Abstract
Bakgrunn
Kronisk UV hudeksponering fører til epidermal differensiering defekter hos mennesker som kan være i stor grad gjenopprettet av farmakologiske doser av nikotinsyre. Nikotinsyre har blitt identifisert som en ligand for de humane G-protein-koblede reseptorer GPR109A og GPR109B som signaliserer gjennom G
i-mediert inhibering av adenylat cyclase. Vi har undersøkt uttrykk, cellulær distribusjon, og funksjonaliteten til GPR109A /B i menneskelig hud og hud avledet epidermal cellene.
Resultater
Nikotinsyre øker epidermal differensiering i photodamaged menneskelig hud som bedømmes av terminal differensiering markører caspase 14 og filaggrin. Begge GPR109A og GPR109B gener transkriberes i menneskelig hud og i epidermale keratinocytter, men uttrykk i dermale fibroblaster er under deteksjonsgrensene. Receptor transkripsjoner er sterkt over-uttrykt i plateepitelkreft kreft. Reseptor-protein i normal hud er fremtredende fra den basale gjennom granulære lag av epidermis, med cellulær lokalisering mer spredt i basallaget, men hovedsakelig er lokalisert på plasmamembranen i mer differensierte epidermale lag. I normale humane primære og udødelig keratinocytter, nikotinsyre reseptorer viser plasmamembranen lokalisering og funksjonell G
i-mediert signalering. I motsetning til dette, i en karsinomer avledet cellelinje, viser reseptorprotein en mer diffus cellulær lokalisering og reseptorene er nesten ikke-funksjonell.
Konklusjoner
Resultatene av disse studiene rettferdiggjøre fremtidig genetisk og farmakologiske intervensjonsstudier for å definere mulig spesifikk rolle (r) av nikotinsyre reseptorer i menneskelig hud homeostase
Citation. Bermudez Y, Benavente CA, Meyer RG, Coyle WR, Jacobson MK, Jacobson EL (2011) Nikotin Acid Receptor Misdannelser i human Skin Cancer: Konsekvenser for en rolle i epidermal Differensiering. PLoS ONE 6 (5): e20487. doi: 10,1371 /journal.pone.0020487
Redaktør: Christophe Egles, Université de Technologie de Compiègne, Frankrike
mottatt: 9 mars 2011; Godkjent: 27 april 2011; Publisert: 31 mai 2011
Copyright: © 2011 Bermudez et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health gir CA43894, CA106677, CA78447, CA027502, ES06694, og HD048837. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. MKJ og ELJ er rektorer i NiadynePharma, Inc., som har sponset forskning forvaltes i samsvar med University of Arizona konflikt-of-interesse politikk.
Innledning
huden fungerer som en metabolsk aktiv biologisk barriere som beskytter mot ytre miljø fornærmelser. Vedlikeholdet av hudbarrieren er kritisk så mange dermatologiske sykdommer er kjennetegnet ved defekte barriereintegritet som resulterer i en redusert beskyttende kapasitet av huden. Hudbarrieren formasjon er karakterisert ved en prosess av homeostase hvor delende celler i det basale lag kontinuerlig migrere mot hudoverflaten og gjennomgår terminal differensiering og til slutt planlagt celledød under dannelse av stratum corneum sammensatt av terminalt differensierte keratinocytter og andre stoffer som danner barrieren [ ,,,0],1]. Imidlertid må epidermal proliferasjon og differensiering være nøye balansert ettersom utilstrekkelig spredning fører til en fortynning av den epidermale lag av huden og tap av barrierebeskyttelse mens økt proliferasjon uten å koordinere øket differensiering fører til forstyrrelser slik som psoriasis og hudkreft [1].
En stor miljøtrussel resulterer i flere forandringer i hudens struktur og funksjon er den eksponering for ultrafiolett lys fra solen [2]. Kronisk solenergi lys, kan det til slutt føre til epidermal hyper med nedsatt differensiering resulterer i aktinisk keratose (AK) lesjoner og plateepitelkarsinom (SCC) i huden. Den viktigste histologiske kjennetegn ved SCC er substitusjon av normale modne epidermale keratinocytter med dårlig differensierte atypiske plateepitel celler [3]. Mudgil et al. har vist i huden epidermal ekvivalenter som forvandlet, dårlig differensierte keratinocytter kan drives til å differensiere i nærvær av tilstrekkelig antall normale keratinocytter [4]. Disse observasjoner tyder på at behandlinger som kan fremme epidermal differensiering i photodamaged folie som har potensiale til å gjenopprette balansen av proliferasjon og differensiering som kreves for å opprettholde homeostase hud og således kunne motvirke utvikling av AK-lesjoner og SCC.
En av farmakologiske effekter av nikotin-syre på photodamaged hud er å fremme differensiering epidermal [5], øke muligheten for at en nikotinsyre-reseptoren kan være involvert. Reseptoren betegnes GPR109A (HM74A hos mennesker og Puma-G i mus), har nylig gitt HGNC utpeking av NIACR1, ble oppdaget i sterkt differensierte adipocytter, milt og immunceller [6], [7], [8]. GPR109A par til G-proteinene i G
i familien, en inhiberende G-protein, som ved ligandbinding signaler reduksjon av adenosin 3 «, 5»-cyklisk monofosfat (cAMP) produksjon via inhibering av adenylat cyclase i et pertussis toksin -sensitive måte [6], [7], [8]. GPR109A er medlem av en underfamilie av G-protein-koblede reseptorer (GPCR) sammensatt av GPR109A og GPR81 som begge er funnet hos mennesker og gnagere. GPR109B (også betegnet HM74) er et annet medlem av denne reseptorfamilien som binder seg riktignok med lav affinitet til nikotinsyre og er til stede bare hos mennesker. Nikotinsyre aktiverer både GPR109A og GPR109B med EC
50 verdier på 0,1 uM og 100 uM, henholdsvis [9]. Selv om det er usannsynlig at nikotinsyre er den endogene liganden av disse reseptorene, farmakologiske doser av nikotinsyre som virker gjennom GPR109A formidle både ønskede anti-lipolytic effekter samt uønskede hudreaksjoner vasodilatasjon effekter forbundet med oral nikotinsyre terapi [6], [7 ], [8], [10], [11]. Siden nikotin-syre-indusert prostanoid formasjon ansvarlig for hudens spylingen er blitt foreslått for å finne sted i dermal dendrittiske Langerhans-celler, og ekspresjon av GPR109A i hud er studert i denne forbindelse [10], [12], [13], [14] ; Imidlertid er lite kjent om funksjonene av nikotinsyrereseptorer i andre deler av huden biologi. Her undersøker vi uttrykket, cellulær distribusjon, og funksjonaliteten til GPR109A og GPR109B i hud og hud avledet celler. Våre resultater viser at squamous cellekreft har unormale GPR109A /B uttrykk, cellulær fordeling, og funksjon, noe som indikerer at disse reseptorene er involvert i huden homeostase.
Materialer og metoder
Cell Culture
Normale humane epidermale keratinocytter (NHEK, Lonza, Sveits) ble rutinemessig dyrket i EpiLife (GIBCO /Invitrogen) som inneholder menneskelig keratinocyte vekst supplement for mindre enn 10 populasjonsdoblinger. Normale humane diploide fibroblaster, CF3, (populasjonsdoblinger mindre enn 30, Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, OK), den etablerte cellelinje av udødeliggjort human epidermal keratinocytter, HaCaT, og Ras-transform HaCaT, gaver fra Dr. Norbert Fusenig ( Tysk Cancer Research Center, Heidelberg, Tyskland) [15], human epidermoid carcinoma cellelinje A-431 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA), og den squamous cell carcinoma cellelinje, SCC-25 (ATCC ) ble rutinemessig dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclone /Fisher Scientific). Alle cellene ble holdt i en fuktig atmosfære inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C.
revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
Total RNA fra fettvev, placenta , lunge, hud og ble anskaffet fra Stratagene (Cedar Creek, TX), og 1 ug av hver RNA ble brukt til å utføre cDNA-syntese ved anvendelse av TaqMan Reverse Transcription kit fra Applied Biosystems (Foster City, CA). PCR ble utført ved hjelp av følgende primere for GPR109A og GPR109B: GPR109A – frem – 5 «CACCACACAGACACACACCTCCTTGCTGG 3», GPR109B – frem – 5 «CACCATACAGACACACGCCACTTTGCTGG 3», og omvendt primer for både gener – 5 «CAGTGACATTACTCGATGCAACAGCCCAAC 3» syntetisert av Integrerte DNA Technologies (IDT, Coralville, IA). Termisk sykling var som følger: aktivering av DNA-polymerase ved 94 ° C i 1 minutt, etterfulgt av 25 sykluser med amplifisering ved 94 ° C i 1 minutt og 62 ° C og 68 ° C i 1 min hver
Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)
Total RNA fra dyrkede celler ble utarbeidet etter den RNeasy Mini Kit rensesystem (Qiagen, Valencia, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Frozen oppnådd menneskelige normal hud biopsier, AKs, og SCCS ble hentet fra prosjektet «Kjemoprevensjon for hudkreft Program Prosjekt Arkiv Prøver for Andre analyser, anmeldt av University of Arizona IRB (Tucson, Arizona), prosjektnummer 08-0201-04 . Studien som prøvene ble tatt ble gjennomført i henhold til Helsinkideklarasjonen prinsipper. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fag. Total RNA fra hud vevsprøver ble utarbeidet etter den RNeasy bindevev Mini Kit (Qiagen) etter produsentens protokoll. cDNA syntese ble utført ved hjelp av TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av tilfeldige heksamer og en mikrogram total RNA. For TaqMan-baserte QRT-PCR uttrykk profilering, ble 25 ng av hvert cDNA inkludert total RNA fra plateepitelkarsinom prøver (Asterand, Detroit, MI) lagt til iTaq Supermix (BioRad, Hercules, CA) sammen med TaqMan MGB prober i henhold til produsentens protokoll (Applied Biosystems, Foster City, California). QRT-PCR ble utført som tidligere beskrevet [16]. Prober utviklet for å spesifikt gjenkjenne menneskelig GPR109A (TaqMan Gene Expression analyse Hs02341584_s1) og GPR109B (TaqMan Gene Expression analyse Hs02341102_s1) transkripsjoner ble kjøpt fra Applied Biosystems. Sanntids fluorescens overvåking ble utført med ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). I menneskelige huden vev, glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) og β-aktin genekspresjon endret med graden av malignitet sammenlignet 18s rRNA, som forble konstant. I dyrkede celler, GAPDH og β-aktin ekspresjon forble konstant i forhold til 18S rRNA; derfor relative uttrykk nivåer av de ulike transkripsjoner ble bestemt ved sammenligning mot housekeeping gener, 18s rRNA for vev og GAPDH for dyrkede celler. Alle ekspresjons-målinger ble utført i triplikat ved anvendelse av minst tre uavhengige generert cDNA-prøver. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Relativ genekspresjon ble beregnet som tidligere beskrevet [17]. Endringer i genuttrykk ble vurdert signifikant på 1,5-ganger endring og p≤0.05.
Antistoff Generation og Rensing
For analyse av menneskelig GPR109A og GPR109B, en skikk, kommersiell antistoff ble generert på kaniner ved hjelp av et syntetisk peptid (RHHLQDHFLEIDKKNC) for å generere antisera gjenkjenner N-terminale ende av GPR109A og GPR109B (Sigma-Genosys, Woodlands, TX). Animal vedlikehold og antistoffproduksjon ble utført av Sigma-Genosys henhold til protokollen gjennomgått og godkjent av Sigma-Genosys Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC), OPRR Assurance A4182-01; USDA registreringsnummer 93-R-283. Sera var affinitet-renset ved hjelp av Pierce sin Aminolink Kit i henhold til produsentens protokoll (Rockford, IL). Antistoffene ble validert ved å vise at ekstrakter fra HeLa celler, som ikke uttrykker reseptoren, ikke viser positive immunoblotter men ekstrakter fra HeLa celler (American Type Culture Collection, Manassas, VA) transfektert med nikotinsyre reseptor viste positive band på forventet migrasjon posisjon. I tillegg CF3 celler som ikke viser reseptor uttrykk ved QRT-PCR også viste ikke positiv immunoblot. Også analyserer alle immunoblot inkluderte en kontroll som viste at peptidet mot hvilke antistoffene ble generert konkurrert ut signalet.
Immunoblotting
SDS-PAGE og Western blot analyser ble utført som tidligere beskrevet [ ,,,0],18]. Adherente cellepopulasjoner ble lysert i iskald lyseringsbuffer (150 mM natriumklorid, 50 mM natriumfluorid, 50 mM kaliumfosfat, 40 mM natriumpyrofosfat, 500 ul Triton X-100, 100 ul SDS, 200 pl 1 M Tris-HCl pH 7,4 i vann og 1 tablett komplett mini proteasehemmer cocktail, Roche Diagnostics, Indianapolis, iN) for 30 min ved 4 ° C. Lysatene ble deretter sentrifugert ved 12000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjonen i lysatene ble bestemt ved anvendelse av BCA ™ Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL) i henhold til produsentens instruksjoner. Tyve mikrogram protein, ble tilsatt til 4 x lastebuffer (250 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 20% glyserol, 0,012% bromfenolblått, 4% β-merkaptoetanol), oppvarmet til 95 ° C i 5 minutter, elektroforese på 12,5 % SDS-polyakrylamidgeler, og overført til PVDF-membraner (Amersham, Piscataway, NJ). Alle membraner ble blokkert i 1 time med 5% ikke-fettholdig melk i Tris-buffret saltvann (TBS) pluss 0,1% Tween-20 (10 mM TBS-T, pH 7,4) og inkubert over natten ved 4 ° C i primære antistoff eller ved primær -antistoff pluss 1000 molart overskudd peptid (anvendt for å danne antistoffet) i forhold til antistoff, inkuberes i 5% ikke-fettholdig melk TBS-T i 24 timer før bruk. Membraner ble inkubert og utviklet i Immobilon ™ Western Chemiluminescent HRP substrat (Millipore, Billerica, MA) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter innledende blotting, ble membraner reprobed for β-aktin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) for å sikre jevn lasting. Blotter ble skannet og analysert med ImageJ versjon 1.39u programvare (NIH, Bethesda, MD). Verdier rapportert for target proteiner ble normalisert til de blotter respektive p-aktin nivåer i minst tre uavhengige eksperimenter.
Immunocytochemistry (ICC)
CF3, NHEK, HaCaT, Ras-transform HaCaT, A-431, og SCC-25-celler ble dyrket på dekkglass. For fiksering ble cellene skylt to ganger med TBS, inkubert i 4% formaldehyd i TBS i 30 minutter, og skylt to ganger med TBS. Å merke GPR109A /B-reseptorer, ble endogen biotin blokkerende utføres ved hjelp av NeutrAvidin ™ Biotin-Binding Protein (Pierce) i 30 minutter ved romtemperatur. Umiddelbart etter ble cellene inkubert i 3% bovint serumalbumin oppløst i TBS (BSA-TBS) blokkeringsbuffer i 1 time og inkubert over natten ved 4 ° C med primært antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer (01:10). For peptid konkurrerende eksperimenter ble et 1000 gangers overskudd av peptid inkludert. Den følgende dag ble cellene vasket 3 ganger i 5 minutter hver med TBS. Den blokkerende trinnet ble gjentatt, og cellene ble inkubert i 01:25 biotin-SP-konjugert AffiniPure geit-anti-kanin IgG (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) i 30 minutter ved 37 ° C. Objektglassene ble vasket med TBS og inkubert i 1:25 Streptavidin Quantum Dot 605-konjugater (Millipore) i 45 minutter ved 37 ° C. Etter grundige vask med TBS, ble dekk monteres ved hjelp av monteringsmedium som inneholdt 90% glyserol og 10% TBS. De immun Platene ble plassert ved 4 ° C og visualisert neste dag under et fluorescens mikroskop.
Immunhistokjemi (IHC)
Immunohistokjemisk påvisning av GPR109A /B ble utført på parafininnstøpte seksjoner fra normal menneskelig hud biopsier. Arkivert materiale fra en studie utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen prinsipper anmeldt av integ omtale Ethical Review Board, Austin, TX. Alle fag opplest og undertegnet en IRB-godkjent Samtykke Form. Alle deltakerne, de som administrerer tiltakene, og de som vurderer resultatene ble blindet for gruppeoppgave. Parafininnstøpte snitt ble deparaffinized i xylen og hydrert i en gradert serie av alkohol ble snittene neddykket i sitronsyre i et vannbad ved 87 ° C i 20 minutter for å forbedre antigen gjenfinning. Snittene ble deretter skyllet i TBS og blokkert i 3% BSA-TBS i 20 minutter. Umiddelbart etter blokkering ble snittene inkubert i primært antistoff i 3% BSA-TBS (01:10) over natten ved 4 ° C. For peptid konkurrerende eksperimenter ble et 1000 gangers overskudd av peptid inkludert. Den følgende dag, snitt ble vasket i TBS, blokkerte nok en gang, og det ble inkubert i 01:25 biotin-SP-konjugert AffiniPure geit-anti-kanin IgG (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) i 30 minutter ved 37 ° C. Snittene ble skylt med TBS og inkubert i 1:25 Streptavidin Quantum Dot 605-konjugater (Millipore) i 45 minutter ved 37 ° C. Etter grundige vask med TBS, ble dekk monteres ved hjelp av monteringsmedium som inneholdt 90% glyserol og 10% TBS. For peptid konkurrerende eksperimenter ble snittene vasket i TBS og inkubert i 1:1000 FITC geit anti-kanin IgG (Jackson Immunoresearch Laboratories) i 1 time ved RT.
IHC analyse av caspase 14 og filaggrin som er involvert ved bruk av fremgangsmåter analoge antistoff SC5628 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) for caspase 14 og 3137-500 (Abcam, Cambridge, MA) for filaggrin. Kvantifisering av antistoff-farging ble utført som beskrevet tidligere [5].
cAMP-analysen
NHEK, HaCaT, Ras-transform HaCaT, A-431, SCC-25, og CF3-celler ble sådd ved en tetthet på 25.000 celler i 35 mm kulturskåler. To dager senere ble kulturmediet fjernet og erstattet med kulturmedium innehold ± 100 ng /mL pertussis toksin (inkubert over natten), ± 10 uM forskolin i nærvær eller fravær av nikotinsyre ved forskjellige konsentrasjoner i 1 time før testing. Med unntak av dose-responsstudier, den endelige konsentrasjonen av nikotinsyre som ble anvendt var 100 pM. Måling av intracellulære cAMP-nivåer ble utført ved hjelp av syklisk AMP Komplett EIA Kit (Analyse Design, Ann Arbor, MI) i henhold til produsentens instruksjoner. Forsøkene ble gjentatt tre ganger med uavhengige cellekulturer. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra tre separate forsøk.
Resultater
Nikotinsyre fremmer epidermal differensiering i photodamaged menneskelig hud
Kronisk UV eksponering fører til nedsatt epidermal differensiering og økt epidermal spredning som kan resultere i aktinisk keratose og plateepitelkreft kreft i huden [19]. Vi har tidligere konkludert med at myristyl nicotinate (MN), et prodrug som leverer nikotinsyre til huden, fremmer epidermal differensiering med tilhørende forbedret hud barrierefunksjon i kronisk photodamaged huden som bedømmes av endringer i epidermal og stratum corneum tykkelse, redusert forekomst av transepidermal vanntap og øker i minimal erythemal dose [5]. For å undersøke effekten av MN på differensiering mer direkte, ble to epidermal differensiering markører, caspase 14 og filaggrin [20] vurderes hos pasienter med huden photodamage i en placebokontrollert klinisk studie [5]. Fig. 1A viser et eksempel på biopsiprøver farget ved start og etter 12 ukers topisk påføring av en formulering inneholdende 5% Mn og fig. 1B viser kvantifisering av caspase 14 og filaggrin i pasienter behandlet med placebo eller MN formuleringer. Tilstedeværelsen av MN resulterer i en økning i forhold til placebo på omtrent 30% for caspase 14 og 20% for filaggrin. Placebo formuleringen erstattes myristylmyristat for MN, utelukker eventuelle effekter av myristylalkohol som er generert som nikotinsyre er frigjort fra prodrug.
Tissue matriser av huden biopsiprøver fra en klinisk studie av effekten av myristyl nicotinate (MN) hos mennesker med photodamaged hud [5] ble farget i de terminale differensiering markører caspase 14 og filaggrin. Panel A: Et eksempel på en biopsiprøve ved start og etter 12 ukers behandling MN farget med H E, og farging for caspase 14 eller filaggrin. Panel B: Kvantifisering av farging for placebo (n = 27) og MN behandlet (n = 31) grupper for caspase 14 og filaggrin. Studenter t-test ble brukt for å sammenligne med placebo og MN behandlet grupper og p-verdiene vises.
nikotinsyre reseptor gener er uttrykt i normal menneskelig hud
Å fremme epidermal differensiering av nikotinsyre førte oss å karakterisere nikotinsyre reseptorene i menneskelig hud som en antatt nikotinsyre mål. Gener som koder for både høy affinitet (GPR109A) og lav affinitet (GPR109B) former av nikotinsyre-reseptoren er blitt beskrevet tidligere, og ekspresjonen av disse genene har blitt rapportert i huden [6], [12], [21], men meget minimal karakterisering Det er rapportert. PCR-analyse viste ekspresjon av gener som koder for nikotinsyrereseptorer i fettvev, placenta, og lunge (fig. 2A), vev tidligere vist å uttrykke begge reseptorformene [6], [7], [8], [10], [12 ]. Fig. 2A viser også at transkripsjoner for både høy og lav affinitet former av reseptoren ble lett påvist i human hud og HaCaT-celler. Svært lite signal ble påvist i CF3 dermal hud fibroblaster (den lyse delvis signalet vist for GPR109A representerer sannsynligvis forurensning fra HaCaT kjørefelt som det ikke ble observert i gjentatte forsøk). De relative nivåer av ekspresjon i human hud undersøkt ved QRT-PCR viser at genet som koder for høy affinitet formen av reseptoren uttrykkes ved omtrent 2,2 ganger høyere nivå enn det lave affinitet form (fig. 2B).
Panel A: RT-PCR ble utført på total RNA fra fettvev, placenta, lunge, hud og vev og celler ved hjelp av primere som var spesifikke for GPR109A (øverste rad) og GPR109B (nederste rad) som beskrevet i Materialer og Metoder. Panel B: QRT-PCR ble utført på total RNA fra seks forskjellige normale menneskelige huden vev ved hjelp av sonder spesifikke for GPR109A (mørk grå kolonne) og GPR109B (lys grå kolonne) reseptorer som beskrevet i Materiale og metode. Studenter t-test ble brukt for å sammenligne GPR109A til GPR109B, * p≤0.05. Panel C: QRT-PCR analyser ble utført på total RNA fra ti menneskelige plateepitelkarsinom vev ved hjelp av sonder spesifikke for GPR109A (mørk grå søyler) og GPR109B (lys grå søyler) reseptorer. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM. Studenter t-test ble brukt for å sammenligne med normal menneskelig hud, * p≤0.05.
nikotinsyre reseptor gener blir over-uttrykt i plateepitelkreft hudkreft
uttrykk for både GPR109A og GPR109B forhold til den for normal hud ble undersøkt i squamous cellekreft (SCC) på ulike stadier av progresjon (fig. 2C). Trinn I SCC prøver viser en svak økning i mRNA-ekspresjonen av GPR109A, mens GPR109B mRNA-ekspresjon ikke er signifikant forhøyet. I fase II og IIB tumorer, er GPR109A mRNA-ekspresjon forhøyet ca. 3 ganger så lenge GPR109B uttrykk igjen forblir lik den i normal hud. I fase III og i unstaged tumorer gradert som «SCC invasive», er begge reseptor ekspresjonsprofiler hevet opp til 16-ganger i forhold til normalt humant hudvev. Generelt økt uttrykk av GPR109 genene øker med stadium av kreft progresjon.
nikotinsyre reseptor gener er transkribert og oversatt i hud cellelinjer
Ulike hud cellelinjer ble undersøkt ved qRT- PCR for GPR109A /B genekspresjon og resultatene ble sammenlignet i forhold til normale primære humane epidermale keratinocytter (NHEK). Udødeliggjort epidermale keratinocytter (HaCaT-celler), tumorigene epidermale keratinocytter (Ras-transform HaCaT), en epidermoid vulva-karsinom-avledet cellelinje som tidligere er rapportert å inneholde nikotinsyrereseptorer (A-431), og en human squamous cell carcinoma cellelinje (SCC- 25) uttrykker mRNA for begge reseptorer (fig. 3A). Over-ekspresjon i forhold til NHEK er observert opp til 40 ganger i hud kreftceller i forhold til NHEK (fig. 3A). I kontrast til uttrykk av nikotinsyre reseptorer i dermis-avledet normale humane diploide fibroblaster (CF 3) er umulig å oppdage
Panel A:. QRT-PCR ble utført på total RNA fra normale menneskelige epidermal keratinocytter (NHEK), udødeliggjort human epidermale keratinocytter (HaCaT), udødeliggjorte Ras-transformerte humane epidermale keratinocytter (Ras-transform HaCaT), humane epidermoide karcinomaceller (A-431), squamous cell carcinoma celler (SCC-25) og humane diploide fibroblaster (CF3), ved hjelp av prober spesifikke for GPR109A (mørk grå søyler) og GPR109B (lys grå søyler) reseptorer. Studenter t-test ble brukt til å sammenligne med NHEK, * p≤0.05. Paneler B og C: Protein Expression of GPR109A og GPR109B i Human hudceller. Celleekstrakter fra NHEK (spor 1), HaCaT (spor 2), Ras-transform HaCaT (spor 3), ble A-431 (spor 4), og SCC-25 (felt 5) underkastet SDS-PAGE og Western-Immunoblotanalyse analyser ved bruk av et antistoff mot GPR109A /B pre-inkubert i fravær (felt B) eller nærvær (felt C) av 1000-ganger overskudd av peptidet mot hvilket antistoffet ble generert i forhold til renset antistoff. p-aktin ble benyttet som en lastekontroll for Western immunblotanalyser. En representant blot er vist av tre uavhengige forsøk. De relative tettheter ble kvantifisert ved hjelp ImageJ. Grafisk fremstilling viser den gjennomsnittlige densitometriske enheter av tre uavhengige forsøk. Studenter t-test ble brukt til å sammenligne med NHEK, * p≤0.05.
For å finne ut om nikotinsyre reseptor transkripsjoner er oversatt, undersøkte vi celleekstrakter for GPR109A /B protein ved hjelp av en anti-peptid-antistoff utviklet og karakterisert i vårt laboratorium (se Materialer og amp; Methods). Dette antistoffet er rettet mot en sekvens nær den N-terminale ende er felles for begge reseptorer og skiller ikke mellom de meget homologe GPR109A og GPR109B proteiner. Western blot-analyser viser at nikotinsyre-reseptor-protein ble påvist i alle cellelinjene som ble undersøkt ved den forventede størrelse for de to nikotinsyrereseptorer (~42 kDa) (Fig. 3B). Peptidet anvendt for å danne antistoffet effektivt konkurrerte antistoffet signal, demonstrerer selektiviteten antistoff (Fig. 3C). Mengden av protein i forhold til p-aktin er høyere i de udødeliggjort, transformerte og ondartede cellelinjer undersøkt sammenlignet med NHEK.
Nikotinsyre reseptorer i human hud er til stede i epidermis og hårsekken
for å bestemme cellulær lokalisering av GPR109A /B i menneskelig hud, ble farging utførte analyser. Vi observerte at GPR109A /B er uttrykt fra basal laget gjennom spinous og granulære lag av epidermis og i hårsekkene av normale menneskelige huden (fig. 4A). Høyere forstørrelse (Fig. 4B) avslører at GPR109A /B ekspresjon synes å være mer jevnt fordelt gjennom hele cellen i basalcellelagene av epidermis og viser en mer perifer fordeling i spinous og granulære lag hvor keratinocyter er i senere stadier av terminal Differensiering. En alternativ fluoriserende kode, fluoresceinisotiocyanat (FITC), for påvisning av anti-peptid-antistoff-binding er brukt i fig. 4C for å demonstrere at peptidet anvendt for å danne antistoffet effektivt blokkerte binding i disse vevene (fig. 4D).
Immunhistokjemi (IHC)-analyser ble utført på parafininnstøpte menneskelig hud seksjoner som benytter antistoff mot GPR109A /B. Paneler A og B benyttes streptavidin Quantum Dot 605 Konjugater for deteksjon. Paneler C og D benyttes FITC Goat Anti-Rabbit IgG for deteksjon. Panel A: Representant farging prøven vist på 200 × forstørrelse. Panel B: Representant IHC prøven vist på 400 × forstørrelse. Panelene C og D: Representative IHC prøvene er vist ved 400 x forstørrelse i fravær (felt C) eller nærvær (panel D) av konkurranse med peptidet anvendt for å danne antistoffet. Forkortelser: SC, stratum corneum; SG, stratum granulosum; SS, stratum spinousum; SB, stratum basale. Størrelse markør representerer 2 mikrometer.
Nikotinsyre reseptor cellulær lokalisering varierer mellom dyrkede epidermal cellene
NHEK celler ble farget med anti-peptid-antistoff (Fig. 5A) og peptid konkurranse blokkert farging (fig. 5B). Farging vises på periferien av aggregater av celler som danner «brostens strukturer» mens isolerte cellene synes å ha en mer diffust mønster av merking (fig. 5A). I HaCaT-celler, er GPR109A /B uttrykk hovedsakelig lokalisert til periferien (fig. 5C). I motsetning til dette, i Ras-transform HaCaT (fig. 5D), A-431 (fig. 5E) og SCC-25 (fig. 5F) plasmamembranen lokalisering er ledsaget av merking over hele cytoplasmaet. Reseptorekspresjon i hudfibroblaster, CF3, ikke påvises (resultater ikke vist)
Panelene A og B:. Immunocytochemistry (ICC) analyser som benytter et antistoff mot GPR109A /B ble utført på NHEK vist i rødt og fusjonert med atom DAPI flekker i blått. Panel A viser farging ved hjelp av GPR109A /B-antistoff og Panel B viser farging i nærvær av 1000 gangers overskudd av peptider som brukes til å heve antistoffet. Panel C: HaCaT, Panel D: Ras-transform HaCaT, Panel E: A-431, Panel F: SCC-25. For alle paneler, forstørrelse var 400 × og størrelsesmarkør representerer 10 mikrometer.
Normale keratinocytter demonstrere en funksjonell G protein-koblet nikotinsyre reseptor signalisering gjennom G
i hvis funksjon er redusert i hudkreft cellene
fleste karakterisering av funksjonaliteten av nikotinsyrereseptorer har blitt studert i celler som ikke naturlig uttrykker reseptorene, men i hvilket reseptorgener blir transfektert og over-uttrykt. I våre studier, undersøkte vi indre reseptor-funksjonalitet ved å måle evnen av nikotinsyre for å hemme forskolin-stimulert cAMP-dannelse i fravær av heterolog ekspresjon. Under disse betingelser, det relative bidrag av nikotinsyresensitiv cAMP-dannelse er mindre enn det i transfekterte celler. Forskolin behandling fremkalte cAMP-dannelse i alle cellene undersøkt med en opphopning av 170-200 pmol cAMP per mg protein i et 1 timers inkubasjon og nærvær av 100 pM nikotinsyre inhiberte forskolin indusert cAMP-produksjon differensielt i de forskjellige celletyper ( fig. 6A). Den relative grad av inhibering i de forskjellige cellelinjer ved nikotinsyre er vist i fig. 6B. Hemming av cAMP dannelsen av nikotinsyre gjennom den iboende reseptorer var ca 44% i NHEK celler, 43% i HaCaT og 39% i Ras-transform HaCaT celler. I motsetning til dette, cAMP stimulert av forskolin ble signifikant redusert i den tumor-avledede celler. Nikotinsyre inhiberte bare 23% i A-431-celler og 13% i SCC-25-celler. Fig.
