Abstract
Magekreft er en av de vanligste kreftformen og har en høy grad av metastaser. Vi hypotese at
NMe2 plakater (Nukleosid-difosfat Kinase 2), som tidligere har vært ansett som et anti-metastatisk genet spiller en rolle i den invasivitet av magekreftceller. Ved hjelp av en vev chip-teknologi og immunhistokjemi, viste vi at NMe2 uttrykket ble assosiert med nivåer av differensiering av mage kreftceller og deres metastaser til lymfeknuter. Når
NMe2
genprodukt ble over-uttrykt av;
in vitro
stabil transfeksjon, celler fra BGC823 og MKN45 magekreftcellelinjer hadde redusert forekomst av spredning, migrasjon og invasjon gjennom kollagen matrise, noe som tyder på en inhiberende aktivitet av NMe2 i forplantning og invasjonen av magekreft. NMe2 kunne derfor alvorlig som en risikomarkør for magekreft invasivitet og et potensielt nytt mål for genterapi for å forbedre eller indusere NMe2 uttrykk
Citation. Liu YF, Yang A, Liu W, Wang C, Wang M, Zhang L, et al. (2015) NMe2 Reduserer spredning, migrasjon og invasjon av magekreft celler å begrense metastasering. PLoS ONE 10 (2): e0115968. doi: 10,1371 /journal.pone.0115968
Academic Redaktør: Jian Cao, Stony Brook University, USA
mottatt: 18 april 2014; Godkjent: 03.12.2014; Publisert: 20 februar 2015
Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Denne studien ble støttet av programmet støtter for Chang Jiang Scholars og Innovative Research team i University (PCSIRT: IRT1137) og grunnforskning Midler til de sentrale universiteter (lzujbky-2013-ct06). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av dette manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Kreft gjenstår som en ledende årsak til død, sto for 14,1 millioner nye tilfeller og 8,2 millioner dødsfall i 2012 [1]. Antallet nye tilfeller forventes å øke 70% på verdensbasis til 22 millioner i løpet av de neste to tiårene [2]. Kreft i lunger, mage, lever, tykktarm og bryst har høyest dødelighet [3]. Gastriske kreftceller direkte kan spre seg til tilstøtende organer (lokal invasjon) slik som bukspyttkjertelen, den tversgående tykktarm, lever og milt, så vel som til fjerntliggende lymfeknuter, lunger, og benvev. Mens være to forskjellige patologiske prosesser, er lokal invasjon og fjernmetastaser sammenkoblet hvor det tidligere ofte fremmer og forplanter sistnevnte. Genetiske mutasjoner og deres avvikende produkter er viktige kjennetegn og hjelpemidlene kreftceller for spredning, resistens mot apoptose, lokal invasjon, metastaser, immununndragelser, angiogenese, og svar på DNA-skader.
NME plakater (Nukleosid- difosfat kinase to eller uten metastaser Cells) representerer en gruppe av kreftrelatert og /eller kreftregulerende gener.
NME
består av en familie av 10 gener som også er kjent som
NM23
genene [4] og har vært forbundet med å undertrykke kreft metastase og invasjon til lokale vev [5]. Blant medlemmene i dette genet familie,
NME1 Hotell og
NMe2
har blitt grundig studert for deres kreft-undertrykke aktiviteter.
NMe2
, som er kartlagt på kromosom 17q21 [6,7], koder for B-subenheten av det nukleosid difosfat (NDP) kinase [4]. Dens produkt er blitt rapportert å hemme metastase av brystkreft og melanom-celler; og en nedgang i dens ekspresjon ble korrelert med en større metastatisk potensial av disse kreftformene [8,9]. Men
NMe2
overekspresjon var også assosiert med dårlig prognose for neuroblastom og osteosarkom [10,11]. Videre er
NMe2
genet ble ikke korrelert med metastasering av endometrial lever og thyroideakarsinom [12-14]. Disse tilsynelatende motstridende data tyder på at NMe2 kan ha forskjellige effekter på ulike typer kreftceller og deres evne til lokalt invadere omkringliggende vev eller metastaserer til eksterne organer.
På grunn av disse forskjellige NMe2 aktiviteter på ulike krefttyper, vi analysert vev kirurgisk fjernet fra pasienter med magekreft og tilknyttet den NMe2 uttrykk i disse vev med sine patologiske egenskaper. Dette patologi studien ble supplert med
in vitro
eksperimenter, hvor vi undersøkt forekomst av spredning, migrasjon og invasjon av mage kreftceller som har blitt stabilt transfektert med et menneskelig
NMe2
cDNA å overuttrykker sin produkt . Disse
in vitro
eksperimenter er utformet for å forstå invasivitet av kreftceller som uttrykker ulike nivåer av NMe2.
Materialer og metoder
Denne studien ble godkjent av etikk komité for gjennomføre menneskelig forskning av Lanzhou University, School of Medicine. Pasienter eller deres foresatte dersom deres skriftlig informert samtykke før de blir rekruttert til studien.
Tissue immunhistokjemi
Vi analyserte NMe2 uttrykk i magekreft og tilstøtende normalt vev kirurgisk fjernet fra 139 pasienter innlagt til hæren regional Hospital i byen Lanzhou fra 2011 til 2012. Ingen pasienter fikk cellegift eller strålebehandling før operasjonen. Disse kirurgisk fjernet kreft vev ble behandlet for hematoxylin og eosin (HE) farging. I korthet ble et voksmodul stemplet 42 åpningshull (6 x 7 hull /chip) av 2 mm hver. Vevsblokker ble innebygd i disse hullene (én prøve /hull). Dette voks modulen ble deretter seksjonert slik at vev fra 40 pasienter kan undersøkes samtidig på et enkelt lysbilde for å sikre flekken ensartethet. For kontroll ble det første og siste hull integrert med vev fra ikke-kreft lever og nyre, respektivt. NMe2 ekspresjon ble påvist ved anvendelse av et kommersielt kit immunhistokjemi (Beijing ZSGB Biotechnology Co., Ltd.) med et kanin-anti-humant NMe2-antistoff (1: 300 fortynning, Beijing Biosyntese Biotechnology Co., Ltd.) i henhold til produsentens instruksjoner. Nivåer av NMe2 uttrykk ble numerisk scores som vist i tabell 1 ved en patolog som var blindet for den kliniske opplysninger av disse pasientene.
Cell kultur og cDNA transfeksjon
Celler fra BGC823 og MKN45 magekreftcellelinjer ble kjøpt fra den kinesiske Academy of Science (Shanghai, Kina). Celler i BGC823 linjen var opprinnelig fra en 62 år gammel mann med dårlig differensiert adenokarsinom i magen og de i MKN45 linjen stammer fra en metastatisk masse av leveren fra en 62 år gammel japansk kvinne med en udifferensiert adenokarsinom magen. Celler fra begge linjer hadde restnivåer NMe2 uttrykk, og er derfor ideelt for å studere virkningen av overuttrykker dette genproduktet på magekreftceller
in vitro
.
Cellene ble dyrket i en DMEM medium (Sigma, St. Louis, MO, USA) inneholder 10% føtalt kalveserum (Hang Sijiqing Biological Engineering Materials Co, Ltd, Hangzhou, Kina) ved 37 ° C med 5% CO
2 og 95 % luft. Ved 70-80% av konfluens, ble disse cellene transfektert med et cDNA for humant
NMe2
genet ble klonet inn i en vektor pcDNA3.1 (Shanghai GenePharma Co., Ltd. Shanghai, Kina) ved anvendelse av lipofektamin 2000 som DNA bærer (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Celler som stabilt uttrykker NMe2 (betegnet som NMe2) ble selektert ved dyrking av de transfekterte celler i DMEM-medium inneholdende 1 mg /ml G418. Kontroll celler ble transfektert med pcDNA vektor uten
NMe2
cDNA innskudd (betegnet som mock) og gjennomgikk det samme valget. Un-transfekterte parentale celler ble også undersøkt som grunnlinjekontroller. En overekspresjon av NMe2 ble bestemt ved RT-PCR for å kvantifisere nivået av
NMe2
mRNA og ved immunoblot av transfekterte cellelysatene ved hjelp av et polyklonalt antistoff NMe2 (. 1: 100 fortynning, Beijing Biosyntese Biotechnology Co, Ltd)
RNA isolering og RT-PCR
Total RNA ble isolert fra transfekterte og ikke-transfekterte celler ved hjelp av et kommersielt RNA isolering kit (Takara bioteknologi, Dalian, Liaoning, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA (2 mikrogram) fra hver prøve ble revers-transkribert ved hjelp av en PrimeScript RT Kit følge produsentens protokoll. Den komplementære DNA omvendt transkribert fra RNA ekstrahert fra disse celler, ble amplifisert ved en Taq-polymerase ved å bruke de følgende primere for
NMe2
cDNA: 5′-AAGCAGCACTACATTGACCTGAAA-3 «(fremover) og 5»-GGTCTCCCCAAGCATCACTC-3- «(bakover). Glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble også forsterket som kontroll ved hjelp av følgende primere: 5»-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 «(fremover) og 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3» (bakover). Amplifikasjonsreaksjonen ble startet ved denaturering av DNA ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser med denaturering templat ved 94 ° C i 1 min, primer-hybridisering ved 60 ° C i 1 min, og primer-forlengelse ved 72 ° C i 1 min. Den NMe2 overekspresjon ble kvantitativt definert som en økning i
NMe2
mRNA ved to ganger eller større fra grunnlinjen satt av humbug transfektert celler.
Immunofluorescensanalyse farging av
NMe2
produkt
Celler stabilt transfektert med
NMe2
cDNA og et kjøretøy vektor ble sådd ut på dekkglass og lov til å vokse til samløpet. De ble skyllet to ganger med is-kald fosfat-bufret saltvann (PBS), fiksert i 4% paraformaldehyd i PBS i 15 minutter, permeabilisert med 0,5% Triton X-100, og inkubert med 1% bovint serumalbumin (BSA) i 30 min for å blokkere ikke-spesifikk binding. Cellene ble deretter inkubert med et kanin-antistoff mot human NMe2 (1: 100, Beijing Biosyntese Biotechnology) i 24 timer ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med et FITC-konjugert sekundært antistoff (1: 100, Beijing Biosyntese Biotechnology) i 1 time . Alle antistoffer ble fortynnet i PBS inneholdende 1% BSA. Kjerner ble motfarget med DAPI (1: 100 i PBS, 10 min ved værelsestemperatur).
cellesyklusanalyse
Celler som stabilt uttrykker NMe2 og kontrollceller i kultur ble samlet opp og fiksert med 70% iskald etanol ved 4 ° C i 24 timer, vasket to ganger med iskald PBS, og deretter behandlet med RNase A (20 ug /ml) i 30 minutter ved 37 ° C. De ble inkubert med propidiumjodid (10 ug /ml endelig konsentrasjon) i mørket i 30 minutter ved romtemperatur før analyse ved strømningscytometri for DNA-ploiditet.
Colony-dannelsesbestemmelsen
Transfekterte og kontrollceller ble dyrket ved en initial densitet på 1000 celler pr 100-mm kulturskål i et komplett DMEM-medium i opptil 4 uker. De ble deretter farget med metyl fiolett. Alle cellekolonier som var større enn 2 mm i diameter (som finnes ≥50 celler) ble tellet i tre separate retter, og uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. For formålet med datavalidering, vi også tellet levende celler som hadde blitt dyrket i opptil 96 timer. I korthet, ble foreldre BCG823 og MKN45 celler og celler som var stabilt transfektert med enten en human
NMe2
cDNA eller kjøretøyet vektor (pc-DNA 3,1) sådd ut i en tetthet på 2 x 10
4 celler /ml. De ble løsrevet 48-96 timer etter første seeding med 1% trypsin og sentrifugert ved 1600 x g. Cellepelletene ble resuspendert i PBS og inkubert med 0,04% av trypanblått i 3 min. Overlevende celler ble talt på et hemocytometer.
Analyser for cellemigrasjon
To komplementære analyser ble utført for å måle effekten av overekspresjon NMe2 på frekvensen av celle migrasjon. Først ble en sårhelende assay, hvor celler ble sådd ut i 6-brønners plater og fikk vokse til ≥ 95% sammenflytende. Etter vask celler to ganger med PBS, ble en steril pipette brukes til å lage riper i cellemonolaget (4-5 parallelle riper /plate). Cellene ble vasket en gang med PBS, fotografert for å markere skrapte spor, og inkubert med 2,5 ml serumfritt DMEM-medium. Ved en baseline hastighet på celle migrasjon, ble ripet område delvis dekket av celler migrert inn i det skadde området 24-48 timer etter skade, som resulterer i en mindre cellefritt område. Fordi denne sårhelende analysen er semi-kvantitativ, ble resultatene ytterligere validert av en Transwell cellemigrering assay. I korthet, 6 x 10
5-celler suspendert i 500 ul serumfritt medium inneholdende 0,1% BSA ble sådd ut i et Transwell (BD Biosciences) som ble plassert i en 24 brønners plate. Den nederste kammer inneholdt 500 pl av komplett DMEM-medium. Celler ble tillatt å vokse i den øverste kammer i 24 timer for å lette cellemigrering fra den øverste kammer til det nedre kammer. På slutten av denne inkuberingsperioden ble membranen i det øverste kammeret fiksert med 4% paraformaldehyd i 30 minutter, vasket med distill vann, og lufttørket. Celler på den motsatte side av kammeret (transmigrated) ble farget med 0,1% av metyl- fiolett (Dade Behring-, Newark, DE) i 30 min, vasket, og betraktes under en opp-rett mikroskop (x 400 Nikon). Cellemigrasjon ble definert som antall celler på membranen i 5 tilfeldige gjennomgang felt.
analysen for celle invasjon
Transwell kamre ble belagt med rottehale type I fibrillar kollagen [15] i 30 min ved 37 ° C. Overskudd av væske ble fjernet og belagte kamre ble lufttørket i en time i et sterilt miljø. Cellene ble suspendert i 500 ul serumfritt DMEM-medium inneholdende 0,1% BSA til en endelig tetthet på 6 x 10
5 og sådd ut på kollagen matriksen i en transwell som ble plassert i en 24 brønners plate. Den nederste kammer inneholdt 500 pl av komplett DMEM-medium. Celler som forble på membranoverflaten ble forsiktig fjernet 24 timer etter celler ble sådd og membranen ble fiksert og farget for celler som var transmigrated gjennom kollagen matriksen til den motsatte side av transwell membranen.
Statistiske analyser
Alle data ble analysert ved hjelp av SPSS 20.0 statistikkprogram. Kvantitative verdier ble uttrykt som middelverdi og SEM. Følgende statistiske analyser ble anvendt i studien: Fishers eksakte test eller chi-kvadrat-test for å definere forholdet mellom NMe2 ekspresjon og patologiske egenskaper ved kreft vev; enveis ANOVA for gruppe sammenligning mellom parentale celler og celler transfektert med enten et kjøretøy vektor eller et menneske
NMe2
cDNA; og Pearson analyse for sammenheng mellom NMe2 uttrykk og differensiering og metastasering av kreft celler.
Resultater
Association of NMe2 uttrykk med histologiske kjennetegn ved magekreft
Vi har samlet kirurgiske prøven fra 139 pasienter med adenokarsinom i ventrikkel. Tabell 2 viser demografisk informasjon av disse pasientene og histologiske kjennetegn ved kreft vev fra disse pasientene. NMe2 ekspresjon var svak eller ikke detektert i dårlig differensiert vev, men var intensivt i godt differensiert vev ved et nivå som kan sammenlignes med tilstøtende normalt vev (Fig. 1). Et høyt nivå av NMe2 uttrykk var assosiert med en betydelig redusert sats av metastaser til lymfeknuter (
p
= 0,038), men ikke med størrelsen på primærtumor og dybde av kreft invasjon. En Pearson korrelasjonsanalyse viste at NMe2 uttrykket ble uavhengig assosiert med forekomst av celledifferensiering (r = 0,436,
p
= 0.000) og spre seg til lokale lymfeknuter (r = -0,281,
p
= 0,001, tabell 1).
En immunohistokjemisk påvisning av NMe2 ekspresjon i vev fra dårlig (A), moderat (C), samt (E) differensiert magekreft og tilstøtende normalt vev (G). Intensiteten av NMe2 ekspresjon i godt differensiert vev er lik den i normalt vev. Panelet B, D, F, H er HE flekk av vev fra den samme prøven blokkene (bar = 100 um). Disse bildene er representative for vev lysbilder fra 139 pasienter inkludert i studien.
Effekt av NMe2 på spredning av magekreftceller i kultur
For ytterligere å undersøke sammenslutningen av NMe2 uttrykk med patologiske egenskapene av mage kreft celler, studerte vi celler fra BGC823 og MKN45 magekreft linjer som uttrykte NMe2 svakt på et nivå i forhold til dårlig differensiert kreftvev (fig. 1). Disse cellene ble transfektert med en human
NMe2
cDNA for å overuttrykke NMe2 som kvantitativt målt ved en økning i
NMe2
mRNA (kvantitativ RT-PCR) og NMe2 proteinprodukt (immunfluorescens, Fig. 2 )
A B: RT-PCR profiler av
NMe2
mRNA i mock og
NMe2
-transfected BGC823 og MKN45 magekreftceller (foreldre BGC823 og MKN45 celler som linjene [BL]). Nivåer av
NMe2
mRNA fra 3 separate sett av transfections ble kvantifisert ved densitometri (ANOVA, n = 3, *
p
0,05, sammenlignet med baseline). Immunfluorescens farging av NMe2 i utransfekterte (C 0,05 sammenlignet med foreldreceller [BL]). (C) ANTALL levedyktige BCG823 celler i kultur av disse tre typer celler i opp til 96 timer (ANOVA, n = 3 /celletype ved hvert tidspunkt, *
p
0,05 sammenlignet med foreldrecellene ).
Effekt av NMe2 på celle migrasjon og invasjon
Vi har evaluert neste evne NMe2-overekspresjon celler til å migrere fordi en retnings migrasjon er en viktig forutsetning for invasjonen av kreftceller til omkringliggende vev. Denne retnings overføringen ble undersøkt ved anvendelse av en sårhelende assay som måler hastigheten av celler migrasjon inn i området for skade laget av en skarp gjenstand. Som vist på fig. 4A og 4B, bredden av et skadet område etter 48 timer i kulturer var større for
NMe2
-transfected celler enn for ikke-transfektert og mock-transfekterte celler. Den langsomme migrering ble funnet i celler fra begge cellelinjer, noe som tyder på at celler som overuttrykker NMe2 migrerte mye langsommere. Fordi denne sårheling analysen er semi-kvantitativ, vi også kvantitativt måle graden av cellemigrering ved hjelp av en Transwell-analyse. I samsvar med den sårhelende analysen NMe2 overekspresjon celler migrert på -50% av ikke-transfektert eller mock-transfekterte celler (Fig. 4).
Foreldre BGC823 (A) og MKN45 (B) celler og celler som ble stabilt transfektert med enten et kjøretøy vektor (mock) eller et menneske
NMe2
cDNA migrere mot skrape områder (definert av punktlinjer) 48 timer etter skade (paneler er representative bilder fra 3 separate sett av eksperimenter). C D, migrering av disse cellene ble også kvantitativt målt i en transwell assay (ANOVA, n = 3 /gruppe, *
p
0,05 i forhold til foreldre celler [BL]).
En reduksjon i cellemigrering potensielt kan redusere evnen til disse cellene til å invadere omgivende vev. For å undersøke denne muligheten, måler vi invasjonen av kreftceller til kollagen matrise i et veletablert transwell kammer analysen. BGC823 celler som overuttrykt NMe2 betydelig redusert evne til å invadere en kollagen matrise til 60% av ikke-transfekterte og mock-transfekterte celler (Fig. 5). Satsen for invasjonen ble tilsvarende redusert i MKN45 celler transfektert med
NMe2
cDNA i forhold til foreldre celler og de transfektert med et kjøretøy vektor (Fig. 5).
Foreldre, mock- og
NMe2
cDNA transfektert BCG823 (A) og MKN45 (B) celler ble målt for lokal invasjon inn i kollagenmatriksen i en transwell assay. Paneler A (BCM823) og C (MKN45) er smekk bilder av celler som invaderte gjennom kollagen-matriksen til baksiden av membranen i Transwell kamre. Paneler B (BGC823) og D (MKN45) er kvantitative sammendrag av flere eksperimenter (ANOVA, n = 3, *
p
0,05 i forhold til foreldre celler [BL])
diskusjon
Vi har undersøkt forholdet mellom NMe2 ekspresjon og kjennetegn ved gastrisk kreft i vev kirurgisk fjernet fra pasienter og i dyrkede celler fra to kjente magekreft linjer. Studien er nødvendig fordi
NMe2
ble først identifisert som den første metastase suppressor-gen, men dets evne til å blokkere kreft lokal invasjon og metastasering fjern synes å være celletype spesifikk blant kreftformer som har hittil blitt undersøkt [8- 14]. For eksempel, en analyse av 35 pasienter med skjoldbrusk papillær karsinom og 11 i metastatiske lymfeknuter viste et betydelig redusert nivå av
NME1
mRNA i metastatiske lymfeknuter, mens
NMe2
mRNA ble ikke endret i den opprinnelige svulsten og lymfeknuter [14], noe som tyder differensial roller NME1 og NMe2 i kreft invasjon og metastasering. En meta-analyse av 278 pasienter med tykktarmskreft, 177 med brystkreft, 137 med eggstokkreft og 77 med lungekreft også funnet et redusert nivå av NMe2 uttrykk i metastatisk kreft sammenlignet med ikke-metastatisk kreft [17]. Men til tross for en negativ sammenheng mellom NME1 /NMe2 uttrykk og kreft invasjon til lokale lymfeknuter og livmor infiltrasjon, NME uttrykk var ikke assosiert med TNM score og differensiering av intrauterin membran karsinom og livmorhalskreft [16]. Her gir vi flere linjer med bevis for at NMe2 begrenser spredning, migrasjon og invasjon til den ekstracellulære matrise av mage kreftceller.
Først blir et høyere nivå av NMe2 uttrykk funnet i godt differensiert og mindre invasiv vev fra magekreft kirurgisk fjernet før kjemoterapi og strålebehandling i en stor pasient kohort (tabell 1 fig. 1). Den metastasering av kreft til lokale lymfeknuter ble oftere funnet i kreftvev som hadde et lavt nivå av NMe2 uttrykk og denne korrelasjonen mellom NMe2 uttrykk og differensiering /metastase i disse pasient vev igjen etter dataene ble stratifisert for alder, kjønn, den størrelsen på primærtumor og dybde av invasjon (tabell 1 og 2,). Disse funnene er i samsvar med en fersk rapport som NMe2 binder telomere gjenta bindende faktor 2 i kjernen for å redusere telomerase aktivitet [37], noe som tyder på en mekanistisk kobling mellom NMe2 uttrykk og overlevelse av kreftceller.
For det andre, vi undersøkt effekten av over-uttrykke NMe2 på forekomst av spredning, migrasjon og invasjon til den ekstracellulære matrise
in vitro
av celler fra de to godt studert magekreft cellelinjer BGC823 og MKN45 [18-21]. Transfeksjon med en human
NMe2
cDNA resulterte i en to-ganger eller større grad av NMe2 ekspresjon i disse celler sammenlignet med narretransfekterte celler (Fig. 2). Dette NMe2 overekspresjon endret ikke DNA-ploiditet (tabell 3), men betydelig bremset kolonidannelse av disse cellene (fig. 3), noe som tyder på at overuttrykker NMe2 forsinker en overgang fra DNA-replikasjon til mitose. Dette resultatet er i samsvar med tidligere rapporter om at NMe2 ikke påvirker veksten av dyrkede kreftceller, og er ikke forbundet med størrelsen av primærcancer implanteres i dyr [22-27]. Det er imidlertid uforenlig med rapporter som NMe2 fremmer [28,29] eller reduserer [30] spredning av andre typer kreftceller. Nøyaktige årsakene til avviket gjenstår å bli undersøkt videre, men tyder disse data på celletypespesifikke effekter av
NMe2
genet på patogenesen av kreft.
For det tredje, i motsetning til en minimal virkning på proliferasjonen av magekreftceller, overekspresjon av NMe2 medfører en betydelig reduksjon i cellemigrering og invasjon gjennom kollagenmatriksen som vist i tre forskjellige, men komplementære analysene (figurene 4 og amp;. 5). Våre data støtter tidligere funn av samme hemmende effekt på brystkreft [8], oral platecelle kreft i [28] og melanomceller [9], selv om unntak ble igjen notert i hepatocellulær [13,29] og kolorektale karsinomer celler [31]. Det gjenstår å fastslå hvorvidt som redusert migrering og invasjon av NMe2-overekspresjon celler er et resultat av en nedsatt evne av disse cellene til spredning.
Våre resultater identifisert magekreftceller så følsom for over-uttrykt NMe2, men en kritiske spørsmålet gjenstår som det regulerer disse ulike NMe2 aktiviteter blant ulike typer kreftceller. En mulig mekanisme er at en NMe2 aktivitet er avhengig av opp- og nedstrøms-molekyler som interagerer med NMe2 i en gitt celletype. Flere molekyler har tidligere vært kjent for å interagere eller regulere NMe2, slik som EGFR,
c-erbB-2
,
c-erbB-3
og sex steroid-reseptoren i ovariekarsinomer [32]. Plakoglobin ble rapportert til å samhandle med NMe2 å fremme sitt uttrykk i celler fra menneskelige tunge plateepitelkarsinom [33]. NMe2 ble også funnet å samhandle med MDM2 (Mouse dobbelt minutt 2-homolog) for å redusere bevegeligheten av renale karsinomceller [34]. MDM2 er en E3 ubiquitin-protein-ligase og tjener som en negativ regulator av p53 tumor suppressor. Forholdet mellom
NMe2
-genet og gener av
myc
familien synes å være mer komplisert. Produkter av
NME1 Hotell og
NMe2
gener har blitt foreslått å være nedstrøms for c-
myc
reguleringsveien [7] og involvert i nedregulering av cdc42 funksjon i neuroblastom [35]. NMe2 er også rapportert å samhandle med G-quadruplex DNA i nuklease overfølsom element i
c-myc
arrangøren å indusere c-myc uttrykk [36]. Et system biologi tilnærming for å undersøke disse spesifikke veier i stedet for enkeltmolekyler kan være nødvendig å dissekere roller
NMe2
genet og dets produkter i ulike typer kreft.
I sammendraget, vi har vist at en overekspresjon av NMe2 reduserer migrasjon og invasjon av mage kreftceller til matriks
in vitro
. Som et resultat er NMe2 uttrykk forbundet med godt differensiert og mindre invasitve histologi av magekreft. Disse resultatene tyder på at
NMe2
genet og dets produkter kan tjene som en potensiell markør for å forutsi invasivitet av magekreft, og også som et terapeutisk mål som kan bli oppregulert gjennom genterapi.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fig. Effekt av NMe2 overekspresjon på gastrisk kreftceller i cellesyklus.
DNA-ploiditet av celler transfektert med
NMe2
cDNA ble analysert ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av et kommersielt sett i henhold til produsentens instruksjoner. Panelene A-C var for foreldre BCG823 celler og de transfektert med
NMe2
cDNA eller vektor. Panelene D-F var for MKN45 celler med de samme behandlingene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0115968.s001 plakater (DOC)
