Abstract
Nuclear apoptose-induserende faktor 1 (NAIF1) ble tidligere rapportert å indusere apoptose. Videre er ekspresjon av NAIF1 ble signifikant nedregulert i humane magecancer vev i forhold til tilstøtende normale vev. Imidlertid er mekanismen ved hvilken den NAIF1 genet induserer apoptose ikke fullt ut forstått. Våre resultater viser at NAIF1 var minimal uttrykt i alle de testede magecancercellelinjer. Våre data viser også at NAIF1 er lokalisert i kjernen av celler som detektert ved å overvåke den grønne fluorescensen av NAIF1-GFP-fusjonsprotein ved hjelp av fluorescerende konfokal mikroskopi. Deretter ble en sammenlignende proteomikk fremgangsmåte som kan benyttes for å identifisere den differensielle ekspresjonen av proteiner mellom gastrisk cancer-cellelinjer MKN45 /NAIF1 (-) og MKN45 /NAIF1 (+). Vi fant fem proteiner (proteasomer 26S subenheten 2, proteasome 26S subenheten 13, NADH dehydrogenase Fe-S protein 1, chaperonin inneholder TCP1 underenhet 3 og tioredoksinreduktase 1) som var oppregulert og tre proteiner (ribonukleasehemmer 1, 14-3- 3 protein epsilon isoform og apolipoprotein AI bindende protein) som ble nedregulert i MKN45 celler som overuttrykker NAIF1. Vi har også oppdaget at NAIF1 kan indusere cellesyklus arrest i G1 /S fase ved å endre uttrykket av cellesyklusproteiner cyclinD1, cdc2 og p21. De differensielt uttrykte proteiner identifisert her er relatert til ulike cellulære programmer som involverer cellesyklus, apoptose, og signaltransduksjon regulering og tyder på at NAIF1 kan være en svulst suppressor i magekreft. Vår forskning gir bevis for at belyser hvilken rolle hvordan NAIF1 funksjoner i magekreft
Citation. Yang M, Zhong J, Zhao M, Wang J, Gu Y, Yuan X, et al. (2014) Overuttrykte Nuclear apoptose-induserende faktor en endret proteomikk Profile of Human Gastric Cancer Cell MKN45 og Induced cellesyklus arrest i G1 /S-fase. PLoS ONE 9 (6): e100216. doi: 10,1371 /journal.pone.0100216
Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu «, Italia
mottatt: 27 oktober 2013; Godkjent: 23 mai 2014; Publisert: 13 juni 2014
Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av National Key Basic Research Program of China (2007CB914700). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste kreftformen i verden som forårsaker ca. 8% og 10% av årlige krefttilfeller og dødsfall, henholdsvis. Ifølge den verdensomspennende epidemi rapport fra Verdens helseorganisasjon, er nesten en million magekrefttilfeller og 738,000 dødsfall anslått å ha skjedd i 2008 [1], [2]. Mange forsøk har blitt tatt i klinisk; imidlertid fremdeles så høy som 70% dødelighet av magekreftpasienter [2]. En årsak til dette høy dødelighet er at mage kreftpasienter er ofte ikke diagnostisert før avansert stadium, som er for sent å gi effektiv behandling. Derfor er det et klart behov for å finne nye biomarkører og effektive strategier for tidlig diagnose og behandling av magekreft.
Proteomics har vært brukt i mange forskningsområder, blant annet kreftforskning. Vanlige prøver i proteomikk analyse for kreftforskning omfatter vev og blod fra kreftpasienter, samt kreftcellelinjer med ulike bakgrunner eller forskjellige behandlinger [3] – [6]. Disse proteomikk analyser ble brukt for å undersøke opprinnelse og utvikling av kreft eller å lete etter diagnostiske biomarkører. Resultatene vi oppnås gjennom proteomic metoder er ikke bare på grunn av direkte regulering av transkripsjonsnivået, men også reflektere post-translasjonelle modifikasjoner av proteiner [3], [7]. Derfor kan vi analysere både ekspresjon og regulering av protein med proteomic analyser. Til tross for mange nye teknikker, har to-dimensjonal elektroforese kombinert med massespektrometri forble den mest brukt metode for proteomikk analyse.
Den menneskelige genet som koder for kjernefysisk apoptose-induserende faktor 1 (NAIF1) ligger på kromosom 9q34.11 . NAIF1 koder for et protein med en
Myb
-lignende domene ved dets N-terminale region [8], [9]. Tidligere studier har vist at overekspresjon av NAIF1 i humane kreftcellelinjer HeLa og MKN45 induserer apoptose [8], [10]. Videre fant Luo
et al Hotell som NAIF1 er betydelig uttrykt i normal mage vev, mens uttrykket er nedregulert eller tapt i mage kreft vev. (
P
0,001). I tillegg NAIF1 uttrykk var høyere i godt differensiert (
P
= 0.004) enn i moderately- eller dårlig differensiert magekreft [10]. Imidlertid er rollen til NAIF1 i regulering av celleprotein ekspresjonsprofilen er ukjent.
I den foreliggende undersøkelse har vi anvendt proteomikk teknologi basert på to-dimensjonal elektroforese i kombinasjon med MALDI-TOF massespektrometri for å identifisere proteiner forbundet med den biologiske funksjoner av NAIF1. De protein uttrykk profiler av magekreft cellelinje, MKN45 med eller uten NAIF1 overekspresjon ble analysert og sammenlignet ved bruk av 24 cm pH 3-10 NL range immobilisert pH-gradient (IPG) strimler. For å validere disse dataene, vi målte RNA uttrykk nivåer av alle ulikt uttrykte proteiner og tre proteinene ble ytterligere bekreftet ved Western blotting. Våre resultater viser at NAIF1 induserer cellesyklus arrest i G1 /S fase ved å regulere uttrykket nivåer av cyclinD1, cdc2 og p21 protein. Resultatene fra vår studie kan føre til en bedre forståelse av hvordan NAIF1 fungerer i indusere apoptose og kan også kaste lys over diagnostisering og behandling av mage kreft i fremtiden.
Materialer og metoder
cellekultur og transfeksjon
Menneskelige mage kreft cellelinjer MKN45, BGC823, AGS og SGC7901 ble hentet fra tumor Cell Bank of Chinese Academic of Medical Sciences og dyrket i flytende Dulbeccos minimum Essential medium (DMEM) supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS), 100 IU /ml penicillin, ved 37 ° C 100 ug /ml streptomycin i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. DNA transfeksjon ble utført ved hjelp av X-tremeGENE HP DNA transfeksjon reagens (Roche, Sveits) i henhold til produsentens instruksjoner.
Ekspresjonsplasmider
ekspresjonsplasmider pEGFP-N1-NAIF1, som uttrykker en NAIF1-GFP-fusjonsprotein, og pEGFP-N1, som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP), ble vennligst tilveiebrakt av Dr. Qing Luo [10].
cellesyklusfordeling analyse
Eksponensielt voksende -celler ble transfektert med pEGFP-N1-vektoren eller den pEGFP-N1-NAIF1 plasmid. Cellene ble høstet ved 24 timer eller 48 timer etter transfeksjon, og 1 x 10
6-celler ble vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) og fiksert med 4% paraformaldehyd ved 4 ° C i 1 time. Etter sentrifugering, cellepelletene ble resuspendert i fargeløsning (0,05 mg /ml propidiumjodid (PI), 0,2 mg /ml RNase og 0,1% Triton X-100) ved 4 ° C i 15 min i mørket. Flowcytometri analyse for GFP og PI ble utført ved hjelp av en BD LSR II celle analysator (BD, San Jose, CA, USA). PI fluorescens ble målt mellom GFP positive cellepopulasjonen og fordelingen av cellesykluser ble analysert ved hjelp ModFit LT3.2 programvare. Tre separate prøver ble fremstilt og alle analyser ble utført i tre eksemplarer.
Kvantifisering av apoptose
Kvantifisering av apoptose ble utført ved bruk av PE Annexin V Apoptose Detection Kit I (BD). Kort sagt ble BGC823 eller MKN45 celler transfektert med pEGFP-N1-vektoren eller den pEGFP-N1-NAIF1 plasmid. Etter 24 timer eller 48 timer etter transfeksjon, ble cellene høstet, vasket med kald PBS to ganger og deretter resuspendert med bindingsbuffer (10 mM Hepes /NaOH (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl
2) . Re-suspenderte celler ble inkubert med Phycoerythrin (PE) konjugert Annexin V (AV) og 7-amino-Actinomycin (7-AAD) og deretter målt ved strømningscytometri bruk av BD LSR II celle analysator. Fire forskjellige cellepopulasjoner kunne påvises i en dot-plot: levedyktige celler (AV
– /7-AAD
-), tidlig-fase apoptotiske celler (AV
+ /7-AAD
– ), sen-fase apoptotiske celler (AV
+ /7-AAD
+) og nekrotiske celler (AV
– /7-AAD
+). Et minimum på 10 000 GFP-positive celler ble tellet pr prøve og data ble rapportert som den prosentandelen av apoptotiske celler (AV
+ /7-AAD
– og AV
+ /7-AAD
+ ) blant totalt celler. Tre uavhengige prøve forberedelser ble gjort, og alle analysene ble gjentatt tre ganger.
Confocal skanning
Førti-åtte timer etter transfeksjon ble cellene vasket tre ganger med PBS og fiksert med 4% paraformaldehyde for 15 min. ved romtemperatur. For å forbedre permeabiliteten av cellemembranen, ble celler inkubert med 0,5% Triton X-100, etterfulgt av inkubering med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) å flekke kjernene. Cellulær fordeling av NAIF1 ble analysert ved å overvåke den grønne fluorescensen av NAIF1-GFP-fusjonsprotein ved hjelp av et Leica Microheidelberg GmbH mikroskop.
Protein forberedelse for 2-DE
For hver prøve ble 5 x 10
6-celler ble høstet og lysert i 1 ml lyseringsbuffer (7 M urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS, 20 mM DL-ditiotreitol (DTT), 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 30 mM natriumfluorid, og 0,25 mg /ml RNaseA) i 1 time ved romtemperatur, og deretter sentrifugert ved 4 ° C i 30 minutter. ved 12.000 rpm. Supernatanten ble overført til et nytt rør, og konsentrert med 0,1 M NH
4COOH. Lyseringsbuffer ble tilsatt til et sluttvolum på 800 pl, og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av en Bradford-analyse (Tiangen, Beijing, Kina).
To-dimensjonal elektroforese
To-dimensjonal elektroforese ble utført som tidligere beskrevet [5]. I korte trekk, ble 1 mg protein ble fortynnet til 450 ul med rehydratisering buffer (7 M urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS og 20 mM DTT). IPG strimler (IPG, 24 cm, pH 3-10, NL, GE Limit.) Ble rehydrert med rehydrated prøver for 18 timer ved romtemperatur. Proteinene ble underkastet isoelektrisk fokusering med en Ettan IPGphorIII (GE, CT, USA) suksessivt i 1 time ved 100 V, 1 time ved 250 V, 1 time ved 500 V, 1 time ved 1000 V, 1 time ved 3000 V, 1 time ved 5000 v, 2 timer ved 8000 v, og 6 timer ved 8000 v for å få en total på 80 KVH. Etter den isoelektrisk fokusering, ble IPG strimler ekvilibrert med ekvilibreringsbuffer I (6 M urea, 150 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% glycerol, 2% SDS, 1% DTT) i 15 minutter. etterfulgt av en andre inkubasjon med en annen ekvilibrerende buffer II (6 M urea, 150 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% glycerol, 2% SDS, 2,5% jodacetamid) i 15 min. Den andre-dimensjonen av SDS-PAGE ble utført med 12,5% SDS-PAGE-geler ved hjelp av Ettan Dalt SIX vertikale systemer (GE).
Gel farging og bildeanalyse
SDS-PAGE gels ble fikset i å fikse-buffer (10% CH
3COOH, 40% C
2 H
5OH, og 50% DDH
2o) i 30 min. Gelene ble deretter vasket i DDH
2O i 10 minutter. 3 ganger og farget med Coomassieblå G-250.
De geler ble skannet med et bilde skanner bruker MagicScan programvare for å evaluere spot mønstre. Imagemaster platina (versjon 5.0) ble benyttet for å analysere gel bildene. Flekkene som ble observert både på styre gelen og NAIF1 gel ble analysert og intensiteten av hver flekk ble kvantifisert ved å beregne stedet volum etter normalisering av gelen bildet. Kvantitativ analyse av gel bilder (tre gjentak /prøve) ble tatt og flekker med statistisk signifikante forskjeller (t-test, *
P
0,05). Ble skåret ut og fordøyd for identifikasjon
Protein identifikasjoner
forskjellig uttrykt protein flekker ble hentet og de-farget i 50 mM NH
4HCO
3 /acetonitril (50/50) og tørket ved vakuum sentrifugering. Gelstykkene ble deretter spaltet med 10 ng /ml trypsin (Promega, WI, USA) i 50 mM NH
4HCO
3-buffer ved 37 ° C over natten. Trypsin væske ble overført til et rent rør, fortynnet med 100 pl 60% acetonitril /0,1% trifluoreddiksyre, og behandlet med ultralyd i 15 minutter, tre ganger. All den ervervede væske ble oppsamlet og vakuumtørket og lagret ved -80 ° C. De eluerte peptider ble analysert ved hjelp av en Bruker Ultraflex MALDI-TOF /TOF utstyrt med SCOUT kilde ved BGI-Beijing. Resultatene av massespekteret ble kontrastert mot pattedyr sekvenser fra den (ikke-redundante) database NCBInr for peptid mass fingerprinting identifikasjon.
RNA Isolation, RT og Real-time Q PCR
Total RNA var ekstraheres ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. cDNA ble syntetisert ved revers transkripsjon ved å bruke en mikrogram total RNA med oligo (dT)
18 primere og M-MuLV revers transkriptase (TAKARA).
For revers transkripsjonen PCR primere for NAIF1 og β-actin var som følger: NAIF1 forstand, 5′- AGCCACGGTCACCCTGACACA-3 «, og anti-sense, 5’CGTGTCTGCATGCTGGGCCAT-3′; p-aktin forstand, 5»- GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 «, og anti-sense, 5’AGCGAGCATCCCCCAAAGTT. Alle primere ble utformet ved hjelp NCBI blast og kjøpt fra Sangon, Beijing.
Kvantitativ PCR ble utført med SYBR Grønn qPCR Kit (TAKARA, Japan) med en 20 ul reaksjonssystem satt opp i henhold til produsentens instruksjoner. Målgenet ekspresjon ble analysert ved hjelp av passende sanntids qPCR primere (tabell 1). β-aktin ble benyttet for normalisering. Sanntids qPCR ble utført på en ABI7300 cycler (ABI, MA, USA) med følgende betingelser: denaturering 30 s ved 95 ° C, etterfulgt av 40 sykluser av denaturering i 5 s ved 95 ° C, og forlengelse for 31 s ved 60 ° C. Smelting kurve analyse ble utført på slutten for å bekrefte spesifisiteten av det forventede PCR-produkt. Relativ ekspresjon ble beregnet ved hjelp av de to standardkurve metoder. Tre uavhengige prøver ble fremstilt for hver tilstand, og hvert eksperiment ble utført in triplo.
Western blotting
Western blotting ble utført som tidligere beskrevet. Kort sagt ble 2 x 10
6-celler høstet med mediumstrømmen, pelletert ved sentrifugering i 5 min ved 500
g
, og vasket 3 ganger med PBS. Cellene ble deretter lysert med 100 ul lysebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,5% NP-40, 0,1% SDS og 50 pg /ml PMSF, med ferskt tilsatt proteinase-inhibitor cocktail) på is i 30 minutter. Lysatene ble sentrifugert ved 13000 rpm i 15 min. og proteinkonsentrasjonen ble målt under anvendelse av Bradford fremgangsmåter. Femti mikrogram proteiner ble separert på 12% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid-membraner. Membranene ble blokkert med 5% BSA i TBST i en time ved romtemperatur fulgt av inkubering med primær antistoffløsninger i henhold til produsentens instruksjoner (β-actin, 1:5000, Sigma; NAIF1, 1:1000, Santa Cruz; 14- 3-3 ε, 1:500, Santa Cruz, TCP1-γ, 1:1000, Abcam; TXNRD1, 1:1000, Abcam; CyclinD1, 1:1000, CST, cdc2, 1:500, CST, og p21, en :500, CST). Membranene ble vasket 3 ganger med TBST, fulgt av inkubering med passende sekundære antistoffer i to timer ved romtemperatur. Signalene ble påvist ved anvendelse av ECL Chemiluminescence system. β-actin ble ansatt som kontroll.
Statistical Analysis
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 13.0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Data ble uttrykt som middel ± SD. Den t-test ble brukt for statistisk sammenligning. Et tilknyttet verdien av
P .
0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
transfekterte NAIF1 lokalisert i nucleus
Begge reversere transkripsjons PCR og Western blotting eksperimenter viste at NAIF1 var minimal uttrykt i mage kreft cellelinjer, MKN45, BGC823, AGS, og SGC7901; mens NAIF1 ble lett oppdaget da det ble transfektert inn i cellene (Fig. 1A og B). Vi transfektert en NAIF1-GFP-fusjons konstruksjon inn i MKN45 og BGC823 celler og et GFP vektor ble anvendt som kontroll. Konfokal mikroskopi viste at når cellene ble transfektert med pEGFP-N1-NAIF1 konstruksjonen, ble grønn fluorescens detektert bare i kjernene; Tvert imot, ble den grønne flurescent signal som detekteres gjennom hele cellen når transfektert med GFP-vektoren (fig. 1C). De samme resultater ble også observert i andre cellelinjer så som BGC823 (figur S1). Disse resultatene bekreftet at transfekterte NAIF1 proteinet er lokalisert i kjernen.
(A) Revers transkripsjons-PCR viser NAIF1 uttrykkes ikke på RNA-nivået i de undersøkte celler. Plasmid inneholdende NAIF1-genet ble anvendt som et templat for den positive kontrollen og DDH
2O ble anvendt som templat for negativ kontroll. (B) Western blotting viste at NAIF1 ikke uttrykkes på proteinnivået i de fire testede magecancercellelinjer. MKN45-celler som overuttrykker NAIF1-GFP-fusjonsprotein ble anvendt som positiv kontroll. Den transfekterte NAIF1 bånd ble påvist mellom proteinmolekylvektmarkørene 55 og 75 kD; mens ingen bånd ble påvist mellom 40 og 55 kD, som er den forutsagte posisjonen til NAIF1 proteinet. (C) subcellulære fordeling av NAIF1. MKN45-celler ble transfektert med enten NAIF1-GFP-fusjonskonstruksjon eller GFP vektor. De tre øverste bildene representerer NAIF1-GFP-fusjonsprotein er fordelt bare i kjernen, mens bildene nedenfor representerer GFP fordeles gjennom hele cellen.
NAIF1 indusert cellesyklus-stans ved G1 /S-fasen
cellesyklusen profilen av magekreftceller under påvirkning av NAIF1 ble neste undersøkt. GFP-positive celler ble analysert for å sikre korrekt populasjonen ble anvendt (figur S2). Strømningscytometrisk analyse viste at NAIF1 induserte en betydelig endring i fordelingen av cellesyklusen: en økning av cellepopulasjonen i G0 /G1 fase og en reduksjon i S-fasen ble observert i celler som overuttrykker NAIF1 sammenlignet med celler transfektert med den tomme vektor, både etter transfeksjon 24 timer og 48 timer. Som vist i fig. 2A, strømningscytometri viste at 24 timer etter transfeksjon ble omtrent 54% av BGC823 celler transfektert med pEGFP-N1-vektoren var i G0 /G1 fase, og 34% og 12% av cellene i S-fasen og G2 /M fase, respektivt . På den annen side, i BGC823 celler transfektert med pEGFP-N1-NAIF1 konstruere var det en klar økning i prosentandelen av celler i G0 /G1 fase (74%), så vel som en reduksjon i prosentandelen av celler i S-fasen (26%) og G2 /M fase (0%). Førtiåtte timer etter transfeksjon, ca. 36% av de BGC823 kontrollcellene var i G0 /G1 fase, og 59% og 5% av cellene i S-fasen og G2 /M fase hhv. I BGC823 celler transfektert med pEGFP-N1-NAIF1 konstruere, ca. 55% av cellene var i G0 /G1 fase, og 37% og 8% av cellene i S-fasen og G2 /M fase, respektivt. I MKN45-celler, 24 timer etter transfeksjon, ca. 56% av celler transfektert med pEGFP-N1-vektoren var i G0 /G1 fase, og 29% og 15% av cellene i S-fasen og G2 /M fase, respektivt. Omtrent 76% av MKN45 celler transfektert med pEGFP-N1-NAIF1 konstruksjonen var i G0 /G1 fase, og prosentandelen av celler i S-fasen og G2 /M fase ble redusert til 24% og 0%, respektivt. Førtiåtte timer etter transfeksjon ble omtrent 43% av MKN45 kontrollcellene var i G0 /G1 fase, og 43% og 14% av cellene i S-fasen og G2 /M fase, respektivt. I MKN45 celler transfektert med pEGFP-N1-NAIF1 konstruere, ca. 56% av cellene var i G0 /G1 fase, og 28% og 16% av cellene i S-fasen og G2 /M fase, henholdsvis (fig. 2B). Disse resultatene viser tydelig at overekspresjon av NAIF1 indusert cellesyklus arrest i G1 /S-fasen av magekreftceller BGC823 og MKN45.
(A) og (B) Søylene viser de ulike cellesyklusfordeling mellom celler transfektert med NAIF1 og med GFP vektoren 24 timer eller 48 timer etter transfeksjon i (A) BGC823 celler, og (B) MKN45 celler. For å sikre riktig befolkningen, ble GFP-positive befolkningen analyseres. * Signifikant forskjell (
P
0,05). (C) Western blotting viser endringen i cellesyklusregulerende proteiner forbundet med NAIF1 indusert G1 /S-fasen cellesyklus-stans. β-aktin ble benyttet som kontroll. Kvantifiserte data er vist som gjennomsnitt ± SD (n = 3); Signifikant forskjell fra NAIF1 overekspresjon gruppe, Student t test, * P. 0,05
For å klargjøre den mekanismen som NAIF1 indusert cellesyklus arrest, undersøkte vi de mulige roller cyclinD1, p21 og cdc2 proteiner , noe som er viktig i cellesyklusregulering i G1 /S-fasen. Førti-åtte timer etter transfeksjon, ble uttrykket nivåer av cyclinD1 og cdc2 redusert sammenlignet med kontrollceller, både i BGC823 og MKN45 celler. I tillegg ble uttrykket nivåer av p21 økt (figur. 2C).
Comparative proteomikk analyser av magekreft cellelinje MKN45 med eller uten ekstra uttrykk for NAIF1 protein
proteinprofiler MKN45 celler transfektert med pEGFP-N1-NAIF1-konstruksjoner som den behandlede gruppe eller med pEGFP-N1 vektor som kontrollgruppen ble målt ved hjelp av to-dE 48 timer etter transfeksjon. Totalt ble over 700 flekker løst, hvorav 11 proteiner var 1,5 ganger uttrykt forskjellig som bestemt ved analyse med Imagemaster versjon 5.0. De differensielt uttrykte protein flekker ble skåret ut fra gelen, og 8-proteiner ble identifisert ved MALDI-TOF /TOF analyse. Representative behandlet og kontroll gruppe 2-DE gel kart er vist i fig. 3A og forskjellig uttrykt protein flekker er merket. Megascopic 2-DE gel bilder av hvert av de differensielt uttrykte protein flekker er representert i fig. 3B og 3C. Fem av de proteinene var oppregulert i den behandlede gruppen inkludert NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 1 (NADUSF1), chaperonin inneholder TCP1 subenheten 3 (TCP1-γ), tioredoksinreduktase 1 (TXNRD1), proteasome 26S subenheten 2 ( PSMC2) og proteasomer 26S subenheten 13 (PSMD13). 3 proteiner ble nedregulert, inkludert ribonuklease inhibitor 1 (RNH1), 14-3-3 protein epsilon-isoform (14-3-3 ε) og apolipoprotein A-I-bindende protein (APOAIBP). Tabell 2 viser spesifikk informasjon om disse proteinene og deres nivå av differensial uttrykk.
(A) Representant 2-DE kart MKN45 celler transfektert med kontroll plasmid eller NAIF1. (B) og (C) Megascopic bilder og relativ intensitet volum av differensial uttrykte proteiner. (B) representerer oppregulert protein poeng mens (C) representerer nedregulert proteiner.
Validering av ulikt uttrykte proteiner
Sanntids qPCR og vestlig blotting ble utført for å verifisere de to-dE resultater. Genuttrykk nivåer av de identifiserte proteiner ble analysert ved hjelp av sanntids-qPCR og er i overensstemmelse med de to-DE resultater, bortsett fra ett protein, 14-3-3ε (fig. 4A). Tre proteiner ble valgt basert på deres betydning og sannsynlige funksjoner for videre analyse ved western-blotting for å verifisere 2-DE resultater. Resultatene viser at proteinet uttrykket nivåer av TXNRD1 og TCP1-γ ble signifikant økt i NAIF1-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (
P
0,05), mens protein ekspresjonsnivået av 14-3-3ε var betydelig redusert i NAIF1 gruppe (
P
0,05) (figur 4B.). Totalt sett de vestlige blot resultatene er konsistent med 2-DE resultater.
(A) Verifisering av 2-DE resultatene etter sanntid qPCR. * Signifikant forskjell (
P
0,05) ** signifikant forskjell (
P
0,001). (B) Verifisering av 2-DE resultater ved western blotting og den relative volum intensiteten av differensial uttrykte proteiner, ved hjelp av β-aktin som kontroll. * Signifikant forskjell (
P
0,05).
Diskusjoner
Flere studier har blitt utført for å beskrive NAIF1 genet; Men lite er kjent om proteomikk profilen NAIF1 er overexpressed. Målet med denne studien var å påvise og identifisere proteiner som uttrykk endres i MKN45 celler som overuttrykker NAIF1. Videre er bevis anordnet for å forklare hvordan NAIF1 funksjoner i indusering av celle apoptose og andre aktiviteter. En 2-DE-strategi ble anvendt i denne studien på grunn av sin praktiske metoder og høy effektivitet. Totalt, vi har oppdaget og identifisert 5 proteiner som ble oppregulert og 3 proteiner som ble nedregulert i MKN45 celler som overuttrykker NAIF1 sammenlignet med kontrollgruppen. De identifiserte proteiner som involverer en rekke fysiologiske aktiviteter, for eksempel proteindegradering, kontroll av celle-redoks-homeostase, cellesyklusprogresjon, cytoskjelettet regulering, cellulære stressrespons, apoptose og regulering av metabolismen. Cellesyklus profilen av magekreft cellelinjer, BGC823 og MKN45 ble også undersøkt, og resultatene viste at overekspresjon av NAIF1 kan indusere cellesyklus arrest i G1 /S-fasen via forandre uttrykket nivåer av cellesyklus regulering proteiner cyclinD1, cdc2 og p21 .
Resultatene fra western blotting og omvendt transcriptional PCR viste at NAIF1 var minimal uttrykt i magekreftceller. Dataene presentert her er analog med Luo funn i vev [10]. Videre fikk vi bekreftet at NAIF1 er en kjernefysisk protein i magekreftcellelinjer MKN45 og BGC823. Siden genomisk DNA hovedsakelig foreligger i kjernen, antyder disse data at NAIF1 kan fungere i kjernen ved å samhandle med genomisk DNA og nukleoprotein for å påvirke ekspresjon av gener og proteiner grundig. Av denne grunn vi utført proteomikk analyse for å undersøke proteomikk profilering av MKN45 celler som overuttrykker NAIF1.
Unormal regulering av cellesyklus er en bemerkelsesverdig karakteristisk for kreftceller [11]. Studier har vist at mange små molekyler kan aktivere cellesykluskontrollpunkter og indusere cellesyklusstans, noe som tillater cellene å reparere defekter. Imidlertid kan mislykket repairation fører til apoptose [12] – [15]. Våre resultater viser at NAIF1 induserer cellesyklus-stans ved G1 /S-fasen. Overgang fra G1 til S-fasen krever aktivering av sammenstillingen av cyklinD-Cdk4 /6 og cyclinE-cdc2 (også kjent som Cdk1). I mellomtiden, hemmer p21 aktiviteten av cdc2 og medierer montering og aktivering av cyklinD-cdk4 /6 i cytoplasma, samt hemmer deres aktivitet i cellekjernen [16]. I denne studien ble western-blotting-analyse oppdaget at proteinet ekspresjonsnivåer av cyclinD1 og cdc2 ble redusert, mens protein ekspresjonsnivået av p21 ble øket i celler som overuttrykker NAIF1. Disse resultatene tyder på at G1 /S cellesyklus-stans fremkalt av NAIF1 er mediert gjennom p21 og cyclinD1 pathway. I tillegg demonstrerte vi at 48 timer etter transfeksjon, populasjonen av apoptotiske celler økte med ca. 10% i celler som overuttrykker NAIF1 som et resultat av cellesyklus-stans (figur S3).
26S-proteasomet er en konservativ organell i alt eukaryote celler og den er ansvarlig for intracellulær proteinnedbrytning [17]. Proteiner som blir degradert av 26S proteasomet er involvert i en rekke biologiske prosesser, inkludert apoptose, cellesyklus, og vekst og regulere ekspresjonen av mange gener som i sin tur regulerer andre fremgangs [18]. Forstyrrelse av proteinnedbrytingen likevekt fører til opprinnelsen og utvikling av kreft. Det er således 26S-proteasomet et attraktivt mål kreftterapi. Her fant vi at to subenheter av 26S proteasome, PSMC2 og PSMD13, var både oppregulert i MKN45 celler som overuttrykker NAIF1. PSMC2 og PSMD13 er subenheter av 19S proteasome, som er den regulatoriske partikkel (RP) av 26S proteasomet. PSMC2 er en ATPase mens PSMD13 er en ikke-ATPase. Noen forskere mener at 26S proteasomhemmingen kan føre til apoptose av karcinomceller, og proteasomhemmere kan anvendes for å behandle kreft [19] – [21]. Men en studie av Tan
et al.
Tyder på at tumor nekrose faktor (TNF) -α aktiverer 26S proteasomet system med opp-regulerer uttrykket nivåer av 26S proteasomet subenheter [22]. TNF-α er et velkjent cytokin som kan indusere apoptose i en rekke kreftceller, og nå er det brukt i klinikken som en regional behandling av lokalavansert bløtvevssarkomer og metastase melanomer å unngå for amputasjon lemmer [23]. Som TNF-α, NAIF1 har også evnen til å indusere apoptose, hvilket innebærer at den 26S-proteosomet kan være involvert i apoptose prosess indusert av NAIF1.
Våre data viser også at to proteiner, TXNRD1 og NDUFS1, er oppregulert ved NAIF1. TXNRD1 regulerer redoks-tilstanden til protein tioler i pattedyrceller, og funksjoner i både fremme og forebygge kreft i forskjellige typer karsinomer [24] – [27]. Det er ikke gjort studier for å undersøke hvilken rolle TXNRD1 i magekreft. Etter vår mening kan TXNRD1 delta i undertrykkelse av magekreft genesis eller oppregulering av TXNRD1 kan være en adaptiv mekanisme som svar på oksidativt stress generert av overekspresjon av NAIF1. Den NDUFS1-genet koder for et 75 kDa Fe-S-subenhet, noe som er en av de syv mitokondrie-subenhetene av komplekset I [28]. Komplekset I er den største av de respiratoriske kjeden enzymer og mangel av kompleks I er den viktigste årsak til en serie av medfødte mitokondrielle sykdommer, slik som Leigh syndrom [29]. I tillegg er det 75 kDa subenheten av komplekset I er et caspase substrat, som er involvert i den mitokondrielle apoptose pathway. Caspase spaltning av NDUFS1 er nødvendig for flere mitokondrielle forandringer assosiert med apoptose, inkludert ATP-nivåer, ROS-produksjon og tap av plasmamembranintegritet og så videre [30]. Siden NAIF1 induserer apoptose via mitokondrielle veien [8], hypoteser vi at oppregulering av NDUFS1 deltar i prosessen apoptose indusert ved NAIF1.
TCP1-γ har blitt identifisert som et chaperonin i eukaryot cytosol. Tidligere forskning har funnet ut at TCP1-γ er betydelig uttrykt i svulster leverkreft i forhold til de sammenkoblede tilstøtende ikke-maligne svulst vev [31], [32]. Imidlertid er forholdet mellom TCP1-γ og magekreft fortsatt ukjent og videre studier er nødvendig.
På den annen side har vi identifisert tre proteiner, 14-3-3ε, RNH1 og APOAIBP, som var ned- regulert i MKN45 celler som overuttrykker NAIF1. 14-3-3 er en proteinfamilie består av multifunksjonelle proteiner som binder til og modulerer funksjonene til et bredt utvalg av cellulære proteiner.
