Abstract
Bakgrunn
Kronisk betennelse er ofte observert på histologisk analyse av maligne og ikke-maligne prostata prøver. Det er en mistanke om støtte faktor for prostata sykdommer og deres progresjon og en viktig årsak til falske positive PSA tester i kreftscreening. Vi antok at betennelse induserer autoantistoffer, som kan være nyttige biomarkører. Vi forsøkte å identifisere og validere prostata betennelse forbundet serum autoantistoffer i prostatakreftpasienter og evaluere uttrykk for tilsvarende autoantigenene.
Metoder
radikal prostatektomi eksemplarer av prostatakreftpasienter (N = 70) ble klassifisert inn i høye og lave inflammasjons grupper i henhold til mengden av vev infiltrerende lymfocytter. De tilsvarende pre-kirurgiblodserumprøver ble gransket for autoantistoffer ved hjelp av en lav-tetthet-protein matrise. Valgte autoantigener ble identifisert i prostata vev og deres uttrykk mønster analysert ved immunhistokjemi og qPCR. Det identifiserte autoantistoff profilen ble kryssjekket i en uavhengig prøvesett (N = 63) ved hjelp av Luminex-perle protein array-teknologi.
Resultater
Protein rekke screening identifisert 165 autoantistoffer forskjellig rikelig i serum av høy sammenlignet med lave betennelse pasienter. Uttrykket mønster av tre tilsvarende antigener ble etablert i godartet og kreft vev ved immunhistokjemi og qPCR: SPAST (Spastin), STX18 (Syntaxin 18) og spop (prikk typen POZ protein). Av disse ble SPAST signifikant økt i prostatavev med høy betennelse. Alle tre autoantigener ble uttrykt forskjellig i grunnskolen og /eller kastrering resistente prostatakreft når analysert i en betennelse uavhengig vev microarray. Cross-validering av betennelse autoantistoff profil på en uavhengig prøvesett ved hjelp av en Luminex-perle protein array, hentet 51 av betydelig kresne autoantistoffer. Tre autoantistoffer var signifikant oppregulert i begge skjermene, MUT, RAB11B og CSRP2 (p 0,05)., To, spop og ZNF671, nær statistisk signifikans (p = 0,051 og 0,076)
Konklusjoner
Vi gir bevis for en betennelse spesifikke autoantistoff profil og bekrefte uttrykk for tilsvarende autoantigener i prostata vev. Dette støtter evaluering av autoantistoffer som ikke-invasive markører for prostata betennelse
Citation. Schlick B, Massoner P, Lueking A, Charoentong P, Blattner M, Schaefer G, et al. (2016) Serum autoantistoffer i kronisk prostata betennelse i prostatapasienter. PLoS ONE 11 (2): e0147739. doi: 10,1371 /journal.pone.0147739
Redaktør: Aamir Ahmed, Kings College London, Storbritannia
mottatt: 28 juli 2015; Godkjent: 07.01.2016; Publisert: 10 februar 2016
Copyright: © 2016 Schlick et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er tilgjengelig i papir og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. studien ble støttet av COMET K1 Senter Oncotyrol-Center for personlig medisin, finansiert av den østerrikske forsknings Promotion Agency (FFG) og Foundation of the Future Country av Tyrol, og Protagen AG. ONCOTYROL GmbH, Protagen AG og TARGOS Molecular Pathology GmbH gitt støtte i form av lønn for forfattere [BS, PM, GS], [AL, KM, CT, PA, SM, PSK], [DZ, MK] men hadde ikke noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Alle andre forfattere erklærer ingen konkurrerende interesse. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. Studien ble støttet av COMET K1 Senter Oncotyrol-Center for personlig medisin, finansiert av den østerrikske forsknings Promotion Agency (FFG) og Future Foundation of the Country av Tyrol, og Protagen AG. Petra Massoner, Georg Schaefer og Bettina Schlilck ble ansatt i ONCOTYROL. Angelika Lueking, Klaus Marquart, Carmen Theek, Peter Amersdorfer, Stefan Müllner og Peter Schulz-Knappe ble ansatt i Protagen AG. Stefan Müllner er medstifter og CEO i Protagen AG. Dirk Zielinski og Matthias Kirchner ble ansatt i TARGOS Molecular Pathology GmbH. Petra Massoner er for tiden tilknyttet som en DAAD kar med Roche Diagnostics GmbH, men hennes data inkludert i studien ble generert før det tilhørighet, studie presentert her er uavhengig av fellesskap eller noe annet arbeid relatert til Roche Diagnostics GmbH. Protagen AG har patent på «Marker Sekvenser for diagnose prostatakreft, og bruken av disse». Det er ingen produkter i utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Prostatakjertelen er en side av hyppig godartet og ondartet sykdom med alderen som den viktigste risikofaktoren [1, 2]. Som en ulempe av den stadig økende levealder forekomsten av prostatasykdommer, slik som prostata cancer, prostatisk hyperplasi (BPH) og prostatitt øker også, og disse sykdommene utgjør et økende medisinsk og sosialt problem, men også et økende økonomisk byrde [3- 6]. Ofte, histopatologisk analyse av prostatabiopsier og kirurgiske prøver viser inflammasjon forbundet med prostata sykdom, i de fleste tilfeller en asymptomatisk «kronisk» inflammasjon, karakterisert ved histologiske endringer og immun celleinfiltrater [7-10]. Kronisk betennelse kan være en av driverne av prostata sykdomsprogresjon og en viktig medvirkende faktor til falske positive prostata spesifikt prostatakreft testing antigen (PSA) [11-15].
Kilden intraprostatic betennelse er ennå ikke fullt avdekket, infeksjon, autoimmunitet, celleskader, hormonelle variasjoner, eller kostholdsfaktorer kan bidra. Så mye som årsak for prostatitt er igjen en utfordring for videre undersøkelser, er dens relevans for patologiske prosesser uklart [16]. Studier tyder på et bidrag på kronisk betennelse til kreftutvikling og utvikling av prostata sykdom [17, 18]. Spesielt proliferative inflammatorisk atrofi (PIA) som er ansett som en prostatakreft forløper lesjon, er assosiert med inflammatoriske immuncelle infiltrater, som stimulerer spredning, støtte kreft via økt oksidativt stress og celleskader og pioner ondartet degenerasjon [19]. Selv om de fleste studier adressert effekten av betennelse på kreftutvikling og tumorprogresjon, er dette fenomenet ikke begrenset til kreft, er immun celleinfiltrater også funnet ofte i hyperplastisk eller i histologisk normal prostata vev [17].
I lys av behovet for å fortsette arbeidet med å avklare effekten av betennelse på prostatasykdommer, ville lett tilgjengelige biomarkører for prostata betennelse være en stor hjelp. Videre er slike markører som tillater å en mindre invasiv måte for diagnose, prognose og behandling overvåking av kronisk prostatitt som kreves for å forbedre pasientbehandlingen, øke spesifisiteten av PSA-test for å oppdage prostatakreft og føre til en bedring av prostatakreft styring. I denne sammenheng autoantistoffer er viktige typer av markørmolekyler, som de er knyttet til aktiviteten av immunsystemet. Antistoffer har ideelle egenskaper som potensielle markører, de er svært stabile og ikke gjennomgår kortsiktige variasjoner i konsentrasjon, de er lett tilgjengelig via serum eller plasmaprøver og i hvert klinisk laboratorium det er svært sensitive deteksjonsmetoder tilgjengelig for sine kvantifisering. For kreftpasienter ble det overbevisende demonstrert at en anti-tumor immunrespons kan utløses [20, 21]. Autoantistoffer mot cancerantigener er blitt identifisert hos pasienter med forskjellige faste tumor-enheter slik som for eksempel tumorer i bryst [22, 23], hode og hals [24, 25], lunge [26, 27], spiserør [28], tykktarm [29] og prostata [26, 30, 31].
Nylig har vi anvendt protein mikromatriser for autoantistoff profilering i blodet av prostata kreftpasienter og ikke-kreft-kontroller. Vi identifiserte et panel av prostata kreft forbundet autoantistoffer [31]. Utvide disse studiene vi her presentere identifisering og validering av autoantistoffer i forbindelse med prostataimmuncelle infiltrater i prostatakreftpasienter. I tillegg vurderte vi uttrykket mønster av tilsvarende autoantigener i maligne og ikke-maligne prostatavevet og spurte om mutasjoner kan utløse autoantistoffer.
Materiale og metode
Retrospektiv prøve kohort
Serumprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble innhentet fra prostatakreft Bioresource av Department of Urology, Innsbruck Medical University. Blodprøvene var innsamlet innenfor rammen av Tiroler prostatakreft tidlig oppdagelse program og ble lagret ved -80 ° C frem til anvendelse [32]. Informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og studien ble godkjent av etikkomiteen ved Medical University of Innsbruck (Study AM 3174, endring 2). Alle prøver ble innhentet før radikal prostatektomi kirurgi fra pasienter med biopsi-påvist klinisk lokalisert prostatakreft, som var minst 40 år gammel, og som hadde fått ingen tidligere prostata-kreft terapi. Pasient utvalg for lave og høye betennelses tilfeller var basert på analyser av hele prostata prøver for å infiltrere lymfocytter. En kohort av 70 pasienter (38 høy, 32 lav infiltrasjon) for screeningundersøkelse og 63 pasienter (33 høy, 30 lav infiltrasjon) for kryssvalideringsstudie ble rekruttert.
antistoffer profilering
De analysene som benyttes for autoantigen profilering, en low-density protein matrise og en Luminex-perle protein array, henholdsvis, ble etablert så bredt som gjelder teknikker og ikke spesifikt for prostatakreft bare. Mens protein rekke teknikken ble brukt for første screeningundersøkelse, ble senere etablert Luminex-perle teknikk som brukes for en uavhengig kryssvalideringsstudie.
Valg av inkluderte autoantigen proteiner var basert på våre tidligere autoantistoff skjermer i prostata kreft [31] og autoimmune sykdommer [33-35], og på publiserte autoantigener funnet assosiert med kreft [36-42]. I tillegg ble proteinproduksjon effekt, proteinkvalitet, og ytelseskriterier analyse vurdert for det endelige valget av autoantigen proteiner. 4012 proteinene ble valgt for proteinet matrisen, 3061 proteiner for den Luminex-perle protein matrise. Autoantigen paneler er oppført i saksdokumenter (S1 tabell). Perlen protein assay ble gruppert i 8 undergrupper som det maksimale tilgjengelige antall individuelt fargekodede LuminexMagPlex
TM perler (Luminex, MV’s-Hertogenbosch, Nederland) er 500. Luminex-perle autoantistoff analysen ble etablert for en bred anvendelse, uavhengig av de første prostata lav /høy betennelser screening resultater og derfor ikke stemmer helt innledende autoantigen panel. Basert på de tilsvarende genet IDer, ble 84% av autoantigen proteiner av Luminex-perle analysen også representert i protein microarray.
autoantigen proteiner ble uttrykt i
E
.
coli Hotell og rekombinante proteiner ble renset ved hjelp av en His-tag affinitet rensing prosedyre. Generering av planar protein microarrays ble utført som beskrevet tidligere [31]. Kort, proteiner ble oppdaget i quadruplicates på nitrocellulose-belagt FAST lysbilder (GE Healthcare). Mus og humane IgG’er ved forskjellige konsentrasjoner ble tilsatt for å brukes som immunpåvisnings kontroller og for data normalisering. En automatisert stasjon (HS 4800 Pro, Tecan) ble brukt til å utføre microarray autoantistoff analyse. Array objektglass ble blokkert med 2% (w /v) bovint serum (BSA) i TBS inneholdende 0,1% (v /v) Tween 20 (TBST) og blodserum-prøver ble tilsatt i en 1: 100 fortynning i 2% (vekt /v) BSA /TBST. Etter inkubasjon ved romtemperatur i 16 timer sekundære (mus-anti-human-IgG, 1: 5000, Sigma) og tertiær (Cy3-merket esel-anti-mus IgG, 1: 500, Jackson Immunoresearch) ble antistoff inkubasjons-trinn utføres i 2% (vekt /volum) BSA /TBST ved romtemperatur i 1 time. Etter hver inkubasjon trinn, ble objektglass vasket 3 ganger med TBST. Behandlet protein matriser ble skannet på en konfokal mikromatriseleser (ScanArray 4000, Perkin Elmer Life Science) og analysert ved hjelp av GenePix Pro 6,0 microarray bildeanalyse programvare (Molecular Devices).
Den Luminex-perle teknikk for autoantigen profilering var etablert fordi den har flere fordeler sammenlignet med den opprinnelig brukt proteinet matrise teknikk som for eksempel høyere dynamisk område, lavere variasjonskoeffisienter, øket stabilitet på grunn av kovalent bindings av proteiner og bedre ytelse i high-throughput-analyse. For perlen autoantigen matrisen 3061 autoantigener ble valgt. Hans-tag affinitetsrenset rekombinante proteiner ble kovalent bundet til magnetiske karboksylert fargekodede MagPlex
TM mikroperler følgende produsentens protokoll (Luminex). For hvert enkelt koblingsreaksjonen opp til 12,5 ug antigen og 8,8 x 10
5 individuelt kodede perler ble anvendt. Koblingseffektiviteten og perlestabilitet ble overvåket. En perle-undergruppen besto av opp til 384 forskjellige antigen-belagte kuler og åtte kontrollperlene. På grunn av det totale antall antigener, ble åtte forskjellige underordnede rekker utformes og brukes for analysen. Protein-belagte kuler ble fordelt i 96-brønners mikrotiterplater og inkubert med fortynnet (1: 100) serumprøver i 22 timer ved 4 ° C. På hver analyseplate ble tre referanse-sera målt som tjener som kvalitetskontroll. Ubundet antistoff ble fjernet ved vasking. Bundne humane antistoffer ble kvantifisert ved probing med phytoerythrin (PE) -merket anti-human deteksjon-antistoff (geit-anti-human-PE, Jackson /Dianova) etterfulgt av flere vaskesykluser og måling av det fluorescerende signal på en FlexMap3D anordning (Luminex) (DD gate 7,500 til 15,000; sample size: 80 mikroliter, 1000 hendelser per perle region, timeout 60 sekunder)..
data~~POS=TRUNC pre-prosessering og biostatistiske analyse
Planar protein arrays
etter median bakgrunn subtraksjon, ble median fluorescensintensiteten til 4 gjentatte flekker beregnet for hver autoantigen og normalisert til flekket IgG kontroller. Cut-off ble bestemt individuelt for hver autoantigen og beregnet som den midlere signalstyrken for lav betennelse kontrollgruppen pluss 3 standardavvik. Høy betennelse cohort prøver med verdier over cut-off ble klassifisert som positive og alle antigener ble sortert etter synkende antall positive prøver. N-gangers økning eller reduksjon av en spesifikk autoantistoff ble bestemt på grunnlag av den normaliserte midlere signalintensiteten i høy sammenlignet med den lave betennelse kohort. Rangering av toppkandidat markører var basert på fold-endring og korrigert p-verdi.
Perler protein arrays.
Den målte median perle fluorescens intensitet for hver autoantigen ble brukt for videre beregninger. I sjeldne tilfeller der mindre enn 10 perler ble hentet for måling, ble denne verdien satt til mangler. Disse verdier ble erstattet med medianverdien av denne autoantigen målt i alle prøver. Autoantigener med mer enn 20% manglende verdier ble ekskludert fra videre analyse. Etter log2 transformasjon quantile normalisering [43, 44] ble brukt til å normalisere prøver på hver enkelt plate.
Klassifiseringen av de fem beste resultater autoantistoffer identifisert med perle matrise teknikk for differensiering av lav og høy betennelse kohortene var basert på en logistisk regresjonsmodell med gruppen variabel (høy /lav betennelse) som avhengig variabel og gjennomsnitts fluorescens verdier av autoantistoffer som påvirkningsfaktorer. P-verdier for enkelt påvirkende faktorer ble beregnet basert på Wald test, og i tillegg parameterestimater og de respektive 95% konfidensintervall (KI) to-sidig ble beregnet. Odds ratio (OR) fikk sammen med de respektive 95% konfidensintervall tosidige. Klassifiseringen resultatene ble vurdert basert på følsomhet, spesifisitet og AUC-verdiene som ble oppnådd med denne modellen [43, 45]
Funksjonell merknader og sti analyse
Etter å kartlegge de beste 165 autoantistoffer testet positiv med proteinet microarray til genene, ble et sett av gener 136 erholdt og anvendt for genet ontology analyse. Funksjonell merknad clustering ble utført ved hjelp av DAVID database (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [46, 47].
Tissue microarray (TMA) og immunhistokjemi
For bygging av en vev microarray (Betennelse-TMA) formalinfiksert og parafininnebygde menneskelige vevsprøver (n = 70) viser høye eller lave mengder vev infiltrerende lymfocytter ble valgt ut fra det autoantistoff screening kohort. Kliniske og patologiske egenskaper er oppsummert i tabell 1 i kolonne «Screening kohort». Bruk av arkiverte prøvene stammer fra radikal prostatektomi prøver innhentet ved Universitetssykehuset Innsbruck ble godkjent av etikkomiteen av Medical University of Innsbruck. For hvert tilfelle tre kreftvev kjerner og tre godartede kjerner med en diameter på 0,6 mm ble stanset ut av donorvevet og overføres til mottakeren TMA blokken [48]. Den TMA ble satt sammen ved hjelp av en manuell vev arrayer (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI). Basal celle markør P63 og kreftcelle markør α-methylacyl-CoA racemase (AMACR) stainings brukes til å styre histologisk diagnose og SPAST, STX18 eller spop stainings henholdsvis ble utført på en Discovery-XT farging enhet (Ventana, Tucson, Arizona) ved hjelp av instrumentstandardprotokoller. Target antistoffer, leverandører, artikkelnumre, og konsentrasjoner som ble brukt var som følger: anti-SPAST, Atlas Antistoffer (Stockholm, Sverige), # HPA017311, 01:50; anti-STX18, Atlas-Antistoffer, # HPA003019, 1: 150; anti-spop, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), # SAB1406659, 01:50; anti-p63, Sigma-Aldrich, # P3362, 1: 200; anti-AMACR, Dako (Wien, Østerrike), # M3616, 1: 200, anti-CD45, Dako, # M0701, en. 300
Evaluering av immunhistokjemiske fargings intensiteter ble overvåket av en erfaren uropathologist (GS). Bilder ble ervervet ved hjelp av en Axio Imager Z2 mikroskop (Zeiss) og TissueFAXS programvare (TissueGnostics). Kvantitativ immunhistokjemisk analyse ble utført ved hjelp av HistoQuest immunhistokjemi analyse programvare (TissueGnostics). For hver TMA øye midlere intensitet og prosentandelen av positivt fargede celler ble evaluert og en score ble beregnet ved å multiplisere disse to verdier for hver TMA kjerne. Midlere resultater verdiene ble beregnet fra tre kreft og tre kjerner til hver pasient godartede vev. Mann Whitney U-testen ble brukt for analyse av forskjellene mellom de to gruppene.
En andre TMA (Targos-TMA) omfattende 111 vevsprøver fra histologisk normal prostata (BE), godartet prostata hyperplasi (BPH), prostata karsinom (CA), så vel som klinisk diagnostisert kastrerings refraktære tumorer (CRPC), ble konstruert og farget som beskrevet ovenfor. Bruken av disse vevsprøver som stammer fra radikal prostatektomi operasjoner på sykehus i Kassel ble godkjent av Institutional Review boards. Stainings ble evaluert av en uavhengig patolog (M.K.), ved hjelp av en semikvantitativ scoring system (H-Score), som kombinerer fire intensitetskategorier med antatt prosentandel av fargede celler [49]. Mann Whitney U-testen ble brukt for analyse av forskjeller mellom gruppene.
RNA isolering og qPCR
Total RNA ble ekstrahert fra godartede og ondartede områder av frosne vevssnitt i begge pasientgrupper (høy /lav inflammasjon, n = 66) ved hjelp av AllPrep DNA /RNA Micro Kit (Qiagen, GmbH, Hilden, Tyskland). RNA-konsentrasjoner og renhet ble bestemt spektrofotometrisk. Revers transkripsjon (RT) ble utført på 500 ng total-RNA ved hjelp av iScript velger cDNA syntesesett (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og tilfeldige heksamerprimere (Promega, Madison WI, USA). QPCR (40 sykluser) ble utført i tre paralleller ved å bruke 8NG totale RNA-ekvivalenter av cDNA for hver 10 ul reaksjon. Følgende TAQMAN analyser (Applied Biosystems, Foster CityCA, USA) ble brukt: PTPRC, Hs04189704_m1; STX18, Hs01099207_m1; Spop, Hs00737433_m1; SPAST, Hs00208952_m1; TBP, Hs00427620_m1. Target genekspresjon ble normalisert til husholdningsgenet TBP. Den relative uttrykk forholdet (R) ble beregnet på grunnlag av Taqman-analyse Effektiviteten av mål-genet og referansegenet og syklusen terskel (Ct) avvik fra hver prøve til en kontrollprøve (kalibrator, cDNA blanding av 3 godartede og 3 ondartede vev seksjoner, 20 ng qPCR inngang) med følgende formel:. R = [E
target ^ ΔCt (kalibrator-utvalget)] /[E
henvisning ^ ΔCt (kalibrator-utvalget)] [50]
Søk for spop mutasjoner
Femtitre cDNA prøvene stammer fra RNA isolering av høy /lav betennelse vevsprøver som er beskrevet i forrige avsnitt ble brukt for spop mutasjon skjermen. En primer par (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Tyskland) flankerer region av tilbakevendende spop mutasjoner er designet ved hjelp av open-source programvare Primer 3: Fwd, 5′-AAGGGTTCCAAGTCCTCCAC-3 «; Rev, 5»-CGGCACTCAGGAACCTTTAC-3 «[51]. PCR-amplifikasjon ble utført på 100 ng total-RNA ekvivalent med Taq DNA polymerase (Peqlab, Erlangen, D) i totalt 100 ul ved å bruke de følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 2 minutter; 40 sykluser av 95 ° C i 1 min, 62 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 1 min; forlengelse ved 72 ° C i 7 min. PCR-produktet mengde og størrelse ble kontrollert på 1,2% agarose Flash Gel (Lonza, Rockland, USA). DNA ble renset ved anvendelse av Qiagen PCR kit utvinning og sekvensert ved anvendelse av de samme primerne i henhold til en standard protokoll Sanger-sekvensering (Mycrosynth, Balgach, CH).
Siden frekvensen til detekterte spop mutasjoner var betydelig lavere enn den rapporterte i litteraturen [51], ble resultatene bekreftet ved metoden opprinnelig beskrevet av Blattner et al. [52], ble DNA isolert fra godartede og ondartede områder av frosne vevssnitt ved hjelp av AllPrep DNA /RNA Micro Kit. Etter en innledende pre-PCR forsterkning skritt å berike målet regionene, ble en høyoppløselig smelte analyse (HRM) gjennomføres. Denne analysen er rettet mot exon 6 og 7 av den spop gen som inneholder alle tidligere detekterte mutasjoner i prostata kreft (aminosyrer 80 til 106 og aminosyrer 120 til 140). Prøven som viste en bemerkelsesverdig endring i smeltekurven ble utvist for Sanger-sekvensering for å bekrefte og videre angi endring.
Resultater
Serumautoantistoffnivåer er forhøyet hos pasienter med prostatakreft med immunceller infiltrering av prostata
i et forsøk på å identifisere prostata kronisk inflammasjon assosiert autoantistoff ble prostata kreftpasienter som viser en lav eller en høy antall infiltrerende immunceller i deres radikal prostatektomi prøver underkastet analyse. For å identifisere høye og lave inflammasjon pasientkullene, tok vi fordel av antallet infiltrerende immunceller gjennom hele prostata. For hver pasient tjue til tretti vev lysbilder som representerer forskjellige områder av prostata ble farget for pan leukocytter markør CD45 å definere tumor-infiltrerende lymfocytter. En erfaren uropathologist gjennomført klassifisering i to grupper (høy /lav betennelse) i henhold til en histopatologisk klassifiseringssystem for kronisk prostatabetennelse [53]. Pasientprøver med ingen eller mild betennelse ble angitt som «low betennelse gruppe» og de med moderat og høy betennelse som «high betennelse gruppe». Kliniske parametre som alder, betennelse markør C-reaktivt protein (CRP), Gleason Score, prostatavolum, PSA og fri PSA ble likt fordelt blant de høye og de lave betennelse gruppene (tabell 1, S1 figur).
de serum autoantistoffprofiler av 38 høyt betennelse og 32 lav betennelse (kontroll) pasienter ble oppnådd for tilsvarende pre-kirurgi blodserumprøver ansette en 4012 rekombinant protein matrise skjerm (fig 1A). Utvalg av antigenet Prøvestykket ble basert på egen hånd og rapporterte data på autoantigener forbundet med prostatakreft, andre typer kreft og inflammasjonsrelaterte sykdommer slik som multippel sklerose eller lupus erythematosus, henholdsvis [31, 36-42] (S1 tabell). Autoantistoffer til 3919 autoantigener ble påvist i minst én av pasientene og antallet pasienter som testet positivt for autoantistoffer som svarer til en individuell autoantigen gikk fra 0 til 69 av 70 (S1 tabell). Med tanke på antall positive prøver i begge grupper ble generert en liste av 15 autoantistoffer mest på forskjellige måter som er tilstede i høy sammenlignet med den lave betennelse gruppen (fig 1B). Den topprangerte autoantistoffer mot spastin (SPAST, giI40806168) og prikk typen POZ protein (spop, giI56117827) var til stede i 37% og 42% av sera som stammer fra høye betennelse pasienter mens påvises i mindre enn 3% og 10% av sera fra betennelse kontrollpasienter lave. Evaluering av fold-endring for hver av de 997 autoantistoffer i høy sammenlignet med den lave styre betennelse gruppe, avslørte betydelig økt mengde (p 0,05) av 165 autoantistoffer i høy betennelses pasientenes kohort (figur 1C, S2 tabell). Ingen av dem ble bestemt utelukkende innenfor den høye betennelse gruppen. Interessant, intensitetsnivået av bare en autoantistoff (bindings antigen FEZF2, giI157388917) var signifikant redusert (log2-foldchange: -2,66, p-verdi: 0,002). I høy sammenlignet med den lave betennelse kontrollgruppen
Et flytskjema av strategien brukes for påvisning og kryss-validering av autoantistoff (AAB) signaturer i forbindelse med kronisk prostatabetennelse. Radikal prostatektomi prøvene ble klassifisert i to (høy /lav betennelse) grupper basert på omfanget av immuncelle infiltrasjoner i hele prostata. De tilsvarende pre-kirurgiblodserumprøver ble analysert for autoantistoffer (AAB) ved hjelp av en plan protein array (screening, n = 70). En kryssvalideringsstudie teste robustheten av identifiserte AAB panelet var basert på Luminex-perle protein array-teknologi (kryssvalidering, n = 63). Statistisk sammenligning av serum autoantistoff profiler i de lave og høye betennelses grupper ble brukt til å identifisere og validere ulikt rikelig AABS. De prostata vev uttrykk mønstre og uttrykk i ulike prostata kreft progresjon stadier ble etablert for tre utvalgte tilsvarende autoantigener (AAGs). B Bar diagram for positivt klassifisert observasjoner av de 15 mest forskjellig oppdaget autoantistoffer i høy betennelse gruppen sammenlignet med den lave betennelse gruppen. Data er uttrykt som prosentandel av totalt antall positive prøver i hver gruppe. C Beregning av ganger endring for hver autoantistoff viste en signifikant økning på 165 antigener i høy betennelse prostatakreft (panel øverst til høyre, p 0,05, fold change 2, Mann-Whitney Test) og en nedgang på bare én (øvre venstre panel ). D Grafisk fremstilling av de ti beste rangerte funksjonelle klynger tildelt for betennelser assosiert autoantistoffer ved hjelp av DAVID funksjonelle merknad verktøyet. Baren størrelse tilsvarer prosentandelen av identifiserte tilsvarende gener knyttet til en bestemt funksjonell kategori (P 0,05).
Vi lurte på om de 165 autoantistoffer betydelig forbedret med kronisk betennelse er assosiert med forskjellige funksjonelle klynger og derfor tilordnet dem til de tilsvarende gener for å utføre en funksjonell annotering gruppering ved hjelp av DAVID databasen. Flere anrikede molekylære funksjoner og biologiske prosesser ble identifisert. Av de ti beste merknads begrepene «protein lokalisering» dannet den største klyngen inneholder 14 forbundet gener som koder for proteiner involvert i vesikulær menneskehandel (GDI1, MYH9), endo- (CDC42) og eksocytose (STX18), kromatin binding (CHMP5) og cytotoksiske T -celle aktivering (CTLA) sikret cluster «makromolekylære kompleks subenheten organisasjon» er sammensatt av gener som er nødvendige for DNA-reparasjon (SF3B3), proteinsyntese (EIF2A), T-celle proliferasjon (FADD), og mikrotubuli demontering (STMN1, SPAST). Samlet, observerte vi at autoantistoffer overrepresentert i høye betennelses pasienter ble i hovedsak rettet mot strukturelle antigener og celleproliferasjonsprosesser assosierte proteiner (fig 1D, tabell 2).
antigener av serum-avledet autoantistoffer er uttrykt i prostata
for å belyse hvorvidt antigener av identifiserte autoantistoffer er uttrykt og muligens dysregulerte i prostatavevet, undersøkte vi uttrykket mønster av forskjellige target proteiner. For at tre søker antigener, Spastin (SPAST), prikk typen POZ protein (spop), og syntaxin 18 (STX18), ble valgt etter følgende kriterier: (i) autoantistoffer er blant topp forskjellig rikelig betennelse-assosiert seg i henhold til p-verdier og fold endring (S2 tabell); (Ii) antistoffer til IHC er kommersielt tilgjengelige, og de tilsvarende antigen-nivåer er tilstrekkelig for deteksjon immunhistokjemi i henhold til det humane proteinet Atlas (www.proteinatlas.org); (Iii) forbindelser med forskjellige krefttyper hadde blitt rapportert (tabell 3). En vev microarray inkludert vevsprøver av høye og lave betennelse pasienter i autoantistoff skjermen ble generert og brukt til immunhistokjemisk påvisning av disse autoantigen proteiner.
SPAST, spop og STX18 ble funnet uttrykt i epitelet av godartet og kreft områder i begge pasient kohorter. Kvantifisering av farging intensiteter avdekket en betydelig økt SPAST uttrykk i høy betennelse i forhold til lave betennelse prostata vevsprøver. Men spop og STX18 immunoreaktivitetene var uendret mellom høye og lave betennelse pasientprøver (fig 2a).
En Immunohistokjemiske stainings av representative vev microarray flekker fra høye og lave betennelse pasient kohorter. SPAST, STX18 og spop er uttrykt i epitel godartede (BE) og kreft (CA) områder for begge kohorter. Kvantitativ analyse ble utført ved hjelp av HistoQuest immunhistokjemi analyse programvare (TissueGnostics). En score ble beregnet ved å multiplisere fargeintensitet og prosentandelen av positivt fargede celler. n = 25 per gruppe. * P 0,05, Mann-Whitney Test. Bar, 100 pm.
