Abstract
Bakgrunn
Tissue factor (TF) pathway inhibitor (TFPI) eksisterer i to isoformer; TFPIα og TFPIβ. Begge isoformene er celleoverflaten festet hovedsakelig gjennom glykosylfosfatidylinositol (GPI) anker. TFPIα er også foreslått å binde andre overflatemolekyler, som glykosaminoglykaner (GAG). Celleoverflate TFPIβ har vist seg å utøve høyere antikoagulerende aktivitet enn TFPIα, noe som tyder på alternative funksjoner for TFPIα. Ytterligere karakterisering og søke etter nye TFPI bindingspartnere er avgjørende for å fullt ut forstå de biologiske funksjonene i cellen knyttet TFPI.
metoder og resultater
Potential sammenslutning av TFPI til heparansulfat (HS) proteoglykaner i syndecan familie ble evaluert av slå ned studier og flowcytometri analyse. Celleoverflaten colocalization ble vurdert av konfokal mikroskopi, og morssiden eller immunoutfelling fulgt av Western blotting ble brukt til å teste for protein interaksjon. Heparanase ble brukt til å enzymatisk nedbryter celleoverflate HS GAG. Antikoagulerende potensiale ble evaluert ved anvendelse av en faktor Xa (FXa) aktivitetsanalyse. Slå ned av syndecan-3 i endotelceller, – glatte muskel- og brystkreftceller redusert TFPI overflatenivået med 20-50%, og en sammenslutning av TFPIα til syndecan-3 på celleoverflaten ble demonstrert. Western blotting indikerte at TFPIα ble funnet i kompleks med syndecan-3. Den TFPI bundet til syndecan-3 hemmet ikke FXa generasjon. Fjerning av HS gags ikke slipper TFPI antigen fra cellene.
Konklusjoner
Vi viste en sammenheng mellom TFPIα og syndecan-3 i vaskulære celler og i kreftceller, som ikke ser ut til å avhenge på HS gags. Ingen antikoagulerende aktivitet ble påvist for TFPI forbundet med syndecan-3, noe som kan tyde på koagulasjon uavhengige funksjoner for denne celleassosiert TFPI bassenget. Dette vil imidlertid kreve ytterligere undersøkelser
Citation. Tinholt M, Stavik B, Louch W, Carlson CR, Sletten M, Ruf W, et al. (2015) Syndecan-3 og TFPI Colocalize på overflaten av Endothelial-, Smooth muskel- og kreftceller. PLoS ONE 10 (1): e0117404. doi: 10,1371 /journal.pone.0117404
Academic Redaktør: Aamir Ahmed, University College London, Storbritannia
mottatt: 13 januar 2014; Godkjent: 23 desember 2014; Publisert: 24 januar 2015
Copyright: © 2015 Tinholt et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Dette arbeidet ble finansiert av forskningsmidler fra Helse Sør-Øst Norge RHF, Hamar, Norge og A. Jahre og HG Andrine Berg son stiftelser. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tissue factor (TF) pathway inhibitor (TFPI) er den endogene inhibitor av TF-indusert blodkoagulering, og den finnes i to isoformer; TFPIα og TFPIβ. Begge isoformene utøver antikoagulerende aktivitet ved binding til de aktive områder av den TF-faktor VIIa (FVIIa) kompleks og til faktor Xa (FXa) [1, 2]. Endotelceller står for det meste av TFPI produksjon, men TFPI ekspresjon er også blitt demonstrert i andre celletyper, så som monocytter, glatte muskelceller, blodplater [3-5], og i flere brystkreftcellelinjer [6, 7].
TFPIα består av tre tandem Kunitz inhibitoriske domener og et høyt positivt ladet C-terminale ende [8], mens TFPIβ inneholder de to første Kunitz-domener, etterfulgt av en annen C-terminal som koder for et glykosylfosfatidylinositol (GPI) festesignal peptid, dirigere det til celleoverflaten [1, 9]. På grunn av disse ulikheter er TFPIβ utelukkende bundet til cellemembranen, mens TFPIα kan enten bli utskilt til det ekstracellulære miljø, eller være bundet til celleoverflaten via en ennå uidentifisert GPI-bundet molekyl, og i noen grad til heparansulfat (HS ) proteoglykaner (HSPGs) [9-12]. Funksjonen til celleoverflate assosiert TFPI er ikke godt anerkjent, har imidlertid TFPIβ blitt foreslått å være ansvarlig for det meste av den antikoagulerende aktivitet på celleoverflaten, noe som indikerer en alternativ rolle av den cellebundne full-lengde spleisevariant TFPIα [2]. Videre undersøkelser av celleoverflaten forbundet TFPI og antatte bindende partner (e) er derfor av avgjørende betydning for funksjonell forståelse av dette molekylet.
HSPGs er molekyler som stikker ut fra cellemembraner eller ekstracellulære matrise. Det er to store familier; de syndecan og glypican familier som består av fire og seks genvarianter, henholdsvis. Uttrykket mønster av HSPGs er svært regulert i en developmental-, spatial-, og celletype spesifikk måte [13]. Syndecans er transmembrane proteiner, mens glypicans er GPI-forankrede proteiner som mangler direkte cytoplasma-tilkobling. Både glypicans og syndecans hold glykosaminoglykaner (GAG), hovedsakelig HS kjeder, som er kovalent bundet til proteinet kjerne [13, 14]. HS kjedene er av stor funksjonell betydning, ettersom de kommuniserer med og binder seg til et bredt spektrum av biologisk effektor proteiner, som kjemokiner, vekstfaktorer og ekstracellulære matrisekomponenter. Gjennom disse interaksjoner, HSPGs delta i mange viktige cellulære handlinger, for eksempel celle adhesjon, spredning, differensiering og migrasjon. HSPGs kan modulere ligand-reseptor binding ved å konsentrere cytokiner i umiddelbar nærhet til deres høye affinitet reseptorer, eller fungere som co-reseptorer, og dermed fremme effektiv signaloverføring [14, 15]. HSPGs kan også være involvert i patofysiologien, inkludert kreft. Modulasjonene av sulfate mønster av HS-kjedene har vist seg å forbedre vekstfaktorbindende og akselerere proliferasjon i kreftceller [16].
Det er blitt foreslått at HSPGs kan virke som reseptorer for internalisering av TFPI-FXa-komplekser i endotelceller, noe som bidrar til den antikoagulerende effekt av TFPI [17]. Videre TFPI er blitt vist å binde seg til glypican 3 i leverceller [18], og syndecan 4 renset fra endotelceller [19]. Den Kunitz domene 3 og den C-terminale ende av TFPIα er nødvendig for optimal binding til endotele celleoverflater [20, 21] og hepatomceller [22], som tyder på at bare de TFPIα isoform forbinder med HSPGs.
Siden det har blitt foreslått at TFPI kan være assosiert med HSPGs [17-19], forsøkte vi å ytterligere karakterisere naturen av cellebundne TFPI. Dette ble utført ved å evaluere ekspresjon av syndecans 1-4 og bindingen potensialet av endogent uttrykt TFPI for å syndecans på celleoverflaten av primære humane endothelial- og glatte muskelceller, og basalbrystkreftceller.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
N /A
Reagenser
Silencer negativ kontroll siRNA # 5 (AM4642) ble kjøpt fra Ambion (Foster City, CA, USA). Spesialdesignet sirnas mot syndecans ble produsert av Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Tyskland) (S1 tabell). Kanin-anti-human vevsfaktor pathway inhibitor IgG 4901 /ADG72 og rekombinant full lengde TFPI (ADG49) ble oppnådd fra American Diagnostica (Stamford, CT, USA). Geit-anti-TFPIα ab9881 og kanin anti-syndecan-3 ab63932 var fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Kanin-IgG-UNLB og geit anti-kanin IgG (H + L) -RPE var begge fra Southern Biotechnology Associates (Birmingham, AL, USA). Anti-syndecan-3 (sc-30883), anti-syndecan-3 (sc-9495), den syndecan-3 293T kontroll lysat (sc-176304), normal geit IgG (sc-2028), anti-aktin (SC- 1616), og A /G-agarosekuler (sc-2003) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology, USA. Rekombinant syndecan-3 (3539-SD), det sekundære antistoffet anti-geit IgG HRP (HAF109), og rekombinant humant Active heparanase (7570-GH) var fra R # CC-2585, Lot no 6F4194, Lonza.) [7] ble cultered i EBM-2 (Lonza). All tidligere nevnte cellemateriale med kosttilskudd har blitt beskrevet tidligere [7]. De menneskelige coronary artery glatte muskelceller (HCASMC;. # CC-2583, Lot no 3F0172, Lonza) [23] ble dyrket i SmBM basal medium med SmGM-2 Enkelt Quots vekstfaktorer og 10% FCS. Cellene ble dyrket ved 37 ° C i en fuktig atmosfære og 5% CO
2.
QRT-PCR
Analyser for de fire syndecans ble utformet ved hjelp av Universal Probe Library, Probe Finder programvare (Roche Applied Sciences). Probe ID og primer sekvenser er gitt i S2 tabell. cDNA (19 ng) ble forsterket i tre paralleller av kvantitativ real time PCR (QRT-PCR) med 100 nM sonde og 200 nM primere (Eurogentec). En kunstig negativ kontroll uten syndecan uttrykk (Ct = 40), og en endogen kontroll (18S) Ct verdi fastsatt til gjennomsnittet av alle celletyper servert å beregne relativ mRNA kvantitet (RQ) av syndecans ved ΔΔCt metoden. For en mer detaljert beskrivelse henvises til vår forrige publisering [7].
Små forstyrre (si) RNA transfeksjon
Basert på tidligere optimalisering eksperimenter, celler ble transfektert med siRNA rettet mot syndecan 1 -4, ved hjelp Lipofectamine 2000 i henhold til produsentens anbefalinger. Kort sagt ble cellene sådd ut i 6-brønns eller 12-brønners plater for å oppnå 30-50% konfluens den følgende dag og transfektert med 5 eller 2,5 ug Lipofectamine og ett eller 0,5 nmol siRNA, i et totalt volum på 2 eller 1 ml frisk medium, respektivt. Lipofectamine-inneholdende medium ble erstattet med friskt medium 5 timer etter transfeksjon. Celler ble tillatt å vokse i 2-3 dager før analyse.
Strømningscytometri
cellene med transient slå ned fra syndecans ble analysert for celleoverflatebinding av en TFPI spesifikt antistoff, i alt vesentlig som beskrevet tidligere [7]. Forskjeller i TFPI celleoverflatenivåer ble beregnet og presentert som prosentvis reduksjon sammenlignet med kontrollceller (middelverdier ± SD) basert på median fluorescens intensitetsverdier. Median fluorescens-verdier for celler merket med irrelevant kanin-antistoff ble betraktet som uspesifikk binding, og ble korrigert for i hver enkelt prøve. Celler transfektert med negativ kontroll siRNA og merket med irrelevant anti-kanin-antistoff tjente til å bestemme bakgrunnsnivået når histogram plottene ble opprettet (referert til som «irrelevante»). Syndecan-3 celleoverflatenivåer ble bestemt på samme måte ved hjelp av en syndecan-tre spesifikt antistoff.
heparanase og heparinase behandling
For å degradere celleoverflate HS gags, sammenflytende celler i 12-brønners brett ble vasket to ganger med PBS før behandlet med heparanase (1 ug /mL) eller heparinase i + III (2U /ml) i serumfritt medium (SFM) i 4-16 timer. SFM inneholdende det passende bærerbuffer tjente som en kontroll. Etter behandling ble supernatanter oppsamlet, og cellene ble vasket to ganger før lysis. Effekten av heparinase behandling ble bekreftet ved Western blotting med D-heparansulfat antistoff som gjenkjenner HS neo-epitoper generert av fordøyelsen av HS av heparinase I + III.
Konfokalmikroskopi
Celler ble utsådd på sterile laminin belagte objektglass og inkubert over natten ved 37 ° C. Den følgende dag ble cellene vasket tre ganger i PBS og fiksert i 10 minutter i 4% paraformaldehyd, behandlet i 15 min i 100 mM glycin (pH 7,4), og vasket tre ganger før blokkering i 2 timer i høy blokkeringsløsning (0,9% NaCl, 0,5% Na
3Citrate, 3% BSA og 40 ng /ul human γ-globulin) med konstant skråstilling. Deretter ble cellene inkubert med 5 ug /mL geit-anti-TFPI-antistoff (ab9881), bestemt til TFPIα, i en lav blokkeringsoppløsning (0,9% NaCl, 0,5% Na
3Citrate, 1% BSA og 40 ng /ul human y-globulin) i 4-5 timer. Cellene ble vasket fem ganger i PBS før de ble inkubert i 1,5 timer med 1: 1500 Alexa Fluor 488 esel anti-geit-antistoff, vaskes igjen fem ganger og inkubert med 5 ug /ml kanin-anti-syndecan-3-antistoff (ab63932) over natten ved 4 ° C under konstant tilting. Den neste dag ble cellene vasket fem ganger, og til slutt ble inkubert med 1: 1500 Alexa Fluor 633 Geit-anti-kanin-antistoff i 1,5 timer. Alle antistoff inkubasjoner ble utført ved 4 ° C. Celler ble skannet med en LSM 710 konfokal mikroskop (Zeiss, GmbH, Jena, Tyskland) med en 40x vann nedsenking objektiv. Den TFPI signalet ble eksitert ved 488 nm, med utslipp målt mellom 500-600 nm. Den syndecan-3 signal var spent på 633 nm, med utslipp målt over 640 nm. Pinhole bredde ble satt til en Airy-enhet, og bilder ble oppsamlet med en optisk skive tykkelse på 1 pm. Confocal bilder ble de-foldet for å kompensere for optisk forvrengning ved å ansette Huygen Essential-programvare (Scientific Volume Imaging B.V .; Laapersveld, Nederland). Bilder ble analysert og presentert ved hjelp av Image J programmet (versjon 1.4.3.67).
Lyseringsfor buffere og immunoutfellingsstudier eksperimenter
Sum102 celler, HCAECs og HCASMCs ble høstet i Triton lysis buffer (20 mM HEPES , pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, 0,2% aprotinin, 0,6% 100 mM fenylmetylsulfonylfluorid PMSF og 1,0% fosfatase-inhibitor cocktail) for native (ikke-reduserende) PAGE-analyse og for immunoutfellingsstudier eksperimenter (reduserende betingelser).
2 ug anti-syndecan-3 eller normal geit IgG (negativ kontroll) ble tilsatt til hvert cellelysat og inkubert i immunopresipitering over natten ved 4 ° C. De immunkomplekser ble samlet av protein A /G agarose perler og vasket tre ganger i Triton lysis buffer før koking i SDS lasting buffer etterfulgt av SDS-PAGE analyse.
PAGE analyser og immunoblotting
Protein celle lysater, immunopresipitater og rekombinant TFPI protein (100 ng) ble analysert på prefabrikerte 4-15% Kriterium Tris-HCL-geler (# 345-0028, BioRad Laboratories) med (reduserende) eller uten 0,1% SDS (ikke-reduserende betingelser) i Tris /Glycine /SDS (25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% SDS, pH 8,3, # 161-0772,) eller Tris /glysin rennende buffer (25 mM Tris, 192 mM glysin, pH 8,3, # 161-0771, BioRad Laboratories), respektivt. En innfødt prøvebuffer (# 161-0738, BioRad Laboratories) ble brukt for ikke-reduserende betingelser. Proteinene ble blottet på PVDF-membraner (RPN 303F, GE Healthcare), som ble blokkert i 1% kasein i TBST i 60 min ved romtemperatur, inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer, vasket tre ganger 10 min i TBST og inkubert med et pepperrot-peroksydase-konjugert sekundært antistoff. Blottene ble utviklet ved hjelp av ECL Prime (RPN 2232, GE Healthcare). Den kjemiluminescerende signaler ble påvist ved Las 1000 (Fujifilm, Tokyo, Japan). Immunoblot av immunopresipitater ble strippet i 30 minutter mellom antistoffer. For nativ PAGE ble to identiske immunoblotter parallelt for å sikre konkrete signaler fra anti-TFPIα og anti-syndecan-3. Deretter ble immunoblot ble strippet i 45 min (Pierce) og reprobed for å bekrefte at antistoffene gjenkjennes et proteinkompleks med identisk størrelse. ImageJ ble brukt for densitometrisk kvantifisering av protein band på immunoblotter.
TF-FVIIa aktivitet
HCAEC og Sum102 celler ble transfektert med siRNA mot syndecan-3 (48 h) i 12-brønners plater som beskrevet ovenfor. Celler ble vasket to ganger i vaskeoppløsning (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 4 mM KCl og 11 mM glukose, pH 7,5) og inkubert i en time ved 37 ° C i reaksjonsoppløsningen (vaskebuffer med 5 mg /ml BSA og 5 mM CaCl
2, pH 7,5) inneholdende 10 nM FVIIa og 175 nM FX. Etter inkubering ble 50 pl overført til 100 ul stoppoppløsning (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM EDTA, og 1 mg /ml BSA, pH 7,5) på is før inkubert med 50 ul FXa substrat (CS-11 ( 22)). Absorbansen ved 405 nm ble målt ved 37 ° C i 45 min ved 15 sek intervaller ved hjelp av en Spectra Max Plus 384 mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Den maksimale hastigheter (V
max) i mU /min ble anvendt for å beregne mengden av FXa generert ved hjelp av en standardkurve oppnådd med kjente konsentrasjoner av FXa. HCAEC-celler ble behandlet med PMA (10 nM, 6 timer) før analysen for å indusere ekspresjon TF. A ~ 600 ganger oppregulering av TF mRNA nivåer ble bekreftet ved hjelp QRT-PCR.
Statistiske metoder
Statistisk analyse ble utført med GraphPad Prism programvare versjon 5.0 (PRISM5) (GraphPad Software Inc, LaJolla , CA). Student t-tester ble utført for å teste for signifikante forskjeller når data normalt ble distribuert. Ellers ble den ikke-parametriske Mann-Whitney U-test anvendt. * P 0,05, ** p 0,01 og *** p. 0,001
Resultater
Expression nivåer av syndecans i TFPI-uttrykke celler
HSPGs har tidligere vært rapportert å binde TFPI. I jakten på potensielle TFPI bindende kandidater ble mRNA uttrykk nivåer av syndecans 1-4 bestemmes i et utvalg av TFPI-uttrykkende celler. Uttrykket nivåer av syndecans varierte betydelig mellom de tre celletyper testet; HCAEC, HCASMC, og Sum102 (fig. 1). De syndecans ble uttrykt i alle cellelinjer, og uttrykket nivåer av syndecan-3 og 4 viste den minste variasjon blant cellene.
Sum102, HCAEC, og HCASMC celler ble analysert for mRNA-ekspresjon av syndecan 1-4 ved QRT-PCR. Den ΔΔCt metoden ble brukt for å beregne den relative uttrykk (RQ) mot gjennomsnittet endogene styre uttrykk blant alle cellene, og terskelen ble satt til Ct = 40 (uten forsterkning). Gjennomsnittsverdier + SD (n = 3 biologiske paralleller) er presentert.
Effekt av syndecan slå ned på celleoverflaten nivåer av TFPI
For å undersøke om de syndecans kan være potensial TFPI celleoverflaten bindende kandidater, ble siRNA teknologi brukt. Etter forbigående slå ned fra syndecans 1-4 ble cellene tillatt å binde en TFPI spesifikt antistoff etterfulgt av farging med en RPE-bundne sekundære antistoff og flow cytometri analyse.
Ingen signifikant reduksjon i celleoverflate nivåer av TFPI det ble ikke observert for en hvilken som helst av celletypene etter slå ned av syndecan 1, 2 eller 4 (data ikke vist). I motsetning til dette, syndecan-3 slå ned i HCAECs, HCASMCs, og Sum102 celler reduserte celleoverflate nivåene av TFPI med 52 ± 9%, 23 ± 6%, og 39 ± 12% (gjennomsnitt ± SD), henholdsvis (fig. 2). Slå ned effektiviteten av de syndecans i siRNA transfekterte celler ble bekreftet ved QRT-PCR og beregnet som prosent slå ned sammenlignet med kontrollceller transfektert med negativ kontroll siRNA. De slå ned effektiviteten varierte mellom 69-97% for syndecan 1, 45-85% for syndecan 2, 83-95% for syndecan-3, og 44-72% for syndecan 4 (S1 fig.). Videre syndecan-3 knock down ble bekreftet ved Western-blotting i alle celletyper (fig. 3A), og en 32 ± 13% (gjennomsnitt ± SD) reduksjon av syndecan-3 antigen nivåer på celleoverflaten etter syndecan-3 knock ned ble demonstrert ved strømningscytometri i HCAEC (fig. 3B).
celler slått ned for syndecan-3 av siRNA-teknologi ble analysert for nivåer av celleoverflate-TFPI ved flowcytometri. Histogrammet viser median fluorescensintensitet ble oppnådd etter TFPI spesifikt antistoff merking i A) Sum102 celler, B) HCAEC-celler og C) HCASMC celler. Syndecan-3 slått ned celler (siSDC3); stiplet linje, negativ kontroll siRNA; svart heltrukket linje og irrelevant kontroll; grå heltrukne linjen. En representant eksperiment av tre individuelle eksperimenter (n≥6 biologiske paralleller) er vist for hver celletype.
A) Syndecan-3 antigen nivåer (55 kDa monomere form) i cellelysatene fra HCAECs Sum102 celler, og HCASMCs ved Western blotting ved hjelp av anti-syndecan-3 og lasting kontroll (aktin). En representant membran av to er vist. Syndecan-3 protein båndintensitetene (etter å ha normalisering mot laste kontroll) sammenlignet med kontroll-celler er angitt for hver celletype. Rekombinant syndecan-3 (rSDC3) fungerte som en positiv kontroll (~ 110 kDa). B) Celleoverflaten forbundet syndecan-tre nivåer analysert av flowcytometri i HCAEC celler. Histogrammet viser median fluorescensintensitet oppnås etter syndecan-tre spesifikt antistoff merking. Syndecan-3 slått ned celler (siSDC3); mørk grå skyggelagt, negativ kontroll siRNA; medium grå skyggelagt og irrelevant kontroll; lys grå skyggelagt. En representant eksperiment av to individuelle eksperimenter (n = 4 biologiske paralleller) vises.
Verken heparanase (S2 fig.) Og heller heparinase jeg + III (data ikke vist) behandling av Sum102, HCAEC og HCASMC celler endret TFPI antigen nivåer i cellesupernatanter sammenlignet med kontrollceller.
Effekt av TFPI slå ned på syndecan-3 mRNA uttrykk
slå ned av syndecan-3 ikke påvirke TFPI mRNA uttrykket (fig. 4A) eller TFPI proteinnivåer (fig. 4B). Ikke desto mindre, eksperimentene ble utført for å vurdere hvorvidt en ensrettet reguleringsmekanisme eksisterte. Den syndecan-3 mRNA-ekspresjon ble redusert med gjennomsnittlig 30% i tre separate bassenger av Sum102 celler, der begge TFPI isoformer ble stabilt slått ned (TFPI slå ned effektivitet var 40-60%, som beskrevet i Stavik
et al
. 2011 [6]). Ingen forskjeller i syndecan-3 mRNA-ekspresjonsnivåer ble påvist når bare den TFPIβ isoform ble slått ned (fig. 5) (den TFPIβ knock down effektivitet var 53% og 64% for shRNA7b og shRNA 9b, respektivt). I HCAEC og HCASMC-celler, ble en 48% og 43% reduksjon av syndecan-3 mRNA-ekspresjon detektert i celler med 88-94% transient TFPI (α + β) knock down (48 timer). Videre slå ned på TFPIα isoformen alene (TFPIβ uttrykk forble upåvirket) i Sum102 celler (72 timer) og HCAECs (48 timer) resulterte i et respektivt 34% og 53% reduksjon av syndecan-3 mRNA uttrykk. Den TFPI slå ned effektiviteten av alle celletyper som brukes er vist i S3 Fig.
A) HCAEC, Sum102 og HCASMC celler med syndecan-3 slått ned ble analysert for TFPI mRNA uttrykk ved QRT-PCR. Den ΔΔCt metoden ble brukt for å beregne den relative TFPI uttrykket (RQ) sammenlignet med kontrollceller (neg. Kontroll siRNA). Middelverdier + SD (n≥6 biologiske paralleller) av tre individuelle eksperimenter er presentert. B) TFPI antigen nivåene ble målt med ELISA i cellelysatene fra HCAEC, Sum102 og HCASMC etter syndecan-tre slå ned. TFPI antigen-nivåer i forhold til kontroll-celler er vist. Middelverdier + SD (n≥6 biologiske paralleller) av to individuelle eksperimenter blir presentert.
Syndecan-3 mRNA uttrykk ble målt ved QRT-PCR i tre uavhengige stabile kloner med begge isoformer av TFPI (a + p) slått ned (shRNA 4, 6 og 7) og to uavhengige stabile kloner med bare TFPIβ isoform slått ned (shRNA7β og 9β). Resultatene ble normalisert mot endogen kontroll og relative uttrykk (RQ) ble beregnet i referanse til de tomme vektorkontrollcellene (pSiRPG). Gjennomsnittsverdier + SD (n = 3 biologiske paralleller) er presentert.
TFPI og syndecan-3 colocalization
For ytterligere å undersøke om redusert binding av celleoverflaten TFPI var på grunn av en direkte effekt av syndecan-tre slå ned, vi undersøkt om TFPIα og syndecan-3 colocalized på celleoverflaten. Colocalization ble bekreftet ved hjelp av dobbel farging og konfokalmikroskopi i Sum102, HCAEC, og HCASMC celler. Den colocalization var ikke jevnt fordelt, i stedet for konsentrert for å avgrensede områder av cellemembranen (fig. 6, S4 Fig., Og S5 fig.).
Fikserte celler ble farget med dobbel TFPI (grønn) og syndecan- 3 (rød) primære antistoffer og Alexa Fluor sekundære antistoffer med 488 og 633 nm eksitasjonsbølgelengdene henholdsvis før bildene ble tatt med konfokal mikroskopi. Gul farge i overleggsbilder viser romlig overlapp mellom TFPI og syndecan-3. Sum102 celler (øverst), HCAEC celler (i midten) og HCASMC celler (nederst). Scale bar 50 mikrometer (30 mikrometer for zoomet bilder). En representant eksperiment av tre individuelle eksperimenter er vist for hver celletype.
Identifisering av en TFPI-syndecan-3 proteinkompleks
Selv om confocal bildebehandling antydet at TFPIα og syndecan-3 bosatt på den samme fysiske plassering (fig. 6, S4 fig., og S5 fig.), nativ PAGE etterfulgt av påfølgende Western blotting ble utført for å teste for en interaksjon mellom de to molekyler (fig. 7A). I proteinlysatene fra Sum102, HCAEC, og HCASMC celler, to protein komplekser migrerer på åpenbare masser av ~ 150 kDa og ~ 180 kDa ble anerkjent av både anti-TFPIα og anti-syndecan-3 (Fig. 7A). De to kompleksene mest sannsynlig et resultat av forskjellige posttranslasjonelle modifikasjoner som glykosylering. Svakere band ble observert for HCAEC celler, noe som reflekterer de lavere proteinkonsentrasjonen brukt. De relativt store størrelser av de observerte komplekser indikerte at TFPIα (fig. 7B, 45 kDa) var tilstede med den dimeriserte form av syndecan-3, som har en omtrentlig størrelse på 110kDa (Fig. 7C). Størrelsen beregninger bør imidlertid tolkes med en viss forsiktighet, siden ikke-reduserende (ukomprimert) betingelser ble anvendt, og også fordi presis separasjon av høymolekylære komplekser ved elektroforese generelt er vanskelig.
Protein lysater ble isolert fra celler, utsatt for nativ PAGE analyse eller immunoutfellingsstudier eksperimenter og analysert ved Western blotting. A) Native PAGE av lysater fra Sum102 celler (20 ug), HCAECs (12 ug) og HCASMCs (18 ug) immunoblottet med anti-TFPIα (øverst) og anti-syndecan-3 (nederst) (en representativ membran av tre er vist), B) SDS-PAGE av full lengde rekombinant protein TFPIα immunoblottet med anti-TFPIα, og C) SDS-PAGE av syndecan-3-293T kontroll lysat immunoblottet med anti- syndecan-3. D) HCAEC (40 ug), E) SUM102 (160 ug) og F) HCASMC (40 ug) lysater ble underkastet immunoutfelling ved å bruke to forskjellige syndecan-3 antistoffer (n = 2 for sc-30883, n = 1 for SC- 9495) eller styre geite-IgG (n = 2). Lysater og immunopresipitatene ble analysert for tilstedeværelse av endogent syndecan-3 og TFPI ved immunblotting. Rekombinant TFPIα protein (øvre venstre panel) og cellelysat (nederst til venstre panel) ble brukt som positiv kontroll for immunoblotting i D-F.
TFPI-syndecan-tre interaksjon ble også analysert ved immunoprecipitation. Immunpresipitasjon av syndecan-3 fra HCAEC lysat å bruke to forskjellige syndecan-3 antistoffer avslørt co-utfelling av TFPI (Fig. 7D), noe som tyder på at TFPI forbundet med syndecan-3. I samsvar med den native PAGE-analyse (Fig. 7A), den TFPI-syndecan-3-komplekset var tilstede også i SUM102 (fig. 7E) og HCASMC lysat (fig. 7F), selv om TFPI utfelling viste noe svakere.
TFPI fordeling følgende syndecan-3 knock down
for å fastslå skjebnen til TFPI i syndecan-3-manglende celler, ble TFPI antigen målt ved hjelp av ELISA i supernatanten av Sum102 og HCAEC-celler etter slå ned av syndecan -3. Dette resulterte i en 20-30% økning av TFPI antigen-nivåer i supernatanten sammenlignet med kontrollceller (Fig. 8).
TFPI antigen nivåer (totalt) ble målt med ELISA i supernatanter fra Sum102 (til venstre) og HCAEC (til høyre) etter syndecan-tre slå ned. Relative TFPI antigen-nivåer sammenlignet med kontroll-celler er vist. Middelverdier + SD (n≥9 biologiske paralleller) av to (HCAEC) og tre (Sum102) individuelle eksperimenter er presentert.
TF-FVIIa aktivitet på overflaten av syndecan-tre slå ned celler
for å undersøke om TFPI bundet til syndecan-3 kan arrestere TF koagulerende aktivitet, vi målte TF-FVIIa aktivitet på overflaten av Sum102 og HCAEC celler før og etter forbigående slå ned på syndecan-3. TF-FVIIa aktivitet ble bestemt indirekte ved kvantifisering av FXa ble generert på en kolorimetrisk assay hvor FVIIa og FX ble eksogent tilsatt til adherente celler. Det ble ikke observert endringer i FX generasjon etter syndecan-tre slå ned på noen av de to celletyper (Fig. 9). Som forventet ble det observert en ~ 2 ganger økning i TF-FVIIa aktivitet ved tilsetning av anti-TFPI til analysen (positiv kontroll).
Sum102 og HCAEC celler slått ned av syndecan-3 (siSDC3) var analysert for TF-FVIIa celleoverflateaktivitet, indirekte, som FXa generasjon. HCAEC-celler ble stimulert med 10 nM PMA i 6 timer før analyse. Anti-TFPI ble lagt inn i et eksperiment med HCAEC celler. Middelverdier + SD (n≥8 biologiske paralleller) av tre individuelle eksperimenter er presentert.
Diskusjoner
I denne studien har vi vist en sammenslutning av endogent uttrykte TFPI til trans syndecan-3 HSPG molekyl. Vår tilnærming har vært å slå ned ekspresjonen av HSPGs som hører til familien syndecan, og å analysere de TFPI antigen overflatenivåer ved flowcytometri. Vi valgte endothelial-, glatt muskel- og brystkreftceller med høy endogen TFPI uttrykk for undersøkelse. De syndecan ekspresjonsnivåer varierte mellom disse celletypene i henhold til det faktum at HSPG ekspresjon avviker i en celle type og utviklingsspesifikk måte [13, 24]. Reduserte celleoverflate nivåer av TFPI ble detektert ved strømningscytometri etter syndecan-3 slå ned i alle tre celletyper, noe som indikerer involvering av syndecan-3 i celleoverflate-sammenslutning av TFPI. Videre er redusert syndecan-3 mRNA uttrykk i HCAECs og Sum102 celler med TFPIα slått ned, og i sum 102 celler med begge TFPI isoformer (α + β) slått ned, men ikke TFPIβ alene, støtter en sammenheng mellom syndecan-3 og videre TFPI, spesielt TFPIα isoformen. Hvorvidt dette er et direkte eller indirekte regulering gjenstår å bli belyst.
Tidligere syndecan 4 renset fra EA.hy926 celler er blitt vist å binde TFPI i en fastfase-analyse [19]. Så langt vi kjenner til, vi gir herved den første rapporten om TFPI assosiasjon til en syndecan molekyl på celleoverflaten.
