-domenet til å kommunisere ATM-proteinet, noe som resulterer i aktiv kinase i monomer form [24]. Aktivert ATM er frigjort og kan fosforylere et variert utvalg av nedstrøms mål som deltar i arrangementer for å reparere DNA-skader [25]. Over-uttrykk for MIR-18a redusert minibank proteinmengder og dermed tilgjengeligheten av aktivert ATM for DNA reparasjon. Derfor, som DNA-skade akkumulerer uten rask reparasjon, MIR-18a over-uttrykke celler var mer tilbøyelige til å begå apoptose, redusert klonogene overlevelse og spredning rate, som tydelig i både HT-29 og HCT-116 celler.
kompromittert DNA-reparasjonsmekanismen på grunn av tap av ATM-funksjonen er et kjent anlegg for ulike sykdommer. Den mest tydelig eksempel er arvelig autosomal recessive uorden, Ataxia-telangiectasia (A-T), som resulterer fra tap av ATM-proteinekspresjon eller funksjonelt proteinprodukt. Sykdommen er preget av progressiv lillehjernen ataksi, neuro-degenerasjon, Radiosensitivity, celle-syklus Checkpoint defekter, genom ustabilitet, og en predisposisjon for ulike former for kreft [26], [27], [28]. Kromosom gevinst i regionen 13q31.1, der MIR-17-92 ligger, er en tidlig hendelse i adenom-karsinom-sekvensen. Konsekvent, oppregulering av MIR-18a er funnet siden forstadier stadium av CRC [13]. Den undertrykt DNA reparasjon mekanisme indusert ved oppregulert MIR-18a kan muligens tjene en katalyserende rolle i dannelsen av carcinoma.
For tiden, er tumorstadium den viktigste prognostisk indikator for CRC pasienter. Likevel, mange pasienter utviklet tilbakefall etter kirurgisk reseksjon uavhengig av scenen eller levering av adjuvant kjemoterapi. Andre prognostiske biomarkører for å gi bedre tilbakefall risikovurdering slik at pasienter kan ha nytte av tett oppfølging. Vi fant høy MIR-18a nivå er assosiert med høyere tilbakefall og raskere tilbakefall. Det er ikke avklart om dette fenomenet er formidlet gjennom minibank eller andre MIR-18a målgener. Likevel forblir rolle ATM forutsi kjemo- /radioterapi motstand i en klinisk setting ikke klarlagt. Roossink et al. rapportert at ATM aktivering indusert beskyttende rolle å kjemo- /radioterapi i en kohort av livmorhalskreftpasienter [29]. Jiang et al., Viste imidlertid at ATM kan sensibilisere og beskytte mot doxorubicin-indusert cytotoksisitet, avhengig av ferdighet fra andre DNA-reparasjonsgener slik som p53 og CHK-2 [30]. Huehls et al. viste at uttømming av ATM ikke sensibilisere celler for 5-FU, som er den viktigste regime som brukes i CRC [31]. Admansen et al. viste også at ved klinisk relevant dose av 5-FU, blir ATM-reaksjonsveien ikke aktivert for DNA-reparasjon i CRC-celler [32]. Derfor, selv om våre
in vitro
data viste tydelig undertrykkelse av ATM av MIR-18a sensibilisert kreftceller til etoposid, kan rollen ATM rolle på cellegift-motstand varierer i et kjemoterapeutisk-spesifikke og tumor-spesifikk måte
in vivo
. Dessuten kan MIR-18a-forbundet tilbakefall også bli formidlet gjennom andre potensielle mål gener som induserer sin onkogene naturen
in vivo
. Denne hypotesen, men trenger videre etterforskning og validering. Etableringen av MIR-18a som tilbakefall markør må også godkjennes i en kohort av større utvalg.
I konklusjonen, identifiserte vi minibank, et protein avgjørende for DNA-reparasjon, som mål for MIR-18a. I endetarmskreft vev, uttrykk for MIR-18a og ATM korrelerte omvendt. Ektopisk uttrykk MIR-18a undertrykker ATM uttrykk og demper DNA DSB reparasjon. MIR-18a, en ofte oppregulert miRNA i CRC, induserer sin onkogen effekt i det minste delvis gjennom å undertrykke minibank. Videre er svulst MIR-18a nivå en potensiell markør for endetarmskreft tilbakefall.
