Abstract
E-vitamin δ-tokotrienol har vist seg å ha antitumoraktivitet, men den nøyaktige molekylære mekanismen som hemmer proliferasjonen av kreftceller er fortsatt uklar. Her, demonstrerte vi at δ-tokotrienol som utøves signifikant cellevekst-inhiberende bukspyttkjertelkreft ductal (pdca) celler uten å påvirke normale human pankreatisk duktus epitelial cellevekst. Vi viste også at δ-tokotrienol-indusert veksthemming skjedde samtidig med G
en celle-syklus arrest og økt p27
Kip1 atom akkumulering. Dette funnet er viktig med tanke på at tap av kjernefysisk p27
Kip1 uttrykk er et veletablert negativ prognostisk faktor i PDCA. Videre δ-tokotrienol inaktivert RAF-MEK-ERK signalering, en vei kjent for å undertrykke p27
Kip1 uttrykk. For å avgjøre om p27
Kip1 induksjon er nødvendig for δ-tokotrienol hemming av PDCA celleproliferasjon, vi stabilt forstummet
CDKN1B
genet som koder for p27
Kip1, i MIAPaCa-2 PDCA celler og viste at p27
Kip1 lyddemping trykt cellesyklus arrest indusert av δ-tokotrienol. Videre δ-tokotrienol indusert p27
Kip1 mRNA uttrykk, men ikke dens protein degradering. p27
Kip1 genet promoter aktivitet ble indusert av δ-tokotrienol gjennom arrangørens E2F-en bindingssetet, og denne aktiviteten ble dempet ved E2F-1 uttømming hjelp E2F-en liten interfering RNA. Til slutt, redusert spredning, formidlet av Ki67 og p27
Kip1 uttrykk ved δ-tokotrienol, ble bekreftet
in vivo
i en naken mus xenograft bukspyttkjertelkreft modell. Våre funn viser en ny mekanisme, avhengig av p27
Kip1 induksjon, der S-tokotrienol kan hemme spredning i PDCA celler, noe som gir en ny begrunnelse for p27
Kip1 som en biomarkør for δ-tokotrienol effekt i bukspyttkjertelen kreftforebygging og terapi
Citation. Hodul PJ, Dong Y, Husain K, Pimiento JM, Chen J, Zhang A, et al. (2013) Vitamin E δ-Tocotrienol induserer p27
Kip1-Dependent Cell-Cycle Arrest i kreft i bukspyttkjertelen celler via en E2F-1 avhengige mekanismen. PLoS ONE 8 (2): e52526. doi: 10,1371 /journal.pone.0052526
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 23 juli 2012; Godkjent: 15 november 2012; Publisert: 05.02.2013
Copyright: © 2013 Hodul et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av National Institutes of Health (NIH) tilskudd K12 klinisk Scholar i Oncology stipend (til PJ Hodul) og ved Moffitt Foundation tilskudd (Kurtz Pledge 09-33412-06-01, GI kreftforskning 09-33412-07- 01, og Steinmann Family Foundation 09-33412-08-05). Dette arbeidet ble også støttet av NIH tilskudd 1R01 CA-129227-01A1, 5RO1 CA-098473-05, DAVOS 69-15099-99-01 (MP Malafa) og Bankhead-Coley 08BR-02. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Denne studien innebærer intellektuell eiendom der M. Malafa og S. Sebti er navngitt som oppfinnere. Drs. Malafa og Sebti og Moffitt kreftsenter er berettiget til å motta lisensiering inntekter fra utnyttelsen av slik åndsverk. En USA patentsøknaden ble innlevert 26. juni 2007 med tittelen «Delta-Tocotrienol behandling og forebygging av kreft i bukspyttkjertelen» (OTML docket nummer 06A069). Den intellektuelle eiendom inkludert i patentsøknad er lisensiert til BioGene Life Science, et Singapore-basert selskap. Denne lisensavtalen gir BioGene Life Science rettigheter til Dr. Malafa oppdagelse. BioGene Life Science er et heleid datterselskap av Davos Life Science. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest dødelige kreftformer i USA, rangering fjerde blant de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall [1]. Til tross for utviklingen behandling, har dødeligheten for pasienter med bukspyttkjertelkreft samlet forble uendret i flere tiår. Undersøkelser nye behandlingsformer og chemopreventive agenter er tydelig garantert.
Studier har antydet at økt inntak av kosttilskudd frukt, grønnsaker og korn kan redusere bukspyttkjertelkreft risiko [2], [3], [4]. Tokotrienoler, som finnes i korn, utgjør en av de mest overbevisende grupper av anti-tumor bioaktive forbindelser [5]. Tokotrienoler er en gruppe på fire (α-, β-, δ-, γ-) umettet, naturlig forekommende vitamin E-forbindelser som ikke bare hemmer formeringen av en rekke humane tumorceller, inkludert bryst, tykktarm, lunge og hepatocellulær [ ,,,0],6], [7], [8], men også oppviser kjemopreventive egenskaper [9], [10]. Men hvordan tokotrienoler dempe tumor spredning er dårlig forstått.
Vi har tidligere vist at δ-tokotrienol viser den mest potente anti-tumor aktivitet blant de fire tokotrienollignende isoformer i kreft i bukspyttkjertelen celler [11], [12]. I en pågående fase I doseeskalerings Jeg klinisk studie i bukspyttkjertelen kreftpasienter, foreløpige funn viste at δ-tokotrienol hadde ingen åpenbar toksisitet ved opptil 3200 mg /dag, noe som er 5 ganger spådd biologisk aktive klinisk dose [13]. Disse funnene understreker løftet om δ-tokotrienol for kreft i bukspyttkjertelen intervensjon. For ytterligere å oversette disse funnene i klinikken, er det viktig å identifisere relevante biomarkører for δ-tokotrienol aktivitet for tidligfase hypoteser-drevet kliniske studier.
For å oppnå dette, undersøkte vi hvordan δ-tokotrienol hemmer kreft i bukspyttkjertelen cellevekst og identifisert cyklin-avhengig kinase (CDK) inhibitor p27
Kip1 som et molekylært mål for δ-tokotrienol. p27
Kip1 fungerer som en tumor suppressor ved sin evne til å blokkere celleformering. p27
Kip1 er et atypisk tumor suppressor fordi mutasjoner i sitt genet er ekstremt sjeldne. Likevel har kreftceller utviklet seg andre mekanismer for å inaktivere p27
Kip1, blant annet økt proteolytisk nedbrytning og utelukkelse fra kjernen. Faktisk har p27
Kip1 tap vært assosiert med kreft i bukspyttkjertelen progresjon og dårlig prognose [14], [15], [16], [17]. Her rapporterer vi for første gang at p27
Kip1 spiller en sentral rolle i δ-tokotrienol-indusert G
1 arrest. Vi har også observert at induksjon av p27
Kip1 av δ-tokotrienol skjer på transkripsjonsnivå involverer E2F-1-mediert promoter aktivering og mRNA induksjon.
Materialer og Metoder
Kjemi
Renset δ-tokotrienol ble opprinnelig levert av Dr. Barry Tan (Hadley, MA) (90% δ-tokotrienol og 10% γ-tokotrienol, IC
50: 15-20 μΜ) og senere av Davos Livet Sciences (Singapore) (97% δ-tokotrienollignende, IC
50: 50 μΜ) oppløst i etanol som en stamløsning og fortynnet til ønsket konsentrasjon med DMEM
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og kultur
MIAPaCa-2, SW1990, og BxPC-3 kreft i bukspyttkjertelen celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket til ~70% konfluens i DMEM supplert med 10% FBS. HPDE6 C7, et menneske pankreasgang epitelcellelinje udødeliggjort av transduksjon med E6 /E7 gener av HPV-16 (sjenerøst gitt av Dr. Ming-Sound Tsao, University of Toronto, Ontario, Canada [18]), ble dyrket i serum- fritt keratinocyt medium som tidligere beskrevet [18]. Muse embryonale fibroblaster (MEFs) som har stabil uttrykk for p27
Kip1 (+ /+) og p27
Kip1 (- /-) ble gitt av Dr. Pledger (Moffitt kreftsenter) [19], [20] og dyrket i DMEM med 10% FBS.
Transfeksjon og Generation of Stabile Clones
MIAPaCa-2 /shRNA p27
Kip1 og MIAPaCa-2 /vektor ble generert ved trans MIAPaCa-2 celler med p27
Kip1 shRNA allerede klonet inn pSuperiorRetroPuro vektor (OligoEngine, Seattle, Washington), en slags gave fra Dr. J. Chen (Moffitt kreftsenter) [21]. Stabile puromycin-resistente kloner ble valgt. Transfections ble utført med Metafectene (Biontex Laboratories, Planegg, Tyskland), per produsentens protokoll.
siRNA knockdown av p27
Kip1 i MIAPaCa-2 celler
Pre-designet, siRNA til CDK inhibitor 1B (p27
Kip1, # 118714) og uspesifikk siRNA (# 4611) ble kjøpt fra Ambion (Austin, TX). MIAPaCa-2-celler ble sådd ut over natten i 12-brønners plater uten antibiotikum. Transient transfeksjon av siRNA ble utført ved hjelp av Oligofectamine reagens (Invitrogen, Carlsbad, California), i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk, 5 nM p27
Kip1 siRNA eller tak siRNA ble blandet med Opti-MEM-medium (Invitrogen) til et totalvolum på 90 ul og deretter kompleksdannet med 2 mL av Oligofectamine og 8 ul Opti-MEM (totalt volum av komplekset var 100 ul). Før transfeksjon ble det gamle mediet kassert, ble cellene vasket med friskt Opti-MEM, og 400 ul av frisk Opti-MEM ble plassert i hver brønn før tilsetning av RNA-Oligofectamine kompleks. Etter 8 timer ble 500 ul DMEM inneholdende 30% FBS og ingen antibiotika tilsatt til hver brønn, og cellene ble ytterligere inkubert i 40 timer. Etter 40 timers transfeksjon, ble cellene behandlet med δ-tokotrienol i ytterligere 24 timer og høstet for trypanblått og Western blot-analyse.
proteinekstraksjon og Western blot-analyse
Dyrkede celler ble lysert i pattedyr protein Ekstraksjonsreagens (Pierce, Rockford, IL), per produsentens protokoll. Antistoff mot p27
Kip1 ble kjøpt fra BD Biovitenskap (San Jose, California). Membranene ble blokkert i enten 5% melk i PBS (pH 7,4) inneholdende 0,1% Tween 20 og 1% bovint serumalbumin (BSA) i TBS (pH 7,5) inneholdende 0,1% Tween 20. fosfo-spesifikke antistoffer ble inkubert i 2% BSA i TBS (pH 7,5) inneholdende 0,1% Tween 20; alle andre antistoffer ble fortynnet i 5% melk i PBS (pH 7,4) inneholdende 0,1% Tween 20 over natten ved 4 ° C. Pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) ble fortynnet i 5% melk i enten PBS (pH 7,4) inneholdende 0,1% Tween 20 eller TBS (pH 7,5) inneholdende 0,1% Tween 20 ved en fortynning 1:1000 i 1 time ved romtemperatur. Western blot ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence (Pierce). Vi brukte beta-aktin monoklonalt antistoff (katalog # 8H10D10) fra Cell Signa å sikre lik protein lasting og uttrykk.
Anchorage uavhengig Vekst Analyser
For myke agar vekstanalyser, celler ble sådd ved 1 x 10
3 celler /brønn i triplikat i 12-brønners kulturskåler i 0,35% agar i løpet av en 0,6% agar lag. Forskjellige konsentrasjoner av δ-tokotrienol eller bærer ble inkludert i 0,3% agar lag av celler. Kulturer ble matet og behandlet med forbindelse eller kjøretøy ukentlig inntil koloniene vokste til en passende størrelse for observasjon (~3-4 uker). Kolonier ble fotografert etter inkubasjon med 1 mg /ml MTT over natten og telles. Vekst av δ-tokotrienol-behandlede kolonier ble sammenlignet med kjøretøy behandlede kolonier (kontroll). Tre separate eksperimenter ble utført.
FACS og celleproliferasjonsanalyse
Eksponensielt voksende pankreas-celler ble dyrket til 70% konfluens i 96-brønners plater og inkubert med økende konsentrasjoner av δ-tokotrienol eller bærer for 24-72 timer. Brønner ble undersøkt for cellevekst og proliferasjon ved anvendelse av MTT kolorimetrisk analyse. IC
50 resultater for hver cellelinje ble bestemt for hver 24-timers tidspunkt. For celle-syklusanalyse, ble pankreas-celler dyrket til 70% konfluens i 100 mm-plater og deretter Serum sultet i 48 timer for å tillate synkronisering. Etter 48 timer ble mediet aspirert og friskt medium med δ-tokotrienol (IC
50) eller bærer ble tilsatt i 24 timer. Behandlet medium ble deretter oppsamlet, monolagene ble vasket med kald PBS, ble cellene trypsinert, og cellepelletene ble oppsamlet. Cellepelletene ble vasket to ganger med PBS, fiksert i kald metanol, og ettervaskes med PBS for å fjerne metanol. Etter resuspensjon i 300-500 ul PBS ble cellene spaltet med 20 mikrogram /ml RNase og cellulær DNA ble farget med propidiumjodid (50 ug /ml) av 3-timers inkubasjon ved romtemperatur i mørket. Cell-syklus fordeling ble analysert ved flowcytometri ved hjelp av en fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) system (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).
Konfokalmikroskopi Analyse
Behandlet MiaPaCa-2 celler (50000) per 250 ul av 20% FBS-PBS ble tilsatt til hver cytofunnel sporet og sentrifugert ved 570 rpm i 5 minutter ved høy akselerasjon. Objektglassene ble fjernet og lufttørket ved romtemperatur. Celler ble fiksert i 4% paraformaldehyd i 10 minutter, vasket tre ganger med 1 x PBS med omrøring i 5 minutter /vask, og deretter permeabilisert i 0,5% Triton X-100 i 5 minutter ved romtemperatur. Celler ble blokkert med 2% PBS-BSA (100 ul) i 30 minutter, og p27
Kip1 antistoff (1 :500) fortynning fremstilt i 2% BSA ble brukt direkte. Platene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur i en lukket fuktig kammer. Cellene ble deretter vasket tre ganger med 1 x PBS med omrøring i 5 min /vask. Sekundært antistoff (Alexa Fluor 594) i PBS (1:500) ble utarbeidet og lagt til faste celler. Platene ble igjen inkubert i en time ved romtemperatur i lukket fuktig kammer, og deretter vasket tre ganger med 1 x PBS i 5 min /vask. Vectashield (50 ul) med DAPI ble tilsatt, og dekkglassene ble anvendt. Etter inkubasjon ved 4 ° C i mørke forhold, ble lysbilder undersøkt under et konfokal mikroskop.
cytosoliske og Nuclear Protein Extraction
Proteiner ble hentet ved hjelp av NE-PER Kjerne- og Cytoplasmatiske Ekstraksjonsreagens Kit (Pierce ). Behandlede MIAPaCa-2-celler ble isolert som 20-pl pakket cellevolum (40 mg) i 1,5 ml mikrosentrifugerør av 5 minutters sentrifugering ved 500 x g. Supernatanten ble fjernet, cellepelletene ble tørket, og is-kald CER-1 inneholdende proteaseinhibitorer (200 ul) ble tilsatt. Rørene ble virvlet kraftig i 15 sekunder og inkubert på is i 10 minutter. Deretter ble iskald CERII (11 ul) tilsatt til rørene som ble vortex-blandet i 5 sekunder og inkubert på is i ett minutt, vortex-blandet på nytt i 5 sekunder, og deretter sentrifugert ved 14 000 x g i 5 minutter. Supernatant (cytosolisk ekstrakt) ble overført til friske pre-kjølte rør og lagret ved -80 ° C. Vi resuspendert den uoppløselige pellet inneholdende kjerner i 100 ul iskald NER inneholdende proteaseinhibitorer. Rørene ble virvlet i 15 sekunder og holdt på is i 10 minutter. Dette trinn ble gjentatt fire ganger (40 minutter). Rørene ble sentrifugert ved 14000 x g i 10 minutter, og supernatanten (kjerneekstrakt) ble overført til pre-kjølte rør og lagret ved -80 ° C.
Luciferase Assay Reporter
MIAPaCa-2- cellene ble sådd ut i 6-brønns plater ved 2 x 10
5-celler /brønn. Hver brønn ble transfektert neste dag med to mikrogram av p27
Kip1 luciferase reporter plasmid (full-lengde p27
Kip1-1609, forskjellige 5 «delesjonsmutanter av mus p27
Kip1 promoter luciferase reporter, eller pGL- 3 basis cDNA tom vektor, alle plasmider som tilbys av Dr. Pledger) sammen med siRNA E2F-en eller ikke-target siRNA (Santa Cruz). Metafectene ble brukt som transfeksjon reagens, i henhold til produsentens instruksjoner. Lysates ble samlet 24 timer etter δ-tokotrienol behandling (IC
50 50 mikrometer). Luciferase-aktivitet ble målt ved hjelp av luciferase-analysesystemet kit (Promega). For normalisering av transfeksjonseffektivitet, 200 ng av Renilla reniformis luciferase ekspresjonsplasmid (PRL-TK vektor, Promega) ble inkludert i transfeksjon.
RT-PCR-analyse
MIAPaCa-2-celler ble sådd i 6-brønners plater og behandlet med δ-tokotrienol (IC
50 50 uM) eller bærer (som kontroll) i 24 timer. Cellene ble deretter høstet i 1X lysis buffer, og RNA ble isolert ved hjelp Allprep RNA /protein kit i henhold til produsentens anvisninger (Qiagen, Valencia, CA). Revers transkripsjon av totalt RNA ble utført ved anvendelse av Superscript III sett (Invitrogen). De følgende forover og revers primere, respektivt, ble anvendt for PCR-reaksjon: for p27
Kip1, 5′-TAACCCGGGACTTGGAGAAG og 5′-GCTTCTTGGGCGTCTGCTC for å forsterke et 450 bp-produkt; for aktin, til 5′-GCTCGTCGTCGACAACGGCT og 5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC forsterke en 353-bp produkt. For å unngå overforsterking, p27
Kip1 mRNA-ekspresjonsnivåer ble bestemt ved RT-PCR ved forskjellige amplifiseringscykluser (20, 25, 30, og 40 PCR-sykluser), og analysert ved agarosegel-elektroforese. Representative resultater på syklus 40 er vist.
cykloheksamid Blocks proteinsyntese
Etter 12 timers δ-tokotrienol behandling (IC
50 50 mikrometer), δ-tokotrienol ble fjernet ved å skylle MIAPaCa -2 cellene tre ganger med PBS; cykloheksamid (40 pg /ml) ble deretter brukt til å blokkere proteinsyntesen. p27
Kip1 omsetningshastighet ble undersøkt med Western blot.
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av University of South Florida Institutional Animal Care og bruk Committee (Application 2805).
Anti-tumor aktivitet i Nude Mouse Xenotransplantat Modell
Vi brukte kvinnelige atymiske nakne (nu /nu) mus, 5-6 uker gamle (Charles River, Wilmington, MA), for våre dyrestudier. Dyrene ble holdt i rene bur begrenset til 4 mus per bur. Musene ble ivaretatt med god mat og vann og undersøkt på en daglig basis. Hvis svulster forstyrret ambulation, forårsaket tegn på vekttap 10%, forårsaket pustevansker, eller vokste til . 2 cm i størrelse, ble musene humant avlivet ved eksponering for økende konsentrasjoner av karbondioksid
MIAPaCa-2-celler ble høstet og resuspendert i PBS (1 x 10
6 celler /50 ul) og et like stort volum av Matrigel (BD Biosciences). Celleprøver (100 ul) ble deretter injisert subkutant i høyre flanke. Når tumorer nådde mellom 250 og 300 mm
3, ble mus randomisert i grupper på 10 og dosert ved oral tvangsforing med 0,1 ml hjelpestoff (renset olivenolje) eller δ-tokotrienol (100 mg /kg) daglig i 3 uker. Tumor volum ble bestemt to ganger per uke ved å måle lengden (
l
) og bredde (
w
) og ved å beregne volum: V = (
l
+
w
) /2 × (
l
×
w
) × 0,5236. Statistisk signifikans mellom kontroll og behandlede dyr ble bestemt ved hjelp av Student
t
-test.
Immunohistochemistry og Slide Kvantitering
Svulster fra xenograft eksperimenter ble fiksert i 4% paraformaldehyde, pH 7,2 . Etter fiksering, ble vevsprøvene behandlet i parafinblokker. De primære antistoffene anvendt i denne studien var musemonoklonalt (p27, p-MAPK, og Ki-67) antistoffer dannet mot de tilsvarende antigener av human opprinnelse i parafininnstøpte seksjoner. Immunhistokjemisk farging ble utført på en Ventana BenchMark XT (Tucson, AZ) automatisert lysbilde Stainer, ved anvendelse av 4-mikrometer tykke parafinsnitt fra hver av de representative tumorblokken valgt. Seksjonene ble deparaffinized, utvannet, og inkubert med 3% H
2o
2 for å blokkere endogen peroksidase. Etter antigen avsløre ved hjelp av proprietær CC1 løsningen i 60 minutter på nettet (standard) ved 100 ° C, ble delene inkubert med antistoffer mot p27 (Kip 1, cloneSX53G8) (proprietær fortynning, Cell Marque, Rocklin, California) og Ki-67 (proprietær fortynning, Ventana, Tucson, AZ). De inkubasjonstider var 32 minutter for p27 og Ki-67, i henhold til produsentens instruksjoner. Fosfo-P44 /42 MAPK kanin-monoklonalt antistoff (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204) (katalog nr 4376, Cell Signaling, Danvers, MA.) Ble anvendt ved en 1: konsentrasjon 200 i PSS fortynningsmidler (Ventana) og inkuberes i 32 minutter. Ventana anti-kanin-sekundært antistoff ble anvendt i 20 minutter. Seksjonene ble deretter utsatt for biotin blokk ved hjelp av en endogen Ventana biotin kit (Ventana). Seksjonene ble inkubert med biotin-merket sekundært antistoff og streptavidin-peroksidase i 30 minutter hver (DAKO Diagnostics). En oppløsning av 3,3′-diaminobenzidene tetrahydroklorid (Sigma, St. Louis, MO) ble anvendt som et kromogen, fulgt av natriumazid og 20 pl H
20
2 i 100 ml Tris-HCl (50 uM, pH 7,6). Etter lys counterstain med Harris «hematoksylin, ble seksjonene undersøkt under lysmikroskopi.
Evaluering av Flekker
immunhistokjemisk uttrykk for p27, p-MAPK og Ki-67 proteiner ble bestemt som produktet av immunfarging av intensitet og prosent av celler farget. Disse ble scoret på en 0-3 skala, med tre blir maksimal. Den immunfarging av intensitet ble scoret med ingen farging være 0, lys flekker som en, moderat farging som to, og tunge flekker som 3. prosent av cellen farget ble målt uten påvisbare flekker som 0, 1-33% som 1, 34- 66% som 2, og 67-100% i 3. slutt~~POS=TRUNC IHC minutter ble produktet fra prosenten av celler farget skår multiplisert med intensiteten stillingen, slik at for en maksimal score på 9 og en minimal score på 0.
Statistical Analysis
data~~POS=TRUNC, uttrykt som betyr ± SEM, ble analysert statistisk ved hjelp uparede t-test eller enveis variansanalyse (ANOVA) der dette er hensiktsmessig. Vi brukte GraphPad Prism versjon 5.04 for våre analyser. Statistisk signifikans ble satt til
P
. 0,05
Resultater
δ-tokotrienol hemmer forankringsavhengige og-Uavhengig cellevekst og induserer G
1 Arrest i kreft i bukspyttkjertelen celler
virkningene av δ-tokotrienol (1A) på cellevekst i MIAPaCa-2, BxPC-3, og SW1990 humane kreft i bukspyttkjertelen celler ble undersøkt ved hjelp av 3- (4,5-dimetyltiazol-2- yl) analyse -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) celleproliferasjon. Celler ble behandlet med 0-50 uM δ-tokotrienol for 24, 48 og 72 timer. Virkningene av δ-tokotrienol ble også evaluert i den ikke-transformerte humane bukspyttkjertel ductal epitelcellelinje HPDE6 C7 for å utelukke mulige cytotoksiske virkninger av δ-tokotrienol på ikke-neoplastiske celler. δ-Tocotrienol behandling inhiberte forankrings-avhengig celleproliferasjon i både en tids- og konsentrasjonsavhengig måte i humane kreft i bukspyttkjertelen celler (figur 1B); Det ble imidlertid ikke betydelig veksthemmende effekter bemerket i HPDE6 C7 celler. δ-Tocotrienol behandling også betydelig hemmet kolonidannelse i MIAPaCa-2 celler dyrket i myk agar fra 2,5 mikrometer (
P
= 0,02) (figur 1C).
A, Kjemiske strukturer av tocotrienols. B, δ-tokotrienol selektivt hemmer bukspyttkjertelkreft celleproliferasjon. HPDE6 C7 og human bukspyttkjertel cancer-cellelinjer MIAPaCa2, BXPC3, og SW1990 ble behandlet med økende konsentrasjoner av δ-tokotrienol eller kjøretøy og analysert ved MTT ved 24, 48 og 72 timer. Resultatene viser selektiv hemming av kreft i bukspyttkjertelen celler i en tids- og doseavhengig måte. C, hemmer δ-tokotrienol forankringsuavhengig vekst av transform MIAPaCa-2 kreft i bukspyttkjertelen celler. Antall kolonier ble normalisert og sammenlignet med vehikkel. * Konsentrasjon ved hvilken statistisk signifikans begynner. D, effekter av δ-tokotrienol på cellesyklusprogresjon. Kreft i bukspyttkjertelen celler og HPDE6 C7-celler ble inkubert i nærvær av δ-tokotrienol (IC
50) (grå) eller bærer (sort) som kontroll i 24 timer. Celler ble oppsamlet for bestemmelse av cellesyklusfordelingen ved FACS-analyse etter celle farging med propidiumjodid. Hver analyse viser gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. δ-Tocotrienol hemmer G
1-til-S cellecyklusprogresjonen selektivt i transformbukspyttkjertelkreft cellelinjer.
δ-Tocotrienol behandling hadde også en betydelig selektiv effekt på cellesyklusprogresjon, som demonstrert av en økning i andelen av kreft i bukspyttkjertelen celler, men ikke HPDE6 C7 celler i G
1 fase (
P
0,001 vs.
P
= 0,92) (figur 1D ). Vi fant at kreft i bukspyttkjertelen celler akkumulert i G
1 fase på bekostning av en reduksjon i S-fasen befolkningen.
δ-Tocotrienol induserer p27
Kip1 Expression og hemmer RAS-MEK -ERK signale
Regulering av intracellulære signalveier er sentral for evnen til onkogener til å fremme cellesyklus-progresjon. To store veier nært involvert i G
1-til-S travers er RAS-aktiverte RAF-MEK-ERK og PI3-AKT veier. Disse baner påvirker ekspresjon, aktivitet, eller subcellulære lokalisering av viktige komponenter i cellesyklus-maskineri som cykliner, CDK og CDK-inhibitorer, som fører til den passende aktivering av E2F-1 transkripsjonsfaktorer. En rekke midler er blitt beskrevet som regulerer G
en travers og overgang til S-fasen i kreft i bukspyttkjertelen celler, og p27
Kip1 er blitt rapportert å øke med disse midler [22], [23], [ ,,,0],24], [25], [26]. Vi bestemte derfor kinetikken av p27
Kip1 nivåer og RAF-MEK-ERK pathway aktivitet i kreft i bukspyttkjertelen celler og i HPDE6 C7 celler eksponert for δ-tokotrienol. Vi fant at δ-tokotrienol betydelig øket P27
Kip1 nivåer av 6 timer i kreft i bukspyttkjertelen celler (figur 2A). Denne økte nivået ble opprettholdt, og økte i alle cellelinjer etter 48 timer, og i forbindelse med motsvarende inhibering av aktiviteten av den aktiverte RAF-MEK-ERK signalveien, som målt ved redusert fosforylerte MEK og ERK nivået i kreft i bukspyttkjertelen celler (figur 2A ). I motsetning til dette ble det PI3-AKT-reaksjonsveien innledning indusert ved 12 timer, fulgt av etterfølgende inhibering etter 24 timer, målt ved fosforylerte AKT nivåer (figur 2A og 2B). I samsvar med den virkning på proliferasjonen, δ-tokotrienol trykkes p27
Kip1 nivåene i ikke-omformet human pankreatisk duktus cellelinje, HPDE6 C7, og hadde ingen effekt på MEK, ERK, eller AKT. Vi viste også at effekten av δ-tokotrienol var spesifikke overfor maligne celler, som δ-tokotrienol, førte ikke til P27
Kip1 nivåer eller endre MEK, ERK, eller AKT-ekspresjon i ikke-transformerte bukspyttkjertelen ductal epitelceller. Mekanismene for dette trenger videre etterforskning.
A, kreft i bukspyttkjertelen og HPDE6 C7 celler ble behandlet med δ-tokotrienol på forhånd bestemt IC
50 for hver cellelinje. Protein lysater fra 0-48 timer ble samlet og analysert ved hjelp av Western blot-analyse for Ras onkogene signaliserings mål, MEK og ERK, og p27
Kip1. Resultatene er representative for 3 uavhengige eksperimenter. δ-Tocotrienol selektivt hemmer MAP kinase signal og øker p27
Kip1 uttrykk i transform kreft i bukspyttkjertelen celler. B, MIAPaCa-2-celler ble behandlet med δ-tokotrienol på forhånd bestemt IC
50. Protein lysater fra 0-24 timer ble samlet og analysert ved hjelp av Western blot for AKT og en nedstrøms mål GSK-3β. C, MIAPaCa-2-celler ble behandlet med bærer eller δ-tokotrienol i FBS i 12 timer, og rene nukleære og cytosoliske fraksjoner ble isolert. Western blot viser økte nivåer av p27
Kip1 i δ-tokotrienollignende behandlede celler med høye konsentrasjoner i kjernen. D, samtidig, hele celler ble farget med immunfluorescens p27
Kip1 antistoff og analysert ved fluorescerende mikroskopi for p27
Kip1 lokalisering. δ-Tocotrienol lokalisert p27
Kip1 til kjernen lik den sultet tilstand, mens serum-behandlede celler viste like nivåer av p27
Kip1 i kjernen og cytoplasmaet. E, δ-tokotrienol (DT3) undertrykker tumorcellevekst fra MIAPaCa-2-celler i nærvær av tilsatt mevalonat, en metabolitt av HMG-CoA-reduktase. MIAPaCa-2-celler (i 96-brønners plater) ble behandlet i 24 timer med δ-tokotrienol eller lovastatin i fravær eller nærvær av økende konsentrasjoner av mevalonat. MTT-resultatene viser at mevalonat redder veksthemmende virkninger av lovastatin, men ikke den av δ-tokotrienol. I E, linje 1 og 7 hadde ingen δ-tokotrienol (DT3) eller lovastatin.
I tillegg til modulering av sine uttrykk nivåer, er subcellulære lokalisering også viktig i styrende p27
Kip1 funksjon. For å fungere som en cellesyklus-inhibitor, må p27
Kip1 være lokalisert i kjernen, mens dets cytoplasmatiske mislocalization favoriserer cellesyklusprogresjon og kan bidra til cellulær transformasjon [27], [28]. Figur 2C viser at p27
Kip1 verdiene øker både i cytosol og kjernefysiske avdelinger av δ-tokotrienol-behandlede MIAPaCa-2-celler i forhold til bilen. I figur 2D, observerte vi p27
Kip1 cytoplasmisk akkumulering i vehikkelbehandlede MIAPaCa-2-celler versus økt p27
Kip1 nivåer i kjernerommet i serum-sultet hvil MiaPaCa-2-celler og δ-tokotrienol-behandlede MIAPaCa- 2 celler. Enkelte forfattere har antydet at tokotrienolene modulere HMG-CoA-reduktase-aktivitet via post-transkripsjonelle tiltak, for derved å inhibere farnesylering av nedstrøms onkogene signaliserings mål, i likhet med effektene av lovastatin [29], [30], [31]. For å bestemme hvorvidt δ-tokotrienol inhiberer proliferasjon gjennom mevalonat pathway hemming, behandlet vi MIAPaCa-2-celler med δ-tokotrienol eller lovastatin og med økende konsentrasjoner av mevalonat, et nedstrøms produkt av HMG-CoA-reduktase. Tilsetning av mevalonat til S-tokotrienol-behandlede celler resulterte i noen signifikant redning fra de veksthemmende virkninger av δ-tokotrienol på MIAPaCa-2-celler (figur 2E); Men lovastatin evne til å hemme spredning ble reddet av mevalonat.
p27
Kip1 kreves for δ-Tocotrienol-Induced G
1 Arrest
For å finne ut hvilken rolle p27
Kip1 induksjon i δ-tokotrienol bukspyttkjertelkreft celleveksthemming, vi forbigående redusert p27
Kip1 uttrykk i MIAPaCa-2 celler ved hjelp av p27
Kip1 små interfererende RNA (siRNA, bekreftet av Western blot). Etter 24 timer, fravær av p27
Kip1 ekspresjon signifikant opphevet δ-tokotrienol-indusert hemming av cellevekst (figur 3A). For å bekrefte disse funnene, ble stabile cellelinjer som uttrykker p27
Kip1 kort hårnål RNA (shRNA) eller vektor laget ved hjelp MIAPaCa-2 celler. Redusert p27
Kip1 uttrykk ble bekreftet ved Western blot analyse. Figur 3B viser at nedbrytning av p27
Kip1 resulterte i resistens mot δ-tokotrienol behandling. For å undersøke om disse observasjonene kan generaliseres utover MIAPaCa-2 celler, analyserte vi stabile MEFs [19], [20] stiller p27
Kip1 knock-out eller villtype celler etter δ-tokotrienol behandling. Vi har funnet at mangel på p27
Kip1 gjengitt MEFs delvis resistente mot anti-proliferative effekter av δ-tokotrienol i denne cellelinjen (Figur 3C). Sammen utgjør disse studiene understreker viktigheten av p27
Kip1 i δ-tokotrienol-indusert G
1 arrest og viser at bidraget fra denne CDK hemmer ikke cellelinje bestemt.
A, p27
Kip1 siRNA demper δ-tokotrienol-mediert veksthemming i menneskelige MIAPaCa-2 bukspyttkjertelkreftceller.
