Abstract
A 15-LOX, er det foreslått, undertrykker veksten av prostata cancer delvis ved å konvertere arachidonsyre, eicosatrien-, og /eller EPA til n-6-hydroksy-metabolitter. Disse metabolittene hemmer spredning av PC3, LNCaP og DU145 prostata kreft celler, men bare på ≥1-10 mikrometer. Vi viser her at 15-LOX metabolitter av dokosaheksaensyre (DHA), 17-hydroperoxy-, 17-hydroksy, 10,17-dihydroksy-, og 7,17-dihydroksy-DHA hemme proliferasjonen av disse cellene ved ≥0.001 , 0,01, 1, og 1 uM, respektivt. Til sammenligning, de tilsvarende 15-hydroperoksy, 15-hydroksy, 8,15-dihydroksy, og 5,15-dihydroksy metabolitter av arakidonsyre, så vel som DHA i seg selv kreve ≥10-100 uM for å gjøre dette. Som DHA, metabolitter DHA a) indusere PC3 celler for å aktivere en peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor-γ (PPARy) reporter, uttrykke syndecan-en, og bli apoptotisk og b) er blokkert fra bremse celleproliferasjon ved farmakologisk hemming eller knockdown av PPARy eller syndecan-en. Den DHA metabolitter dermed treg prostatakreft celleproliferasjon ved å engasjere PPARy /syndecan-en sti av apoptose og dermed kan bidra til prostata kreft-undertrykke effekten av ikke bare 15-LOX men også kost DHA
Citation.: O’Flaherty JT, Hu Y, Wooten RE, Horita DA, Samuel MP, Thomas MJ, et al. (2012) 15-lipoksygenase metabolitter av dokosaheksaensyre Hemme Prostate Cancer Cell Proliferation og Survival. PLoS ONE 7 (9): e45480. doi: 10,1371 /journal.pone.0045480
Redaktør: Clarissa Menezes Maya-Monteiro, Fundação Oswaldo Cruz, Brasil
mottatt: 12 mars 2012; Godkjent: 20 august 2012; Publisert: 20.09.2012
Copyright: © O’Flaherty et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd PO1CA106742 (JFor, YH og ije), RO1CA115958 (ije), RO1AI064609 (DAH) og Senter Grant NIH CA1207 (MJT) og to golfere mot kreft tilskudd (JFor). National Science Foundation tilskudd BIR-9414018 gitt midler til å kjøpe massespektrometer. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
metabolismen av kosten fettsyrer er av spesiell interesse for prostatakreft, den hyppigst diagnostisert kreft og en ledende dødsårsaken i amerikanske menn. Epidemiologiske studier tyder på at inntak av de n-3 flerumettede marine fettsyrer (PUFA), eikosapentaensyre (EPA, 20:05, n-3) og dokosaheksaensyre (DHA, 22:06, n-3) reduserer prostata kreftrisiko [ ,,,0],1], [2]. Videre er vev nivåer av n-3 PUFA var omvendt assosiert med prostatakreft progresjon [3], [4], [5]. I tillegg er cellekultur og dyremodeller vist seg at n-3 PUFA er beskyttende, mens n-6 PUFA fremme denne kreft [6], [7], [8]. PUFA er innarbeidet i cellen membranfosfolipider og er substrater for oksygenase (cyclooxygenase og lipoxygenase) enzymer for å bli metabolisert til bioaktive lipider. Én foreslått mekanisme for den tumor-inhiberende aktivitet av n-3 PUFA er kompetitiv hemming av oxygenases brukes av n-6 PUFA for å danne tumorfremmende metabolitter (oversikt i [9], [10]). Våre studier [11], [12] og andres [6], [13] har vist at DHA er en sterk inhibitor av prostatacancer cellevekst, en egenskap som er regulert av en 15-lipoksygenase (15-LOX) ( upubliserte studier).
Tidligere studier har indikert at to isoformer av 15-LOX identifisert hos mennesker kan spille motstridende roller i utvikling og progresjon av prostatakreft gjennom metabolisme av n-6 PUFA. 15-LOX-1 er mer sterkt uttrykt i ondartet enn normalt humant prostatavev og dets nivåer korrelerer positivt med sykdommens alvorlighetsgrad [14], [15], [16]. Den foretrekker linolsyre (LA) til arakidonsyre (AA) og følgelig gjør hovedsakelig den LA metabolitten 13-hydroksy-octadecaenoic syre (hode) [14], [17], [18]. Prostatakreft har høyere nivåer av 13-hode og konverterer LA til 13-hode i større grad enn normalt prostatavev [14], [15], [16]. 15-LOX-2, i motsetning, foretrekker AA enn LA, gjør hovedsakelig AA-metabolitten 15-hydroksy-eicosatetraenoic syre (15-HETE), er under uttrykt eller fraværende i prostata cancer, og dens nivåer korrelerer negativt med sykdommens alvorlighetsgrad [14], [17], [18], [19], [20]. Human prostatakreft har forholdsvis liten evne til å omdanne AA til 15-HETE [15]. Eksperimentelle studier har støttet og utvidet disse kliniske observasjoner
Mus gjort å uttrykke i sin prostata kjertler menneske 15-LOX-1 utvikle prostata intraepitelial neoplasi (PIN) [21].; når tilsvarende konstruert for å uttrykke menneskelige 15-LOX-2, utvikler de prostata forstørret med senescent celler [22]. Korrelere med disse resultatene, tvangs uttrykk for menneske 15-LOX-1 hastigheter og 15-LOX-1 knockdown bremser spredning av dyrkede og eksplanterte menneskelige prostata kreft celler [23]. Tvunget ekspresjon av human 15-LOX-2 fører til disse cellene for å stoppe prolifererende og bli senescent [24], [25]. Effekten av 15-LOX-1 synes på grunn av sin produksjon av 13-hode, som forbedrer evnen til vekstfaktorer å stimulere prostatacancer celleproliferasjon [23], [26], [27]. Effekten av 15-LOX-2 tilskrives delvis til sin produksjon av 15-HETE, som inhiberer prostatacancer celleproliferasjon [24], [25], [26] ved aktivering av peroksisomproliferator-aktiverende reseptor (PPAR) -γ [26], [28], [29]. Disse resultater antyder at den progresjon av prostata epitelceller til malignitet omfatter opp-regulering av 15-LOX-1 og nedregulere 15-LOX-2 for å skape et miljø som favoriserer vekst, det vil si en rikere på pro-proliferativ og fattigere på anti-proliferativ PUFA metabolitter. Det er problemer med denne 15-LOX /n-6 PUFA modell. AA seg selv forårsaker prostata kreft celler til å spre [30] og som andre n-6 PUFA er foreslått å fremme snarere enn undertrykke prostatakreft i noen epidemiologiske studier [31], [32], [33]. Videre er anti-proliferative virkning av 15-HETE på dyrkede prostatakreftceller krever ≥10-100 pM [25], [26], [34]. De tilsvarende hovedmetabolitter av n-6 PUFA, γ-linolensyre (GLA), og n-3 PUFA, eikosapentaensyre (EPA), er også mindre sannsynlig mediatorer av 15-LOX-2 anti-kreft effekt siden både 15-hydroxy-eicosatrien- og 15-hydroxy-eikosapentaensyre krever ≥1-5 iM å bremse spredning av prostata kreft celler [35], [36]. Den eksisterende data og dermed garanterer søker etter andre 15-LOX /PUFA metabolitt modeller.
Vi her undersøke aktivitet, potens og virkningsmekanismen til 15-LOX metabolitter av DHA. Disse metabolitter er av særlig interesse fordi 1) DHA er et medlem av n-3 PUFA familie foreslått å undertrykke prostatakreft i epidemiologiske studier [31], [32], [33]; 2) DHA er en viktig bidragsyter til den anti-proliferative effekt av n-3 PUFA i prostatakreftceller [11], [12] og 3) aktiviteten av kortere kjede n-3 PUFA, inkludert EPA, kan det være irrelevant for DHA sin aktivitet siden menn [37] samt dyrkede prostatakreftceller [11] kan lett konvertere kortere kjede n-3 PUFA til EPA, men er nesten ute av stand til å konvertere EPA til DHA.
Materialer og Metoder
DHA og AA (NuChek Prep); Soyabønne 15-LOX typen 1a (SLOX), natriumborat, og natriumborhydrid (Sigma); HPLC-kolonner (Waters); HPLC eller optima klasse organiske løsningsmidler og dietyleter (Fisher); anti-SDC-1 (H-174) antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Inc.); anti-HRP-konjugert sekundært antistoff mot kanin-antistoff (Cell Signaling Technology); og CellTiter 96® Aqueous En løsning Cell Proliferation Assay og caspase-Glo® 3/7 Assay (Promega) ble kjøpt. PC3, DU145, og LNCaP human prostatacancercellelinjer (American Type Culture Collection (Manassas, VA) ble dyrket i avansert Dulbeccos modifiserte Eagle medium (Invitrogen) inneholdende 1% føtalt bovint serum (PC3-celler), Eagles minimum essensielle medium med Earls salter medium (Invitrogen) inneholdende 10% føtalt bovint serum (DU145-celler), eller RPMI 1640-medium (Invitrogen) med 10% føtalt bovint serum (LNCaP-celler) som beskrevet [34], [38].
Metabolittkonsentrasjoner preparater
Vi utarbeidet 15S-hydroperoksy-eicosatetra-5Z, 8Z, 11Z, 13E-enoic (15 HPETE), 15S-hydroxy-eicosatetra-5Z, 8Z, 11Z, 13E-enoic (15-HETE), 5S, 15S-dihydroksy-eikosa-tetra-6E, 8Z, 11Z, 13E-ensyre (5,15-diHETE), og 8S, 15S-dihydroksy-eicosatetra-5Z, 9E, 11Z, 13E-ensyre (5,15- diHETE) syrer ved omsetning av arakidonsyre (AA) med SLOX [39] og brukt den samme fremgangsmåten for å fremstille DHA metabolitter. i korthet DHA (10
-4 M) ble omsatt med 0,8 mg av SLOX i 50 ml gjennomluftet natrium boratbuffer (50 mM, pH 9, 4 ° C, 30 min). Reaksjoner ble ekstrahert med dietyleter; de 17S-hydroperoksy-docosa-heksa 4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 15E, 19Z-enoat (17-HpDHA) Produktet ble renset ved gravimetrisk kiselsyre-kromatografi, isokratisk C18 u-Bondapak HPLC (1,5 x 300 mm; metanol: H
2O: iseddik 750/250 /0,1, volum /volum, 3 ml /min, eluering ved ~34 min), og isokratisk μ-Porasil HPLC (1,5 x 300 mm, heksan: isopropanol: iseddik syre, 950:50: 1, v /v; 5 ml /min, eluering ved ~6 min). Eluering UV spektra ble overvåket med en G1315A diode rekke spektrometer løp med ChemStation 51 software (Agilent Technologies). 17-HpDHA ble omsatt med natriumborhydrid i metanol og re-renset ved μ-Bondapak HPLC for å oppnå 17S-hydroksy-docosahexa-4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 15E, 19Z-enoat (17-HDHA). For dihydroksy-produkter, ble DHA (10
-4 M) i 500 ml reaksjoner omsatt med 10 mg av SLOX tilsatt ved 0, 45, 90, 150, og 240 min. Etter 300 min ble reaksjonsblandingen behandlet som 17-HpHDA skjønt den μ-Bondapak HPLC-trinn; toppen eluere i dette systemet på ~ 10 min med en trien absorbans spektra (maxima: 280, 270, og 261 nm) dominerer sin venstre side og 5,15-diHETE lignende absorbans spektra (maks: 243; adiabatisk hump: ~223 nm) dominerer sin høyre side ble samlet; redusert med natriumborhydrid; og, etter Butovich et al. [40], [41], løst ved isokratisk HPLC 5SW (3 x 250 mm, heksan: isopropanol: iseddik (974:26: 1, v /v; 1 ml /min) til topper ved ~17 og 22 min med respektive UV spektra for 10S, 17S-dihydroksy-docosahexa-4Z, 7z, 11E, 13Z, 15E, 19Z-enoate (10,17-diHDHA også betegnet Protectin DX [42]; maxima: 280, 270, og 260 nm) og 7S, 17S-dihydroksy-docsahexa-4Z, 8E, 10Z, 13Z, 15E, 19Z-enoate (7,17-diHDHA [eller Protectin D5]; maksimum: 222 nm; adiabatisk hump: 242 nm) [40], [ ,,,0],41], [43]. i tillegg til sine HPLC Elueringstidene og UV-spektra, strukturene til AA-metabolitter ble bekreftet ved MS [39] og av DHA metabolittene ved MS og kjernemagnetisk resonans (NMR). 17-HDHA og 10,17-diHDHA ga elektrospray-spektra (Quattro II-MS, Mass MassLynx 3,5 programvare, negativ ion-modus) i likhet med det som er publisert [40], [41], [43], [44], [45], [46]. Den molekylært ion for 17-HpDHA var 16 AMU større enn for 17-HDHA NMR-spektra (1D og 2D dobbel-kvante-filtrert COSY i d
4-metanol; 25 ° C; Bruker 699 MHz Avance NMR-spektrometer). for 17-HDHA og 10,17-diHDHA hadde kjemiske skift og koblingsmønstre matchende publiserte rapporter [40], [41], [44]; Den utledede konjugerte dobbeltobligasjons geometrier var for 17-HDHA, 13Z, 15E; for 10,17-diHDHA, 11E, 13Z, 15E; og for 7,17-diHDHA, 8E, 10Z og 13Z, 15E. De fire DHA metabolittene manglet resonanser ved 6,1-6,2 ppm som indikerer fraværet av en trans-trans konjugert dobbeltbinding. PUFA og metabolitter ble lagret i metanol under en argonatmosfære ved -80 °; befris for metanol ved en strøm av nitrogen; tatt opp i kulturmedier; og lagt i cellekulturer. På grunn av ustabilitet sin [40], [41], 15-HPETE og 17-HpDHA ble brukt innen 3 uker med forberedelser.
spredning og caspase Analyser
sprednings ble analysert med Cell Titer96 Aqueous en løsning Cell Proliferation Analyser (Promega) som beskrevet [47]. For å måle apoptotisk aktivitet, ble cellene sådd ut i 96-brønns plater ved en densitet på 1000 celler /brønn i 24 timer, deretter behandlet med forbindelsene i 48 timer før måling av kaspase-aktivitet ved hjelp av Caspase-Glo® 3/7 assay ( Promega) i henhold til produsentens anvisninger.
PPARy Aktivering analysen
2 × 10
5 PC3 cellene ble sådd på 35 mm skåler i 1 ml avansert DMEM med 1% FBS, for 24 timer og transfektert med 1 ug av lacZ og 1 ug PPRE DNA (PPAR-responselement-luciferase reporter) [34], [38] med Fugene 6 Transfeksjon reagens (Roche). I noen studier, ble cellene ko-transfektert med en vektor (1 ug) som koder for dominant negativ (d /n) -PPARγ (L468 /E471) [34] [38] eller tom vektor pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 24 t eller ble behandlet i 30 minutter med PPARy-antagonist, GW9662. Cellene ble deretter utfordret med et DHA metabolitt eller en PPARy agonist, troglitazon, i 24 timer. Cellene ble skrapet inn Reporter Lysis Buffer (Promega). Prøvene ble frosset i 18 timer og sentrifugert (200 g, 4 min, 20 C). Supernatantvæskene ble analysert for luciferase og β-galaktosidase (Promega Luciferase og β-galaktosidaseenzym analysesystemer). Luciferase ble korrigert for transfeksjon effektivitet basert på β-galaktosidase som i [34], [38].
SDC-en analyse
For å oppdage SDC-en melding, total PC3 celle RNA ble dannet og forsterkes i tre eksemplarer med Applied Biosystems 7500 real-Time PCR System. Primere for mennesker SDC-en var 5′-ggagcaggacttcacctttg (fremover) og 5′-ctcccagcacctctttcct (bakover). Data ble normalisert til renhold kontroll peptidyl-prolylisomerase B og er presentert som i forhold til kontroll. For å detektere SDC-1-protein, PC3-celler ble homogenisert og lysert i iskald buffer (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1 mg /ml fenyl-metansulfonyl fluorid, 1 x proteinase, og 1 x fosfatase-inhibitorer [Roche Applied Science]), dialysert mot 100 mM Tris og 30 mM natriumacetat, pH 8,0, i 24 timer ved 4 ° C, og fordøyd med kondroitinase ABC (Seikagaku, Ijamsville, MD) og heparinase III (Sigma -Aldrich) ved 37 ° C over natten. Proteinekstrakter ble fremstilt for Western blot-analyse som beskrevet ved anvendelse av det angitte antistoff [12]. Band tettheter på fotografisk film ble analysert ved hjelp av Image J 1.37V (National Institutes of Health, Bethesda, MD). For å slå SDC-1, 1 x 10
5 PC3-celler per brønn ble sådd ut i 96-brønners plater, transfektert med en liten interfererende RNA (siRNA) for det humane SDC-1-genet (Ambion, katalog nr. AM16708) eller en negativ kontroll siRNA uten kjent målet ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) for å oppnå en knockdown virkningsgrad 75% som beskrevet [12]. Kulturer ble inkubert i 18 timer og deretter utfordret med et DHA metabolitt i 3 dager.
Statistiske analyser
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD når data som vises er fra ett eksperiment ble gjentatt med tilsvar resultater eller SEM hvor resultatene er vist som gjennomsnittet av uavhengige forsøk. Resultatene ble analysert ved ANOVA (én vei eller toveis som siktet) og Bonferroni multiple sammenlignings post test med GraphPad Prism versjon 4.00 for Windows, GraphPad Software, San Diego CA. Forskjeller ble betraktet som signifikant på
P
. 0,05
Resultater
17-HpDHA, 17-HDHA, 10,17-diHDHA, og 7,17-HDHA bremset proliferasjon av PC3-celler med 25% ved 0,1, 1, 8, og 10 uM, henholdsvis (fig. 1A). Under de samme betingelser, DHA kreves 60 uM for å oppnå denne effekten [12] og de analoge AA-avledede 15-LOX-metabolitter, 15-HPETE, 15-HETE, og 8-15-diHETE, hadde langt mindre eller ingen aktivitet mens 5,15-diHETE svakt stimulert proliferasjon (fig. 1B). Tilsvar 15-hydroxy metabolitter av EPA og GLA velig krever ≥5 mikrometer for å bremse spredningen med 25% [35], [36] mens 15-LOX-avhengige metabolitter av LA, 13-hode og 9-hode, manglet anti- proliferativ aktivitet på 100 mikrometer og faktisk stimulert spredning på ≥0.1 og en nM (upubliserte observasjoner). 17-HpDHA og 17-HDHA også vist seg mer potent enn 15 HPETE eller 15-HETE i bremse spredning av LNCaP og DU145 prostatakreftceller (Fig. 1C og 1D). Lignende resultater forekom i de tre cellelinjene når inkubert med metabolitter i 48 eller 96 timer (resultater ikke vist). Under identiske betingelser, DHA kreves ≥30 pm for å inhibere proliferasjonen av disse cellene [12].
De angitte celletyper ble inkubert i 3 dager med den angitte metabolitten og deres spredning presentert som gjennomsnitt ± SEM (≥ 3 uavhengige eksperimenter) fraksjoner av det som finnes i celler behandlet med kjøretøyet (kultur media) for metabolittene.
for å undersøke mekanismen (e) underliggende metabolittene «anti-proliferativ aktivitet, fokuserte vi på PC3 celler og fulgt tidligere studier som fant at DHA hemmer prostatakreft cellevekst ved å aktivere PPARy å indusere uttrykk for syndecan (SDC) -1. Denne transmembran proteoglykan har de apoptose-induserende aktivitet for prostata og andre kreftceller [12], [38], [48], [49]. 17-HpDHA og 17-HDHA, ved ≥0.01 og 1 jjM, forårsaket PC3-celler for å aktivere caspase-3, en markør for apoptose (Fig. 2A). Statistisk analyse (to-veis ANOVA) indikerte at dose-responsvariabel signifikant (p 0,0001), og de to metabolitten variable signifikant (p 0,001) påvirket resultatet med 17-HpDHA å være mer potent at 17-HDHA. Disse samme to DHA metabolitter også forårsakes av cellene for å aktivere en PPARy rapportørgen; Denne effekten var lik den for den farmakologiske PPARy-aktivator, troglitazone (Fig. 2B), samt DHA [38], [48]. Både 10,17-diHDHA og 7-17-HDHA var svake aktivatorer av PPARy i denne studien som induserer henholdsvis en 69% og 68% økning i aktivitet over kontrollen som tendert mot, men oppnådde ikke statistisk signifikans (P 0,1) (fig. 2B). Vi har tidligere vist at både 15-HETE og 5,15-diHETE (1-200 mm) ikke klarte å aktivere denne reporteren [34]. Til slutt, til DHA metabolitter stimulerte PC3 celler uttrykker SDC-1 mRNA (Fig 2C.) Som resulterte i økt SDC-1protein (Fig 2D.); disse effektene også tilpasset de av troglitazon og DHA [12], [38], [48], [49]. De relative potenser av metabolitter i å produsere disse svarene tilnærmes deres relative potenser i bremse PC3 celleproliferasjon. Avviket mellom svak aktivering av PPARy ved 10,17-diHDHA og 7-17-HDHA (Fig. 2B) og deres mer robust effekt på akkumulering av SDC-1 protein i løpet av 72 timer (fig. 2D) kan tyde på en langsommere opptak og /eller metabolisme av disse to mer polare produkt til cellene.
A. Celler ble inkubert med den indikerte konsentrasjon av 17-HDHA eller 17-HpDHA i 24 timer og caspase-3 aktivitet ble målt ved hjelp av Caspase-Glo® 3/7 analysen. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD (N = 3) i forhold til kontroll-celler behandlet med medium for metabolitter. Reaksjoner på alle doser ved og over 10
-8 M for 17-HpDHA og på eller over 10
-7 M for 17-HDHA var signifikant større enn den til kontrollceller (to-veis ANOVA, P 0,05) . B. Celler transfektert med luciferase PPARy rapportørgenet ble stimulert i 24 timer med 10 uM av den angitte metabolitt (laveste dose hvor alle hadde en tydelig effekt på cellevekst) eller 5 uM av troglitazon og analysert med hensyn på luciferase. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD (N = 3). Barer merket med samme bokstav er ikke signifikant forskjellig fra hverandre; stolpene som er merket med forskjellige bokstaver er vesentlig forskjellige fra hverandre (en-veis ANOVA, P 0,05) C. Celler ble behandlet med medium (kontroll) eller 10 pM av den angitte metabolitt etter 8 eller 24 timer, og deres SDC-1 mRNA var målt. Verdier representerer gjennomsnitt, ± SD (N = 3). Innenfor hver gang gruppe, barer merket med samme bokstav er ikke signifikant forskjellige fra hverandre; stolpene som er merket med forskjellige bokstaver er vesentlig forskjellige fra hverandre (en-veis ANOVA, P 0,05). D. Cellene ble behandlet med medium (kontroll) eller 10 pM av den angitte metabolitten i 72 timer og deres lysater ble analysert for SDC-1. Western blot er representative for 3 uavhengige eksperimenter. Verdier i grafene representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 3 uavhengige eksperimenter). Barer merket med ulike bokstaver er signifikant forskjellige fra hverandre (enveis ANOVA, P 0,05)
PPARy aktivering dukket avgjørende for aktiviteten til DHA metabolitter. Metabolittene ble markert hemmet fra å indusere SDC-1 i PC3-celler transfektert med d /nPPARγ, men ikke i celler transfektert med pcDNA3 vektoren kontroll, sammenlignet med celler som var utransfekterte (fig. 3A). Enda viktigere, d /nPPARγ transfeksjon også blokkerte hver av de fire metabolittene «anti-proliferativ aktivitet, mens pcDNA3 ikke, igjen sammenlignet med celler som var utransfekterte (fig. 3B). Til støtte for dette siste resultat ble den anti-proliferative aktivitet av metabolittene hemmet i PC3-celler forbehandlet med en PPARy-antagonist, GW6992, sammenlignet med celler behandlet med medikamentet kjøretøy (fig. 3C). Endelig SDC-en induksjon også dukket avgjørende for metabolittene «anti-proliferativ aktivitet. Celler som hadde sin SDC-en slått ned ved transfeksjon med SDC-en-spesifikke siRNA var ikke svarer (dvs. ikke klarte å stoppe proliferating svar) til metabolitter i forhold til celler transfektert med kontroll siRNA eller ikke transfektert (Fig. 3D). Selv 10,17-diHDHA og 7-17-HDHA var forholdsvis svake aktivatorer av PPARy (Fig. 2B), er virkningene av disse metabolittene på SDC-1-ekspresjonen og proliferasjon ble også følsomme for PPARy hemning (Fig. 3A-D). Dette tyder på at en lav terskel for reseptor aktivering kan være tilstrekkelig for PPARy oppregulering av
SDC-en
genet som er konsistent med virkningene av DHA på denne veien som er vist i tidligere studier [38].
A. Celler som ikke var transfektert eller transfektert med pcDNA3 eller d /nPPARγ ble utfordret med 10 pM av den angitte metabolitten i 24 timer før analysering av syndecan-1 mRNA. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD (N = 3). Innenfor en gruppe transfeksjon, barer merket med samme bokstav er ikke signifikant forskjellige fra hverandre; stolpene som er merket med forskjellige bokstaver er vesentlig forskjellige fra hverandre (en-veis ANOVA, P 0,05). B. Celler utransfekterte eller transfektert med pcDNA3 eller d /nPPARγ ble utfordret med 10 pM av den angitte metabolitten i 3 dager før analysering av proliferasjon. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD (N = 3). I løpet av en metabolitt gruppe, barer merket med samme bokstav er ikke signifikant forskjellige fra hverandre; stolpene som er merket med forskjellige bokstaver er vesentlig forskjellige fra hverandre (en-veis ANOVA, P 0,05). C. Celler ble inkubert med 0-1 uM av PPARy-antagonist, GW6692, i 30 minutter og med 10 uM av den angitte metabolitten i 3 dager før analysering av proliferasjon. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 3 uavhengige eksperimenter). I løpet av en metabolitt gruppe, barer merket med samme bokstav er ikke signifikant forskjellige fra hverandre; stolpene som er merket med forskjellige bokstaver er vesentlig forskjellige fra hverandre (en-veis ANOVA, P 0,05). D. Cells utransfekterte, transfektert med kontroll siRNA eller transfektert med SDC-1 siRNA ble utfordret med 10 mm av den angitte metabolitten i 3 dager før analysering spredning. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD (N = 4). Innenfor en gruppe transfeksjon, barer merket med samme bokstav er ikke signifikant forskjellige fra hverandre; barer merket med ulike bokstaver er signifikant forskjellige fra hverandre (enveis ANOVA, P 0,05).
Diskusjoner
De fleste av PUFA oxygenases og metabolitter som de gjør kommer i tilknytning til progresjon av prostata kreft fordi disse metabolittene fremme celler av denne kreft til å proliferere [15], [16], [21], [23], [24], [26], [27], [28], [ ,,,0],30], [34], [50], [51], [52], [53]. 15-LOX-2 og dets metabolitter er enestående unntak fra denne regelen: de synes knyttet til undertrykkelse av prostatakreft blant annet fordi disse metabolittene hemmer spredning [15], [19], [20], [22], [24] , [25], [26]. Basert på deres in vitro aktivitet, og dominans som 15-LOX-2-metabolitter, 15-HETE [24], [25], [26], [34], 15-hydroksy-eicostrienoic syre, og 15-hydroksy-eikosapentaensyre [ ,,,0],35], [36] er kandidat formidlere av 15-LOX-2 anti-proliferativ effekt. Men den lave styrken av disse metabolittene tillater at produkter avledet fra andre PUFA kan være mer potente og derfor viktigere i mediering av den 15-LOX-2-effekt. Vi finner at medlemmer av den 17-serien av DHA metabolitter, 17-HpDHA, 17-HDHA, 7,17-diHDHA, og 10,17-diHDHA, hemmer proliferasjonen av androgen-uavhengig (PC3 og DU145) og androgen-avhengige (LNCaP) prostatakreftceller. Den mest potente av disse, 17-HpDHA og 17-HDHA, avtok signifikant proliferasjon ved konsentrasjoner på ≥1 og 100 nM, respektivt, og derfor er 1000 ganger mer potent enn de tilsvarende metabolitter av AA; de også vises langt mer potente enn 15-LOX metabolitter av EPA og GLA som angitt i [35], [36]. DHA metabolitter klart handlet på en strukturell bestemt måte som gjenspeiles av sine desidert ulike individuelle potenser og av sine større potensialer enn sine kolleger i 15-serien av AA metabolitter. Vi merker oss at virksomheten til 17-serien av DHA metabolitter funnet her ikke utelukke mulighetene for at deres effekter involverer deres videre cellenes stoffskifte til enda mer potent anti-proliferative produkter. Vi er bare begynnelsen for å undersøke dette problemet.
Studier har vist at DHA undertrykker spredning av prostata kreft celler inkludert PC3 celler ved en sti som involverer aktivering av PPARy, binding av PPARy til SDC-en promoter , induksjon av SDC-en, og SDC-1-indusert apoptose [12], [38]:
DHA metabolitter studert her stimulert PC3 celler for å aktivere en PPARy reporter, uttrykke SDC-en, og aktiver caspase-3, og dermed tyder på en ekstra viktig skritt i denne veien dvs. metabolismen av DHA til mer potente mellomprodukter. Videre PPARy antagonist, GW6992, d /nPPARγ, og SDC-en stanse blokkert DHA metabolitter «anti-proliferative handling; d /nPPARγ også blokkert deres induksjon av SDC-en. Metabolittene dermed brukt samme signalveien som DHA å bremse spredning av PC3 celler. Dette settet med funn åpner muligheten for at den anti-proliferative effekt av DHA er mediert i det minste delvis gjennom metabolismen av 15-LOX-2 til den 17-serien av metabolitter, spesielt 17-HpDHA og 17-HDHA. Det er imidlertid flere problemer med denne ordningen.
Studier ikke enige om evnen til PC3-celler til å metabolisere PUFA med noen finne cellene gjør ingen [26] eller meget lite [23], [24] 13- hode og 15-HETE og andre å finne de gjør betydelige mengder av 13-hode [15], [16], men lite 15-HETE [15], selv etter eksponering for høye konsentrasjoner av LA eller AA. Siden 15-LOX-1 foretrekker LA til AA, mens 15-LOX-2 foretrekker AA til LA [14], [17], [18], [19], [20], tyder disse resultatene på at PC3-celler har ingen eller liten 15-LOX-2-metaboliserende aktivitet, et resultat fullt kompatibel med funn at disse cellene har 15-LOX-1, men lite eller ingen 15-LOX-2-melding og protein [15], [24], [54]. I tillegg har den relative evne og spesifisitet av de to humane enzymer for å bruke DHA som et substrat ikke er definert, selv om et 15-LOX-1 knock-down studie i retinale pigment epitelceller antyder at 15-LOX-1, men ikke 15- LOX-2 er ansvarlig for metaboliserende DHA i 17-serien av metabolitter [55]. Det er klart at den 17-serien av DHA metabolitter er laget av ulike celletyper in vitro, og mange typer vev in vivo [45], [55], [56], [57], [58]. Imidlertid er evnen til ondartet samt normal prostata celler og vev for å gjøre disse metabolitter og bidraget fra 15-LOX-1 versus 15-LOX-to til dette er ikke kjent. Vi har funnet at PC3-celler utfordret med en anti-proliferativ konsentrasjon (dvs. 100 uM) av DHA for 0.5-96 h omdannes kun meget små mengder ( 0,003%) av den i 17-HDHA, 7,17-diHDHA, pluss 10 17-diHDHA, som oppdaget av selektive ion-overvåking-MS (upubliserte studier). Disse mengdene syntes utilstrekkelig for å bremse spredning. Konfrontert med disse funnene, kan det være lønnsomt å vurdere andre muligheter hvor prostatakreft kan bli utsatt for disse metabolittene. Human prostatakreft juxtaposes med normalt vev. Dette normalt vev vil kunne gi den 17-serien av DHA metabolitter gjennom aktiviteten av 15-LOX-1, 15-LOX-2, eller cytokrom P450 [59], [60]. 17-serien DHA metabolitter også danne gjennom auto-oksidasjon [61]; dyrkede neuroblastom-celler, for eksempel, metabolisere DHA til 17-HDHA og andre cytotoksiske DHA derivater via auto-oksydasjon, så vel som 15-LOX-avhengige reaksjonsveier [56]. En eller flere av disse alternative veier kan være et middel som kosttilskudd n-3 PUFA slutt fungerer for å redusere dødelighet av prostatakreft [31].
I konklusjonen, finner vi at en rekke 15-LOX- avledet metabolitter av DHA, spesielt 17-HpDHA og 17-HDHA, er langt mer potente enn deres opphavsmolekylet eller 15-LOX metabolitter av andre PUFA i å hemme proliferasjon av androgen positive og negative androgen humane prostatacancercellelinjer. I likhet med sine foreldre molekyl, DHA metabolitter «virkningsmekanismen innebærer PPARy /SDC-en apoptose-signalveien. Vi foreslår at prostatakreft-undertrykke effekten av kosttilskudd DHA er mediert delvis av konvertering av DHA til en eller flere av disse metabolittene.
Takk
Innholdet i dette manuskriptet er utelukkende ansvar av forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Cancer Institute eller National Institutes of Health.
