Abstract
Slettet leverkreft en (Dlc1) tumor suppressor genet koder for et RhoGTPase aktivere protein (RhoGAP). Den Dlc1 genet har flere transkripsjonelle isoformene, og vi har tidligere etablert en musestamme inneholdende et gen felle (gt) innsetting, som spesifikt reduserer ekspresjon av det 6,1 kb isoformen (isoform 2). Dette genet fanget allel når homozygot resultater i embryonale dødelighet og heterozygot gen fanget mus ikke viser en økt forekomst av kreft, noe som tyder på at samarbeidet onkogene endringer kan være nødvendig for transformasjon. I dette arbeidet har vi studert
in vivo
samarbeid mellom onkogene K-Ras2 og Dlc1 gener i tumorgenesen. Vi har observert en økning i invasive thymic krefttyper, inkludert både thymomas og lymfomer, noe som resulterer i betydelig kortere levetid spenn i mus heterozygote for gt Dlc1 allel og en induserbar LSL-K-Ras2
G12D allelet sammenlignet med LSL-K- Ras2
G12D bare mus. Den heterozygote mus viste en høy grad av metastaser i lungene. Vi har funnet tumorspesifikt, selektivt hypermethylation av Dlc1 isoformen 2-promoteren og reduksjon av det tilsvarende protein ekspresjon i thymus-lymfom (TL) og tymisk epitel karsinom (TEC) avledet fra de thymiske tumorer. De Dlc1 mangel thymus lymfom cellelinjer utstilt økt trans-endotelial celle migrasjon. TEC cellelinjer også utstilt økt stress fiberdannelse og Rho aktivitet. Innføring av de tre Dlc1 isoformer merket med GFP inn i disse cellene resulterte i forskjellige morfologiske endringer. Disse resultatene tyder på at tap av uttrykk for bare isoform 2 kan være tilstrekkelig for utvikling av thymus svulster og metastaser
Citation. Sabbir MG, Prieditis H, Ravinsky E, Mowat MRA (2012) The Role of Dlc1 isoform 2 i K-Ras2
G12D Induced Thymus- Cancer. PLoS ONE syv (7): e40302. doi: 10,1371 /journal.pone.0040302
Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 08.12.2011; Godkjent: 07.06.2012; Publisert: 05.07.2012
Copyright: © 2012 Sabbir et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Cancer Research Society Inc. (https://www.src-crs.ca/en-CA) og CancerCare Manitoba Foundation Inc. (https://www.cancercarefdn.mb.ca). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Slettet leverkreft 1 (Dlc1) tumor suppressor genet koder for et Rho GTPase aktivere protein (RhoGAP) som øker den iboende hydrolyse av GTP bundet Rho til den inaktive BNP bundet form av Rho. Den Dlc1 genet er blitt funnet hyppig slettet eller, ned reguleres av promoteren hypermethylation i bryst, lunge, lever, tykktarm og prostata-tumorer [1] – [6]. En fersk studie ved hjelp av representasjons oligonukleotid microarray analyse har vist heterozygot sletting av Dlc1 locus i -50% av lever, bryst og lungesvulster og 70% av tykktarm kreft [7].
In vitro
studier har vist at transfeksjon av Dlc1 genet kan hemme cellevekst [5], [7], avskaffe
in vivo
tumordannelse [2] og induserer apoptose. Nylig, eksperimenter ved hjelp av
ex vivo
knockdown av Dlc1 i p53 null og MYC indusert leverstamceller har vist redusert overlevelse etter injeksjon i mus [7].
Dlc1 genet har minst tre store transkripsjonelle isoformer som blir uttrykt under påvirkning av tre alternative promotorer hos mus [8]. Vi har tidligere etablert en musestamme inneholdende et gen felle innsetting, som spesifikt reduserer ekspresjon av det 6,1 kb transkripsjonen isoform (isoform 2) av Dlc1, og dermed skape en hypomorph [8]. Homozygot DLC-1-genet fangede mus viser en embryonisk dødelig fenotype [8], som phenocopies den Dlc1 ekson 5 knockout mus av Durkin et al. [6]. Den heterozygote knockout og genet fanget mus er levedyktig og ikke viser noen økning i spontane svulster [6], [8]. Dette indikerer at ytterligere onkogene hendelser foruten Dlc1 sletting er nødvendig for transformasjon
Det har vist seg at det i visse situasjoner aktivering av Ras-signalreaksjonsveien arrestert cellesyklus indusere senescens i stedet for å forårsake celleformering [9] -. [12 ] gjennom induksjon av p21
waf1 [13], [14]. Det har også blitt vist at i Ras aktiverte celler, en forutsetning for Rho signalering er for undertrykkelse av p21
waf1 [15]. Igjen, i Ras forvandlet fibroblaster, favoriserer vedvarende ERK-MAP kinase signal valg av høye nivåer av aktive Rho-GTP å tillate nedregulere de høye nivåene av p21
waf1 [16]. Derfor er det en hypotese at aktivering av Rho vei gjennom tap av Dlc1 RhoGAP uttrykket vil utfylle Ras onkogen i celle transformasjon
in vivo
. Det er heller ikke kjent, som Dlc1 isoformen er kritisk for tumor suppresjon. I denne studien rapporterer vi høy forekomst av metastatisk thymus kreft i heterozygot Dlc1 isoform 2 genet fanget mus med en onkogen K-Ras2
G12D allel. Vi finner også selektiv hypermethylation av Dlc1 isoformen to promoter i disse svulstene.
Resultater
høy forekomst av Thymus- Kreft i Dlc1
vekt /gtLSL-K-Ras2
wt /G12D mus infisert med AdCMV-ere
for å teste om Dlc1 tap ville samarbeide med K-Ras2 genet i transformasjon, har vi gjort bruk av LSL-K-Ras2
G12D transgen muse [17]. For å aktivere onkogene K-Ras2
G12D allel, Dlc1
vekt /gt; K-Ras2
vekt /G12D (KD) og Dlc1
vekt /vekt, K-Ras2
vekt /G12D (K
+) mus ble injisert med Cre-uttrykkende AdCMV-Cre adenovirus via halevenen. Flertallet av musene utviklet primære tymiske tumorer i løpet av 6 til 9 måneder med 52,6% (10/19) av K
+ mus versus 69,5% (16/23) av de KD mus med tumorer (figur 1A B tabell 1). Musene ble avlivet vanligvis for alvorlige puste problemer på grunn av kompresjon av brysthulen ved de voksende thymus-tumorer (figur 1C). Ved necroscopy, noen av disse mus viste også neoplastiske lesjoner i andre organer, inkludert nyre, lever, lunge, testikkel og eggstokk, men de fleste av mus viste tymiske tumorer (figur 1A, tabell 1). Flertallet av lungetumorer ble metastatiske celler i thymus-lymfom opprinnelse (figur 2E, tabell 2). For å bestemme total overlevelse, ble Kaplan-Meier analyse av AdCMV-CRE injisert mus utført. Denne viste signifikant lavere overlevelse i de heterozygote KD genet fanget mus sammenlignet med K
+ mus (P-verdi = 0,0077, figur 3A).
(A) Frekvens av ulike primærtumortyper. (B) Relativ frekvens av de ulike typene av primær thymus kreft (C) Bilde av forstørret thymus (pil) i mus og en dissekert thymus med lymfom.
For å forstå natur thymus kreft, utførte vi immunhistokjemi hjelp av en T-celle spesifikk markør CD3 og thymus epiteliale celle spesifikke markører, cytokeratin 5 (CK5) og cytokeratin 8 (CK8 /Troma) [18]. I den normale unge mus (6weeks gammel) til T-lymfocytter ble funnet jevnt fordelt i både cortex og medulla regioner av thymus, mens medullar epitelcellene ble sterkt CK5 og kortikale epitelceller ble sterkt CK8 positive (figur 2A). Men i de voksne mus av T-lymfocytter ble hovedsaklig forskjøvet mot den sentrale medulla regionen og de kortikale epitelceller var sterkt positive med CK8 isolerte flekker av CK5-positive celler (figur 2B). Ved hjelp av disse markørene vi har funnet et betydelig høyere antall thymus lymfomer 80% (8/10) i K
+ mus versus 68,7% (11/16) i KD mus (Figur 1B 2D, tabell 3) . En mindre fraksjon (20% (2/10)) var i overveiende grad tymiske epitel-karsinom (thymomas) i K
+ mus sammenlignet med 31,2% (5/16) i heterozygot KD mus (figur 1B Dlc1
vekt /gt og LSL-K-Ras2
G12D; Dlc1
vekt /vekt mus etter Cre uttrykker adenovirus injeksjon via halevenen. Overlevelsestiden ble definert som tiden etter injeksjon av død eller slakting, på grunn nådd humane endepunkter. Totalt 15 LSL-K-Ras2
G12D; Dlc1
vekt /vekt og 18 LSL-K-Ras2
G12D; Dlc1
vekt /gt mus ble benyttet for overlevelse studien. Den sensurerte data var mus som døde av ukjente årsaker uten påvisbare svulst eller leukemi. (B) Frekvens av metastatisk lungesvulster. De firkantede formet grå prikker indikerer metastaselesjoner avledet fra mus som var kilden til T Lymfekreft cellelinjer 1 og 2. P-verdi = 0,0257 (med Mann-Whitney U-test).
Primær T-cellelymfom og thymom cellelinjer er mangelfull i isoform 2 Dlc1 Protein og viste økt RhoA aktivitet
Vi etablerte fire thymus lymfom (TL) og 3 thymus epitel karsinom (TEC) cellelinjer (figur 4A) fra primærtumorer å studere ekspresjonen av Dlc1 protein. Disse tumorene ble enten CD3 + T-celler eller CK 5 eller CK 8 positive epitelceller (figur 2C 0,05, * * P 0,01, *** P 0,001, **** P 0,0001). E. Dlc1 protein uttrykk fra 5 AzaC behandlet TL og TEC cellelinjer.
I vår forrige undersøkelse, har vi rapportert at det finnes to forskjellige molekylvekt isoformer av Dlc1 protein i forskjellige muse vev og i mus embryonale fibroblaster (MEF), noe som antagelig stammer fra isoformene 2 og 3 mRNA eller ved post-translasjonelle modifikasjoner [8]. Den vanlige 123 KDa Dlc1 protein (isoform 2) uttrykkes på et lavt nivå i den voksne thymus. Mens, det 127 kDa kryssreagerende protein blir uttrykt på et høyere nivå i thymus sammenlignet med lever i Western blots (figur 4D /i). Interessant, thymoma og lymfom-cellelinjene viste lavere ekspresjon av det 123 kDa proteinbåndet og det tilhørende isoform 2 mRNA sammenlignet med normal thymus (figur 4C 3 og TEC 1 2 linjer viste lavere nivåer sammenlignet med de linjer fra K + mus (Figur 4D). Dessuten var det en signifikant økning i 127 kDa proteinbånd i tumorer sammenlignet med thymus (figur 4D). I vårt tidligere studium, så vel som i den foreliggende studie har vi oppdaget at proteinet ekspresjonsnivået av 127 kDa-protein øker i nærvær av reduserte nivåer av 123 kDa-proteinet, som er særlig tydelig i homozygot genet fanget mus embryonale fibroblastceller ( Figur 4D). De fleste av lymfom og TEC celler viste også økt uttrykk av 127 kd protein (figur 4D).
For å finne ut om de ekstra høy molekyl band er fosforylerte former av Dlc1 protein, ble cellelysatene behandlet med alkalisk fosfatase. Den fortsatte nærvær av 127 kd bandet etter fosfatase behandling indikerer at det ikke er en fosforylert form av vanlig 123 kd Dlc1 protein (Figur 4C /i E).
For å identifisere 127 kd kryssreagerende protein, immunopresipitater ved hjelp av Dlc1 antistoffer ble underkastet massespektrometri. Vi har vært i stand til å identifisere 7 peptider tilsvarende konsensus-regionen i Dlc1 felles for alle isoformene og derfor massespektrometri var mangelfulle om eksistensen av de andre Dlc1 isoformene (supplerende figur S1).
De fleste de lymfom og TEC-cellelinjer viste også høy ekspresjon av p21
waf1 protein i motsetning til homozygote genet fanget museembryo-fibroblastceller hvor p21
waf1 ekspresjon ble redusert (figur 5A /i-ii). Uttrykket nivået av p21 protein var sammenlignbare i MEF
+ /+ og TL4 og TEC3 cellelinjer, som har villtype Dlc1 alleler Men heterozygot genetrap Dlc1 allel inneholder TL 2/3 cellelinjer og TEC1 /2 celle linjer viste vesentlig høyere nivåer av p21 protein uttrykk når sammenlignet med deres tilsvarende villtype, TL4 og TEC-3 cellelinjer henholdsvis. I motsetning til dette heterozygot TL1 linje, med det laveste Dlc1 uttrykket viste p21 ekspresjon kan sammenlignes med villtype MEF
+ /+ og TEC-4-celler. Derfor p21 uttrykket ikke korrelerer med Dlc1 ekspresjon i thymus cellelinjer, i motsetning til i fibroblaster.
A (i) p21
waf1 protein i T-celle-lymfom og karsinom-cellelinjer, (ii) Plot viser relativ intensitet av p21
waf1 protein i T-celle-lymfom og carcinoma-cellelinjer i forhold til aktin. Middel og standardfeil av gjennomsnittet ble bestemt fra minst fem uavhengige eksperimenter. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, **** P 0,0001). (B) Måling av aktiv RhoGTP i cellelinjer. (I) RhoGTP trekke ned analysen viser konstitutive og LPA induserte nivåer av aktiv RhoGTP i T-cellelymfom og tymiske epitel-carcinoma-cellelinjer. (Ii) Plot viser RhoGTP til totalt Rho-protein-forholdet ved å skanne den relative intensiteten av proteinbåndene i ikke-behandlede og LPA indusert i TEC, TL, MEF-cellelinjer. Midler og standard feil av gjennomsnittet bestemt fra fire uavhengige forsøk. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 og **** P . 0,0001 av Student t-test og toveis ANOVA test
Alle thymom og . lymfom cellelinjer viste varierende grader av aktivert RhoA når de behandles med lysofosfatidisk syre (LPA) (figur 5B /i-ii) LPA induksjon av aktiv RhoA var signifikant høyere i to lymfom (TL-1 -2) og to TEC linjer (TEC-1 -2), som også viste de laveste DLC en isoform 2 nivåer, sammenlignet med tilsvarende villtype cellelinjer (figur 5B /i-II) Dette var lik homozygot Dlc1
gt /gt. celler, noe som indikerer at disse linjene kan ha inaktivert villtypen Dlc1 allel.
svulster har aktivert K-Ras2 G12D Mutasjon
for å fastslå at svulstene var på grunn av aktivering av K-Ras2
G12D allel, vi ekstrahert cellulært RNA fra de primære tumorer og tumorcellelinjer, og deretter utføres pyrosekvensering basert mutasjonsanalyse for K-Ras2
G12D-mutasjon (figur 6). Alle de primære tumorene viste ekspresjon av det mutante K- Ras2 allel (figur 6F). Imidlertid er ekspresjon av det mutante allel var mindre enn 50% i de primære tumorer som åpenbart av den pyrogram, antagelig på grunn av normal celleinfiltrasjon (figur 6D Vi har imidlertid funnet mikrostørrelse endring for D8Mit293 markør i en tumor, så vel som den tilsvarende cellelinje DNA (figur 8C). Vi har også funnet heterozygot tap av D8Mit174 markør i en metastatisk lunge lesjon (figur 8C).
(A) viser skjematisk den relative stilling av de forskjellige microsattelite markører anvendes for tap av heterozygositet analyse. (B) Representative autoradiografer som viser lene for de forskjellige mikro markører. Pilen viser LOH av ett allel og stjernen angir mikrostørrelse endring (MA) i ett allel, N-Normal, T-Tumor (C) Allele status av kromosom 8qA4 markører i thymus svulster og TEC og TL cellelinjer samt tilsvarende primære og metastatiske svulster; RH – Bevaring av homozygosity. Svulster 1-7 er primære thymus svulster som svarer til TL og TEC cellelinjer. Den underkategori a og b etter Tumor 1-7 representerer DNA hentet fra to uavhengige lungemetastatiske lesjoner av den tilsvarende primærtumor hhv.
For å finne ut om metylering av Dlc1 arrangøren var ansvarlig for redusert ekspresjon av Dlc1 mRNA og protein, behandlet vi tumorcellelinjer utvunnet med DNA demethylating middel 5′-azacytidin (5 AzaC) og deretter undersøkt ekspresjon av Dlc1 mRNA og protein. Interessant, behandling med 5 AzaC øket ekspresjon av Dlc1 isoform 2 i forhold til kontroll tumorcellelinjer (figur 4C-/iii E). Multipleks RT-PCR cDNA avledet fra 5 AzaC behandlet cellelinjer viste også jevnt høy uttrykk for Dlc1 isoform 2 og 3 mRNA i alle de behandlede cellelinjer.
Altered Cytoskjelett Struktur og Økt cellular motilitet i Tumorceller
Siden øket Rho aktivitet er forbundet med stress fiberdannelse og cellulær motilitet, undersøkte vi frekvensen av spenning fiberdannelse og fokal adhesjon i de dyrkede TEC cellelinjene og sammenlignes med normale tymiske epitel-celler. Tumorcellene inneholdt signifikant høyere antall av stress fibre (26 ± 11/1000 um
2) og fokal adhesjon (28 ± 18/1000 um
2) sammenlignet med normale celler med 8 ± 9/1000 um
2 og 7 ± 15/1000 um
henholdsvis to-frekvens (P-verdi 0,0001) (figur 9). Den gjennomsnittlige størrelsen av tumorceller (8-12 x 10
3 um
2) var også betydelig større enn deres normale motstykke (6-8 x 10
3 um
2) (p-verdi = 0,016). Videre tumorcellene viste flere ventrale spenningsfibre [20], mens, i normale tymiske epitel-celler reke Fibrene ble for det meste organisert som tverrgående buer [21] (figur 9 A-C). Vi har også observert spennings fibre arrangert i trekantmaskenett som overordnet kjernen på dorsal celleoverflaten i thymoma-celler (figur 9C).
(A) Normal tymisk epitel celle som viser spenning fiberdannelse i form av en ringformet tverrgående bue. (B) tymiske epitel karsinomcellelinje (Z stabel-1) som viser omfattende ventral spenning fiberdannelse og øke hyppigheten av fokal adhesjon, (C) den samme tumorcelle som viser en annen strukturell organisering av vinculin og aktin ved Z stabel -7 på dorsal overflaten av cellen. (D) Western blot som viser forbigående ekspresjon av Dlc1 isoform 2 3 proteiner merket med C-terminal GFP i TEC cellelinje. Tymiske epitel carcinoma celler transfektert med (E) pEGFP C1 vektor, (F) Dlc1 isoform 2 GFP konstruere; (G) Dlc1 isoform 3 GFP konstruere. (H) Bar diagram som representerer den relative antall celler som viser neurite som utvidelser uttrykt i prosent av totale GFP transgene uttrykker celler.
Stress Fibrene ble avskaffet da TEC celler ble transfektert med GFP tagget full lengde Dlc1 isoform 2 (figur 9E-G). Den ekspresjon av GFP-Dlc1 fusjonsproteiner ble også bekreftet i en western blot ved anvendelse av anti GFP-antistoff (figur 9D). GFP-Dlc1 isoform to fusjonsprotein ble funnet lokalisert til brennvoksninger (figur 9f). Vi har også lagt merke til at kreftcellene viste rikelig dannelse av «neurite som» cytoplasma forlengelse eller filipodial strukturer sammen med ødeleggelsen av stresset fiber forsamlingen når transfektert med GFP tagget Dlc1 isoform 3 (figur 9H). Alle Dlc1 transfekterte celler til slutt døde 3-4 dager etter transfeksjon.
For å finne ut om T-lymfom celler med lavere Dlc1 nivåer viste økt bloduttredelse og migrasjon, ble en transendothalial migrasjon analyse utført (figur 10). Invasjonen hastigheten av T-lymfomceller ble funnet signifikant høyere i lymfom cellelinje 1 og 2 i sammenligning med normal perifert blod (PBL) avledet T-cellelinje (p-verdi = henholdsvis 0,0007 og 0,021, figur 10C). Men de resterende to lymfom cellelinjer, med relativt høyere Dlc1 uttrykk, viste ikke signifikante forskjeller i invasjonen (p-verdi = 0,068). Alle lymfom cellelinjer viste også betydelig høyere rate av ledende pseudopodal struktur i forhold til de vanlige PBL T-celler (P value 0,04) (Figur 10D). Den økte ledende kant pseudopod dannelse og transendothelial migrasjon i lymfom cellelinje 1 og 2 samsvarer med økt metastase i det tilsvarende mus kohort (figur 3).
(A) Avbildet er to TL celler som hadde invadert mellom endotel celler. TL-celler ble farget med T-celle-reseptor-spesifikke markør anti-CD3-antistoffer og endotelcellene ble farvet med DAPI og TRITC-Phalloidin. Den øverste panelet viser representative Z bunke bilder av den øverste skive (over endotelceller) og pilen indikerer pseudopod dannelse (B) Transendothelial migrasjon analyse av T-lymfom celler. Tredimensjonale rekonstruksjoner viser to TL celler som hadde invadert konfluent endothelial monolag. Z stablet bilder som er tatt på 0,5 mikrometer intervaller har blitt brukt for rekonstruksjon av 3D-bilde. (C) Prosent trans-endotelial migrerte T-lymfom cellelinjer. Middelverdien og standardfeil er vist i 5 eksperimenter (D) Prosentandel celler som viste en ledende kant pseudopod struktur under bEND.3 cellene. Middelverdien og standardavviket av gjennomsnittet er vist for 4 forsøk hvor mer enn 200 celler ble analysert pr eksperiment. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 og **** P 0,0001 av Student t-test).
Diskusjoner
Dlc1 genet som andre tumorsuppressorgener, for eksempel TP53, APC og BRCA1, bruker alternative arrangører til å gi minst tre fulle lengde isoformer i mus [22] – [25]. Det er økende bevis for selektiv bruk av alternative promotorer, som regulerer differensial transkripsjon, kan være involvert i initiering og progresjon av kreft [26]. Den avvikende anvendelse av en promoter over en annen i gener, slik som TGFB3, LEF1 og CYP19A1, er direkte knyttet til kreftcellevekst (gjennomgått av [26]). De alternative arrangører brukes av Dlc1 genet er evolusjonært konservert og vanlig blant de andre DLC familiemedlemmer [27], [28]. Den Dlc1 genet har tre store alternative transkripsjoner som tidligere ble beskrevet som 7,4, 6,1 og 6,2 Kb transkripsjon av Sabbir et al. [8]. Disse isoformer har blitt utpekt som isoform 1, 2 og 3 henholdsvis i UCSC Genome Browser på Mouse juli 2007 (NCBI37 /MM9) Assembly. For denne diskusjonen, vil vi bruke UCSC nomenklatur av isoformene. Tidligere har det vært vist at alle tre isoformer av transkripsjonelle Dlc1 genet er uttrykt i varierende grad i forskjellige musevev men er fortsatt ukjent deres individuelle rolle i tumorgenesen [8]. Rom-tid-uttrykk for den menneskelige Dlc1 isoformer tilsvarende mus Dlc1 mangler fortsatt. Nylig, Low et al. har identifisert en ny Dlc1 isoform 4 hos mennesker, som tilsvarer den Dlc1 isoform 3 i mus, og det er blitt funnet stilnet i flere carcinoma linjer ved promoter hypermethylation [29]. Den genetrap mus som vi har brukt i vår studie har tidligere vist seg å felle Dlc1 isoform 2 og reduserer dens uttrykk, men ikke isoformer 1 og 3 [8]. Isoformen 3-promotoren viste en høy grad av konstitutiv metylering i normal thymus vev og thymus-tumorceller. Begge disse celletypene viste likevel uttrykk for isoform 3 mRNA. Høy metylering av Dlc1 promoter med fortsatt ekspresjon av genet er også blitt rapportert for isoform 2 i canine lymfom [30]. Disse resultatene indikerer at metylering status alene ikke kan være tilstrekkelig til å forutsi ekspresjon av Dlc1 isoform 3, i det minste i thymus og T-lymfocytter. Resultatene tyder også på at valgte tap av Dlc1 isoform to uttrykk kan være tilstrekkelig for tumorprogresjon.
Dlc1 genetrap alene ikke er i stand til å indusere tumorer imidlertid i nærvær av K-Ras2
G12D-mutasjon, det øker tumor og metastase frekvenser sammenlignet med K-Ras2
G12D mutasjon bare mus, noe som indikerer en additiv effekt. Den betingede K-Ras2
G12D mus anvendt i denne studien ble tidligere rapportert å utvikle seg adenocarcinoma i lungen ved intranasal levering av AdenoCre virus [17]. En annen transgen musemodell, LA1-K-Ras2, hvor K-Ras2
G12D allele kan aktiveres ved en somatisk intrachromosomal rekombinasjon, viste høy forekomst av lungesvulster, men også en 30% forekomst av thymus-lymfom og andre tumor typer [31]. I vår studie har vi funnet hovedsakelig thymus svulster sammen med neoplastiske lesjoner i mange andre organer ved hjelp av halevenen injeksjon av AdenoCre. Tidligere studier har vist at haleveneinjeksjon av AdenoCre for det meste rettet mot lever, milt og nyrer, og til en mindre utvide thymus, hjerte og lunge-vev [32], [33].
Den samlede hyppighet av neoplastiske lesjoner og thymus svulster var betydelig høyere i KD mus tyder på at fangst Dlc1 isoform to kan ha gitt en fordel til oppstart av tumorgenesen. KD mus viste også en betydelig reduksjon i total overlevelse. Økningen i lymfompasienter metastaser i lungene av mus KD kan være årsak til redusert overlevelse hos disse mus.
