Abstract
Blære carcinogenesen antas å følge to alternative veier drevet av tap av kromosom 9 og gevinst på kromosom 7, om enn andre nonrandom kopi nummer endringer (CNAs) ble identifisert. Men bekreftelser studier nødvendig siden mange aspekter av denne modellen fortsatt uklare og betydelig heterogenitet blant saker har dukket opp. Ett av formålene med denne studien var å evaluere ytelsen til en målrettet test (UroVysion assay) er mye brukt for påvisning av overgangs Cell Carcinoma (TCC) av blæren, i to forskjellige typer av materiale avledet fra samme tumor. Vi sammenlignet resultatene fra UroVysion test utført på nylig isolerte interphasic Nuclei (FIN) og på formalinfiksert parafin Embedded (FFPE) vev fra 22 TCCS og vi finner ikke store forskjeller. Et annet mål var å vurdere samsvar mellom matrise-CGH profiler og målrettede kromosomprofilene for UroVysion analysen på et ekstra sett med 10 TCCS, for å vurdere om UroVysion er en tilstrekkelig følsom metode for identifisering av utvalgte aneuploidies og ikke-tilfeldig CNAs i TCCS. Våre resultater bekreftet viktigheten av globale genomiske screeningmetoder, det vil si gruppe basert CGH, for å bestemme omfattende de genomiske profiler av store serier av TCCS tumorer. Imidlertid har denne teknikken enda noen begrensninger, for eksempel ikke å kunne oppdage lavt nivå mosaicism, eller registrerer noen endring i antall eksemplarer for en slags kompenserende effekt på grunn av tilstedeværelsen av høy cellulær heterogenitet. Således er det fremdeles tilrådelig å bruke komplementære teknikker som matrise-CGH og fisk, som det tidligere er i stand til å detektere endringer i genomet nivå ikke eksklusive eventuelle kromosom, men den sistnevnte er i stand til å opprettholde den individuelle data på nivå med enkelt celler, selv om den fokuserer på noen genomiske regioner
Citation:. Panzeri E, Conconi D, Antolini L, Redaelli S, Valsecchi MG, Bovo G, et al. (2011) kromosomavvik i blærekreft: Frisk versus Formalin Fast Parafin Embedded Tissue og målrettet FISH versus Wide microarray-baserte CGH Analysis. PLoS ONE 6 (9): e24237. doi: 10,1371 /journal.pone.0024237
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 8 juni 2011; Godkjent: 03.08.2011; Publisert: 01.09.2011
Copyright: © 2011 Panzeri et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Associazione Gianluca Strada Onlus og ved Regione Lombardia, Ring per progetti indipendenti i Ambito oncologico 2009. finansiører hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er den syvende vanligste kreftformen i verden [1] og den fjerde mest vanlige kreften som påvises hos menn i. USA og europeiske land [2]. Transitional Cell Carcinoma (TCC) omfatter flertallet av blære kreft står for mer enn 90%. Ved presentasjon, de fleste (~70%) er overfladiske, exophytic, papillærtumorer som er godt differensiert (lavgradig, LG), og ikke trenge gjennom epitel basalmembran (stadium Ta) [1], [3]; den gjenværende er muskelen invasiv (T2-T4) eller mikroinvasiv tumorer (T1), som har trengt lamina propria, men er ikke invaderer muskelen. I denne minoriteten, er svulsten epitel dårlig differensiert (høyverdig, HG) og ofte forbundet med karsinom
in situ plakater (CIS), som til tross for sin overfladiskhet er sammensatt av dårlig differensiert epitel. Dette antas å være representativt for en forløper lesjon [1]. Prognose for LG Ta svulster er generelt bra fordi slike svulster sjelden fremgang, men overvåking er nødvendig gitt betydelig risiko for tilbakefall (opptil 70%) [4]; Dette er nødvendig også for HG Ta- (TAG3) og T1 svulster som representerer en høy risiko for progresjon til muskel invasjon. For pasienter med muskel invasive svulster (≥T2), er metastase et stort klinisk problem og cystectomies er vanligvis angitt. Prognosen er relativt dårlig med bare 50% overlevelse ved 5 år siden diagnosen [4].
De biologiske forskjeller mellom disse gruppene sannsynligvis reflekterer underliggende genetisk heterogenitet som fører til bestemte veier av svulst utvikling og progresjon. Utallige studier har sporet status kjente onkogener og tumorsuppressorgener og har avdekket flere tilbakevendende kromosomale endringer forbundet med den patologiske trinnet og /eller resultat av tumoren [5], [6]. Dessuten, basert på de kjente genetiske endringer av blærekreft, en multi-target fluorescens in situ hybridisering (FISH) assay er blitt utviklet [7]. Den UroVysion FISH deteksjonssystem, godkjent av US Food and Drug Administration, er basert på tre centromeric prober for kromosomer 3, 7 og 17 og en fjerde sonde til 9p21 regionen, for påvisning av kromosom aneusomy og /eller sletting av 9p21 locus som er vanlige genetiske endringer i TCCS [8], [9]. UroVysion er opprinnelig brukt i det siste tiåret bare for overvåking, men nylig også som en blære kreft screening verktøy hos pasienter med hematuri [10] – [12]. Imidlertid har andre metoder blitt brukt til å detektere kopinummer endringer knyttet til tumorutvikling og progresjon av TCC. Konvensjonelle komparativ genomisk hybridisering (CGH) studier har gitt en god del informasjon, inkludert identifisering av en rekke genomiske regioner av DNA forsterkning inneholder kjente eller kandidat onkogener [13] – [15]. På den annen side, har plasseringen av tumorsuppressorgener i TCC i stor grad blitt identifisert av tap av heterozygositet (LOH) analyse [16]. Med bruk av den høye oppløsning kartlegging av matrisebaserte CGH, ble nye kopi antall endringer (CNAS) identifisert i mange små genomiske regioner som ikke ble oppdaget i tidligere studier [17] – [19]. Dataene samlet inn så langt, i tillegg til identifikasjon av minst to cytogenetisk veier for tumorutvikling, dvs. tap av kromosom 9 og forsterkningen av kromosom 7 [20] – [22], kan være nyttige i å designe nye individualiserte behandlingsformer. Imidlertid bekreftelse studier er nødvendig, siden mange aspekter av denne modellen forblir uklar, spesielt på den kronologiske rekkefølgen av aberrasjoner i løpet av sykdomsprogresjon. For en fornuftig identifikasjon av genene som ligger til grunn kromosomavvik, blir det viktig å bruke pålitelige teknikker og å gå gjennom datavalideringsprosessen. Dette problemet ble nylig adressert for prostatakreft og brystkreft, hjernesvulst og myelomatose [23] – [27], men ikke for blærekreft. Selv Formalin Fast Parafin Embedded (FFPE) eksemplarer har flere fordeler, for eksempel vissheten om histologisk diagnose og lar retrospektive studier av et stort antall prøver, er friske vev betraktet som den mest pålitelige for molekylær genetisk analyse; de gir en omfattende analyse av biopsi, selv om materialet ikke har en histologisk diagnose.
Det første målet med denne studien var å evaluere ytelsen til en målrettet test i to forskjellige typer materiale som stammer fra samme svulst. I det første trinnet, sammenlignet vi resultatene av UroVysion test utført på nylig isolerte interphasic Nuclei (FIN) og på FFPE-vev fra 22 TCCS (figur 1). Videre, en andre mål var å vurdere samsvar mellom matrise-CGH profiler og målrettede kromosomprofilene, for å vurdere om UroVysion er en tilstrekkelig følsom metode for identifisering av utvalgte aneuploidies og ikke-tilfeldig CNAs i TCCS. Det andre trinnet i sammenligning ble brukt på et ekstra sett med 10 TCCS, mellom data fra enten matrise-CGH på FIN og fra UroVysion analyse på FFPE- vev (figur 1).
De to trinns strategi for analyse anvendt i denne studien
Resultater
First Step analyse. sammenlikning mellom UroVysion data fra FIN og FFPE
TCC kan skilles i høy eller lav karakter (HG eller LG) og i muskel invasiv eller ikke (iN eller NI). I det første trinnet av analysen 22 TCCS (9 LGNI, en LGIN, 3 HGNI, 9 HGIN) ble analysert ved UroVysion test brukt i to eksemplarer fra samme biopsi på FFPE og FIN prøver (figur 1).
I analysen basert på multinomisk modell, FIN data var generelt sammenlignes med de hentet fra FFPE motstykke i LGNI gruppe, i form av prosenter av tap, disomy og gevinst (tabell 1, for en detaljert liste, se tabell S2). I motsetning i HGNI gruppe de to typer analyser som genereres samstemmige resultater kun for CEP 3 (Kromosom Enumeration Probe 3). Faktisk i CEP 7 og CEP17, FIN tendens til å påvise en lavere andel av både tap (1,7 vs 10 for CEP 7, 6 vs 11,3 for CEP17) og disomy (42,7 vs 62,3 for CEP7, 48, 3 vs 60,7 for CEP17); dermed en høyere prosentandel av gevinsten ble rapportert (55,7 vs 27,7 for CEP7, 45,7 vs 28 for CEP 17). Til slutt, for Locus Spesifikk Identifier (LSI) 9p21 FIN tendens til å påvise en høyere prosentandel av både disomy (58,3 vs 20,0) og gevinst (10,3 vs 8,7), men en lavere andel av tap (31,3 vs 71,3). På den annen side, i HGIN gruppe de to typer analyser som genereres uoverensstemmende resultater kun for CEP 3: FIN tendens til å detektere en høyere prosentandel av tap (14,9 vs 2,2) og en lavere prosentandel av gevinst (48,1 vs. 62,5) enn FFPE.
Disse resultatene ble bekreftet i mer raffinert analyse av en Poisson modell (figur 2). I LGNI gruppe, gjennomsnittlig antall signaler for CEP3, CEP7, CEP17 og for 9p21 regionen var 2,3, 1,8, 2,0, 0,5 (i FIN prøver) og 2.4, 2.1, 2.2, 0.9 (i FFPE) med ingen signifikant forskjell mellom de to typer test (figur 2 A). På den annen side, i HGNI gruppe gjennomsnittlig antall signaler for CEP3, CEP7, CEP17 og for 9p21-regionen var 2,5, 2,9, 2,7, 1,8 (i FIN prøver) og 2,3, 2,3, 2,3, 1,2 (i FFPE) med statistisk signifikante forskjeller mellom de to testene med unntak av CEP3 (figur 2, B). Omvendt, i HGIN gruppe, gjennomsnittlig antall signaler for CEP3, CEP7, CEP17 og for 9p21 regionen var 2,5, 2,7, 2,3, 1,2 (i FIN) og 3.0, 2.7, 2.7, 1.2 (i FFPE-prøver), med betydelig forskjellen for CEP3 (figur 2, C).
Estimert telling av signaler observert i hver sonde (med 95% konfidensintervall) oppnådd i hver type svulst, sto for clustering. De rapporterte p-verdier viser til sammenligning mellom FFPE- og FIN metoder. Panel A = LGNI (9 pts); panel B = HGNI (3 pts); panel C = HGIN (9 pts).
Genomisk kopinummerendringer (CNAS) i nylig isolerte kjerner (FIN) ved matrise-CGH
I det andre steget i vår analyse vi urfremført matrise-CGH på et ekstra sett med 10 TCCS (6 HGIN, en HGNI, 3 LGNI), for å oppdage CNAs mellom svulst og referanse DNA. De hyppigste CNAs er oppsummert i tabell 2 (detaljert skjema i Tabell S3). Vi klassifisert prøvene inn i to kategorier: infiltrere tumorer (IN-TCCS: 70CR09, 81CR09, 04CR10, 09CR10, 10CR10, 26CR10) og ikke infiltrere svulster (NI-TCCS: 28CR09, 75CR09, 80CR09, 82CR09) (figur 3). Generelt, som forventet, IN-TCCS har mange flere CNAs enn NI-TCCS. 20Q gevinst ble delt av 4/6 IN-TCC tumorer, mens 2/4 NI-TCCS; 3p25.2 og 17q21 gevinster ved 4/6 IN-TCC svulster og 1/4 NI-TCCS; 5p og 20p gevinst ved 3/6 IN-TCC og 2/4 NI-TCCS; 6p22.3 og 11q13 ble delt bare av IN-TCC (3/6 og 2/6 henholdsvis); endelig 3Q og 8q var i 1/6 IN-TCCS og 1/4 NI-TCCS. For tapene: 9 p og 9p21 var i 4/6 og 3/6 IN-TCCS mens i 2/4 og 3/4 NI-TCCS; 9q32-Q34 var i 3/6 IN-TCCS og 2/4 av NI-TCCS; 2q tap var i 3/6 IN-TCCS og 1/4 NI-TCCS; 8p tap bare i 2/6 IN-TCCS
CNAs av 10 TCCS prøver. 6 infiltrerende svulster (IN-TCCS: 70CR09, 81CR09, 04CR10, 09CR10, 10CR10, 26CR10) til venstre, og 4 ikke – infiltrere svulster (NI-TCCS: 28CR09, 75CR09, 80CR09, 82CR09) til høyre. Hver punkter /linje svarer til en prøve. Tap er dokumentert i grønt mens gevinster i rødt.
For å identifisere mulig berikelse av funksjonelle grupper i genene innen regioner med gevinst og tap av HGIN og LGNI svulster, et gen ontologi merknad analyse var utført ved anvendelse av programvaren GOstat. For HGIN fremkom en statistisk signifikant underrepresentasjon (p 0,05) av gener som er involvert i celledifferensiering, i cellesyklus og i positiv regulering av apoptose og programmert celledød; i tillegg er en statistisk signifikant overrepresentasjon av gener som er involvert i celle-proliferasjon, og i regulering av apoptose. På den annen side analyse påvist for LGNI svulster en statistisk signifikant underrepresentasjon av gener som er involvert i induksjon av apoptose og programmert celledød (tabell S4)
Andre trinn av analysen.: Sammenligning mellom matrise-CGH profiler på FIN og UroVysion data på FFPE
neste utført FISH analyse ved hjelp av Urovysion test på ekstra sett med 10 TCCS analysert ved matrise-CGH; når det er mulig, ble to tumorale områder av den samme seksjon scoret for å øke antall celler analysert og for å få data så representativ som mulig, gitt den kjente heterogeniteten i denne type kreft. For hver probe ble utført en statistisk analyse for å bekrefte at signalet som teller på 100 celler var forskjellige med tanke på de to områdene separat eller blande dem sammen. Konkordant resultater mellom de to tumorområdene ble rapportert i to HGIN tilfeller (070CR09 og 081CR09) (figur 4, A); omvendt, statistisk signifikante resultater kontraster (p 0,05) ble rapportert i to HGIN tilfeller (009CR10 og 026CR10) (figur 4, B); i de resterende seks tilfeller statistisk signifikante forskjeller mellom de to tumor områdene ble dokumentert for en (010CR10), to (028CR09 og 080CR09) eller tre sonder (004CR10) (se også tabell S5). Disse data understreket den generelle høy intra-tumor heterogenitet av disse prøvene
Sammenligning mellom resultater på to utvalgte tumor områder av den samme delen av FFPE: (A):. De to mest samstemmige svulster (070CR09 og 081CR09); (B). De to mest uharmoniske svulster (009CR10 og 026CR10)
Så, vi har gjort et forsøk på å sammenligne UroVysion data på FFPE bare rapportert for de matrise-CGH profiler fra de 10 TCCS, beskrevet ovenfor. For dette formål for hver prøve vi ekstrapolert resultatene for matrise-CGH analyse som svarer til de fire UroVysion målrettede kromosomer og sammenlignet med fisk data (Tabell 3). Full konkordans ble funnet bare for 28CR09 (HGNI) og 09CR10 (HGIN) (grå områder i tabell 3). Imidlertid, for andre tumorer, en forholdsvis god korrelasjon ble observert mellom de to teknikkene; dvs. for svulster 010CR10 og 070CR09 (begge HGIN) konkordansen ble dokumentert for 3/4 målrettede kromosomer. Se figur 5 for to eksempler på mer overensstem (D) og mindre overensstem (E) data. Jo større samstemmighet ble sett på kromosom 3 (7/10), mens de andre målrettede kromosomene viste en rimelig korrelasjon (6/10). For eksempel, i 082CR09 (LGNI) og i 04CR10 (HGIN), ble 9p21 tapene bare bevises ved FISH-analyse; på den annen side forsterknings ved locus 3p25 for 028CR09 (HGNI) og for 070CR09 (HGIN) fremkom bare fra matrise-CGH-data. For å validere matrise-CGH data og å skille en polysomy av kromosom 3 fra en sann forsterkning, ble FISH analyse utført med både Urovysion test analyse og dual-color split probe PPARy (3p25), på to påfølgende FFPE- deler av 028CR09 ( Figur 5, C). En statistisk analyse av signalet teller på 100 kjerner vurderes den sanne forsterkning på 3p25 hensyn til en polysomy av kromosom 3 (
t test
: p 0,01).
Urovysion test brukes til: (A ): FIN prøve 032CR07 (HG NI); (B): FFPE prøve 080CR09 (LG NI). (C) FISH med
PPAR
γ sonde på 028CR09 (HGNI). Urovysion versus matrise-CGH data: eksempel på samstemmige data (D), (eksempel 080CR09); og ikke-samstemmige data (E), (prøve 004CR10).
Diskusjoner
Til tross for omfattende forskning på genetiske endringer av blærekreft og detaljerte modeller som knytter slike endringer til startfasen og progresjon [20] – [22], er det få pålitelige markører for å skille svulster med aggressive egenskaper på tidspunktet for tidlig diagnose og vi er fortsatt på jakt etter den metoden for valg for å oppdage dem. I denne forbindelse har en fersk prospektiv studie selv antydet at cystoskopi alene er fortsatt den mest kostnadseffektive strategi for å oppdage tilbakefall av blærekreft ikke invadere muskel [28]. Men i motsetning til hva som tidligere er rapportert av andre [29], flere forfattere hevdet den samme konklusjonen [30], og rollen til Urovysion i mistenkelige urinprøver forble tvilsom, spesielt i lys av sin høye kostnader.
utvikling av matrise-CGH ført til muligheten for å analysere hele genomet i et enkelt eksperiment, noe som tyder på dens mulige anvendelse i screening /overvåkingsprogrammer av kreftpasienter. I tilfelle av blærekreft, ville matrise-CGH gi mulighet for å analysere DNA fra en biopsi av tumoren, mens ved Urovysion urinprøvene er vanligvis analysert.
De viktigste ulempene med denne teknikken er at selv hvis den er spesifikk og følsom, er det invasiv og likevel kostbar. Videre til dags dato er det ingen tilstrekkelige data som støtter bruk av matrise-CGH i denne type programmer, men det kan være interessant å bruke denne teknikken for pasientenes kategorier med høy kreftrisiko.
multitarget Urovysion analysen har blitt utviklet for påvisning av TCC i urinprøver [7]. Den optimale FISH probe sett ble bestemt ved å teste forskjellige prober for deteksjon TCC i urin fra pasienter med blærekreft og velge de som enten var den mest følsomme individuelt eller som suppleres andre sonder for å forbedre den totale følsomheten av testen. CEP prober og LSI 9p21 var utfyllende fordi CEP sonder oppdage hyperdiploidy, vanlig i carcinoma
in situ Hotell og invasiv TCC, mens LSI 9p21 sonden registrerer sletting av 9p21 bandet, vanlig i non-invasiv TCC [7 ]. Det har tidligere vært foreslått at et falskt negativt resultat FISH utgjør for det meste lavgradig TCC som ikke kaster tumorceller i urinen eller ikke fremvise den kromosomale endringer som er detektert av analysen [11]. En annen grense, og en annen mulig forklaring for falske negative resultater FISH, kan tilbakeføres til det lave antall av neoplastiske celler til stede i prøvene [30].
I det første trinnet i denne studien sammenlignet ytelsen dette multitarget assay for påvisning av blæretumorceller både i FIN, uten histologisk diagnose og selv med et lavt antall av neoplastiske celler, og i FFPE vev. Vår analyse dokumentert en god korrespondanse av Urovysion FISH data mellom FIN og FFPE for LGNI og HGIN svulster; spesielt, i førstnevnte gruppe, FIN tendens til å detektere et mindre antall signal i forhold til FFPE, mens i den sistnevnte gruppe en motsatt tendens ble verdsatt. For HGNI TCCS, signifikante forskjeller dukket opp for tre målrettede sonder, men det kan være på grunn av lavt antall prøver av denne gruppen. Utførelsen av denne målrettede testen er derfor tilstrekkelig akseptabelt også på FIN prøver; dessuten de samme CNAs ble trofast gjenspeiles av analysen på FFPE. Det gjenstår å undersøke om det er en effektiv metode for å påvise de mest representative og effektive CNAs av TCCS. For dette formål, i det andre trinn i denne studien, ble matrise-CGH utføres på 10 flere TCCS å dissekere spekteret av endringer i blærekreft og for å identifisere vendende avvik som kan inneholde kreft-relaterte gener.
oppdaget en rekke genetiske endringer ved matrise-CGH: den hyppigste tap involvert kromosom 9 p-arm mens den hyppigste gevinst involvert kromosom 20Q-arm, som tidligere rapportert av andre [5], [6], [14], [18], [19]. Overraskende, vi fant ikke en høy andel av svulster med gevinst på 6p22.3 og 8q rapportert i andre studier [14], [18], [19]. LOH og underrepresentasjon av kromosom 9 er den hyppigst beskrevne genetisk endring i TCC (mer enn 50%). Den vanlige tap av en hel kopi av kromosom 9 indikerer tilstedeværelse av tumor suppressor gener både på 9 p og 9q, og kandidat gener har blitt identifisert i flere regioner, inkludert 9p21 (
CDKN2A
), 9q12-13 (
ptch
), 9q32-33 (
DBC1
) og 9q34 (
TSC1
). I denne studien ble det observert fullstendig eller delvis tap av 9 p og /eller 9q i 7/10 tumorer, både HG og LG. Videre, i noen HG observerte vi en gevinst for dette locus, selv om dette kan være på grunn av kromosom 9 polyploidi (som tegn på kromosom ustabilitet). Den hyppigste forsterkningen er 20Q (6 tumorer), i overensstemmelse med data som tidligere er rapportert i mange andre kreftformer, inkludert blære, tykktarm, eggstokk og bryst [31]. Association of 5p og 20Q gevinster, som finnes i 3 HG svulster, rapportert av Bruch [32], kan være assosiert med progresjon. Endelig er gevinst på 17q21 kun identifisert i HG svulster, noe som tyder på en mulig rolle i tumorprogresjon.
Det mest interessante med denne studien er å sammenligne matrise-CGH data og Urovysion FISH data. Faktisk dokumentert vi ikke bare en høy intra og inter-tumor heterogenitet i FFPE materiale, som kom ut fra analyse av to forskjellige tumorale områder av den samme tumor; Vi har også funnet noen avvik i de to teknikkene som kan delvis tilskrives en mulig maskeringseffekt fra normale celler eller til en kompenserende effekt avledet fra den store svulsten heterogenitet. Denne heterogenitet har allerede blitt beskrevet av vår gruppe i blærekreft stilk-liknende celler som er genetisk forskjellige [33]. Vi kan tyde på at dette mangfoldet skaper levedyktige og clonally relatert subpopulasjoner som blir heterogene i samme svulst.
De overordnede utvalg-CGH data streket nok en gang på tilstedeværelsen av hyppige endringer (dvs. 20 p og 5p gevinster) som ikke kan påvises ved Urovysion assay. En ytterligere fordel ved å anvende en integrert teknisk tilnærming fremkom for 028CR09 prøve: forsterkningen av 3p fremgår av matrise-CGH ble studert ved FISH med Urovysion-analyse og en LSI 3p sonde. Gjennom integrering av flere metoder, var vi i stand til å diskriminere den sanne forsterkning fra et kromosom 3 polysomy. Dette locus omfatter peroxisome proliferator-aktivert reseptor gamma (
PPARG
), en ligand aktivert transkripsjonsfaktor involvert i regulering av proliferasjon og differensiering av urothelium [34], [35].
I konklusjonen betydelig innsats er fortsatt nødvendig å definere de genene som ligger til grunn kromosomavvik til en bedre forståelse av de genetiske mekanismene for å utvikle nye terapeutiske strategier. Våre resultater bekreftet viktigheten av globale genomiske screeningmetoder, det vil si gruppe basert CGH, for å bestemme omfattende de genomiske profiler av store serier av TCCS tumorer. Imidlertid har denne teknikken enda noen begrensninger, for eksempel ikke å kunne oppdage lavt nivå mosaicism, eller registrerer noen endring i antall eksemplarer for en slags kompenserende effekt på grunn av tilstedeværelsen av høy cellulær heterogenitet. Således er det fremdeles tilrådelig å bruke komplementære teknikker slik matrise-CGH og fisk, som det tidligere er i stand til å detektere endringer i genomet nivå ikke ekskludere noen kromosom, men den sistnevnte er i stand til å opprettholde de enkelte dataene på nivået av enkeltceller , selv om den fokuserer på noen genomiske regioner.
Materialer og metoder
En detaljert skjemaet finner du i materialer og metoder S1.
Denne studien ble godkjent og grunnlagt av Direzione Generale Sanita Regione Lombardia og presentert av general direktør og etikk engasjement av ICP Hospital Bassini. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra deltagerne før vev samling.
Pasienter og prøver
I alt 32 tumorprøver (28 menn og 4 kvinner) ble oppnådd ved transurethral reseksjon i en sammenhengende serie av pasienter nylig diagnostisert med TCCS på et enkelt senter (tabell S1). Informert samtykke ble innhentet før vev samling. Staging og gradering ble gjort i henhold til Verdens helseorganisasjon Consensus Klassifisering [1]. De ble preget i høy eller lav karakter (HG eller LG) og i muskel invasiv eller ikke (IN eller NI).
Fluorescens in situ hybridisering
For FIN, biopsier ble kuttet opp og kultivert i RPMI-1640 (Euroclone Spa) supplert med 20% FCS i 24 timer. Stykkene ble utsatt for hypoton behandling og fiksert med 3: 1 metanol: eddiksyre. Enkle celler isolert fra biopsier med eddiksyre 60%, ble oppdaget på lysbilder og la tørke. For FFPE, ble vev fastsatt i henhold til standard prosedyrer.
Forbehandling og FISH analyse ble utført på begge kjerner isolert fra FIN og FFPE prøver ved hjelp UroVysion blærekreft kit (Vysis, Wiesbaden, Tyskland), i henhold til produsentens instruksjoner .
etter hybridisering de ikke-bundne probene ble fjernet ved en serie av vaskinger og kjerner ble motfarget med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI).
minst 100 celler for hvert preparat ble bedømt, og de signaler som ble delt i henhold til tap (antall signaler /celle 2), disomy (antall signaler /celle = 2) og forsterkningen (antall signaler /celle 2).
For locus 3p25 FISH analyse på FFPE ble utført ved hjelp av Poseidon ™ Gjenta Free ™ PPARy (3p25) Break probe (Kreatech Diagnostics, Amsterdam, Nederland). Den statistiske signifikans av forskjeller mellom kromosom 3 polisomy og 3p25 forsterkning ble evaluert av Student t test på egne tellinger av 100 kjerner. Forskjeller ble ansett som statistisk signifikant med p. 0,01
Alle digitale bildene ble tatt med en Leitz mikroskop (Leica DM 5000B) utstyrt med en kostnad kombinert enhet (CCD) kamera og analysert ved hjelp av Chromowin programvare (Tesi Imaging, Milano, Italia).
Array-CGH
For matrise-CGH analyse, genomisk DNA ble ekstrahert fra ferske biopsier etter enzymatisk nedbrytning med kollagenase H (Roche, Mannheim, Tyskland) og proteinase K (Roche, Mannheim, Tyskland) og renset ved hjelp av fenol /kloroform (Carlo Erba, Milano, Italia). Prøveopparbeidelse, sklie hybridisering, og analyser ble utført ved hjelp av SurePrint G3 Menneskelig CGH Microarray 8x60K (Agilent, Santa Clara, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Sex-matchet kommersielle DNA-prøver (Promega) ble brukt som referanse DNA under matrise-CGH. Arrays ble skannet ved 2-mikrometer oppløsning ved hjelp av Agilent microarray scanner og analysert ved hjelp Feature Extraction v10.7 og Agilent Genomisk Workbench v5.0 programvare. Den aberrasjon Detection Method 2 (ADM2) algoritme bedt av Genomisk Workbench programmet ble brukt til å beregne og bistå identifisering av avvik for en gitt prøve (terskel = 5; log2 ratio = 0,3). For å beregne den estimerte andelen mosaicism vi brukte formelen bestemmes av Cheung SW et al. [36].
Gene ontologi analyse
For å analysere hvilke ontologi klassene var over- og underrepresentert blant de genene avgrenset innenfor gevinst og tap regioner oppdaget av matrise-CGH, den GOstat programvare ( tilgjengelig på https://gostat.wehi.edu.au/) ble benyttet [37] basert på Amigo (Gene ontologi database) versjon 1.8.
Statistisk analyse
Cases ble beskrevet av å beregne proporsjonene for tap, disomy og gevinst på den totale av minst 100 celler, spesielt for type analyse (FFPE og FIN), og sonde fra UroVysion test.
A multinomisk modell står for tilstedeværelse av clustering ble brukt til å beregne for hver type svulst og type analyse, den totale andelen av tap, disomy og gevinst med 95% konfidensintervall. Denne modellen ble også anvendt for å sammenligne de samlede andelene av tap, disomy og forsterkning detektert av de to typer av analyser.
A Poisson modell basert på logaritmisk transformasjon av tellinger i nærvær av samling ble anvendt for å beregne antall av signaler som detekteres av hver type av analyse med 95% konfidensintervaller. Denne modellen aktivert også å sammenligne antall signaler på tvers av de to typer analyser (FFPE- og FIN).
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Clinicopathologic kjennetegn ved 32 tumorprøver av studien. Histologi /Grade og fase av studien er angitt
doi:. 10,1371 /journal.pone.0024237.s001 plakater (DOC)
Tabell S2.
UroVysion testresultater på nylig isolerte interphasic atomkjerner (FIN) og på formalinfiksert parafin innebygd atomkjerner (FFPE).
doi: 10,1371 /journal.pone.0024237.s002 plakater (DOC)
tabell S3.
Kopier nummer endringer (CNA) delte (plusstegn) blant 10 TCC prøver analysert ved matrise-CGH. NI-TCCS er angitt i kursiv; IN-TCCS er uthevet. For Histologi /Grade se tabell S1
doi:. 10,1371 /journal.pone.0024237.s003 plakater (DOC)
Tabell S4.
Gene ontologi. I. Statistisk signifikant (p 0,05) underrepresentasjon av genet ontologi (GO) kategorier i HG i tumorer. II. Statistisk signifikant (p 0,05) overrepresentasjon av genet ontologi (GO) kategorier i HG i tumorer. III. Statistisk signifikant (p 0,05) underrepresentasjon av genet ontologi (GO) kategorier i LG NI svulster
doi:. 10,1371 /journal.pone.0024237.s004 plakater (DOC)
Tabell S5.
Urovysion data. I. Sammenligning mellom Urovysion data i to forskjellige tumor områder av den samme seksjon II. Sammenligning mellom Urovysion data i to forskjellige tumor områder av den samme delen
doi: 10,1371 /journal.pone.0024237.s005 plakater (DOC)
Materialer og metoder S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0024237.s006 plakater (DOC)
