Abstract
Avanserte glykerte endeprodukter (alder) er produsert i en irreversibel ikke-enzymatisk reaksjon av karbohydrater og proteiner. Pasienter med diabetes mellitus (DM) er kjent for å ha forhøyet alderstrinn, som er sett på som en risikofaktor for diabetesrelaterte komplikasjoner. I et klinisk miljø, har det vist seg at pasienter med oral cancer i forbindelse med DM har en høyere sannsynlighet for kreft og metastase lavere kreft overlevelse. AGE-RAGE (en reseptor av aldre) er også korrelert med metastase og angiogenese. Nyere studier har antydet at malignitet av kreft kan forsterkes av glyseraldehyd-avledet aldre, men er fortsatt den underliggende mekanismen uklart. Denne studien undersøkte tilsynelatende nær sammenheng mellom AGE-RAGE og malignitet av SAS munnhulekreft cellelinje. I denne studien, i alderen økt ERK-fosforylering, forbedret cellemigrasjon, og fremmet uttrykk for raseri, MMP2, og MMP9. Ved hjelp PD98059, RAGE antistoff, og raseri RNAi å blokkere RAGE pathway resulterte i hemming av ERK-fosforylering. Cellemigrering, MMP2 og MMP9 ekspresjon ble også redusert ved denne behandling. Våre funn viser betydningen av AGE-RAGE med hensyn til malignitet av kreft i munnhulen, og bidra til å forklare dårlig prognose av DM pasienter med kreft i munnhulen
Citation. Ko SY, Ko HA, Shieh TM, Chang WC, Chen HI, Chang SS, et al. (2014) Cell migrasjon er regulert av AGE-RAGE Interaksjon i Human Oral kreft celler
In Vitro
. PLoS ONE 9 (10): e110542. doi: 10,1371 /journal.pone.0110542
Redaktør: Barry I. Hudson, Universitetet i Miami, USA
mottatt: 23 april 2014; Godkjent: 16 september 2014; Publisert: 16 oktober 2014
Copyright: © 2014 Ko et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Science Council, Taiwan (NSC 100-2314-B-309-002-My3). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Avanserte glykerte endeprodukter (alder) er et resultat av en Maillard reaksjon mellom karbohydrater og proteiner. Aldring og redusert metabolsk funksjon har vist seg å øke dannelsen av AGE [1] – [5]. Økt akkumulering AGE har også blitt observert hos pasienter med Alzheimers sykdom (AD) eller diabetes mellitus (DM) [6] – [8]. Videre tidene har vist seg å spille en rolle i patogenesen av DM, slik at AGE opphopning regnes som en risikofaktor for ulike komplikasjoner av sykdommen [9] -. [14]
Nyere studier har vist at aldre og raser (reseptorer av aldre) regulerer cellemigrasjon [15] – [17]. RAGE overekspresjon har vært knyttet til kreft i tykktarmen, strupehode, tunge, mage, og munn [18] – [20], gjennom karsinogenese [21], celleproliferasjon, metastase, invasjon, og angiogenese [22] – [25]. I en klinisk studie som inkluderte pasienter som lider av kreft i munnhulen samt DM, ble kreft stadig invasiv, noe som resulterer i en nedgang i overlevelse [26]. Studien videre identifisert en sammenheng mellom kreft i munnhulen og DM [27]. RAGE er blitt vist å være nært forbundet med invasjon i oral cancer [15], og malignitet av cancer kan bli styrket ved glyseraldehyd-avledet AGE [17]. Men den underliggende mekanismen ansvarlig for disse effektene er fortsatt uklart.
Denne studien undersøkte tilsynelatende sterk sammenheng mellom alder og malignitet av kreft i munnhulen. Våre resultater viser at AGEs forbedre cellemigrasjon og også øke ERK-fosforylering og uttrykk for raseri, MMP2, og MMP9. Forbehandling med PD98059 (en ERK-hemmer) ble funnet å undertrykke effektene av alder; Men RAGE uttrykk ble ikke hemmet. RAGE antistoffer ble også brukt til å blokkere konjugering av aldre, noe som resulterte i redusert ERK-fosforylering, uttrykk for MMP2, MMP9, og cellemigrasjon. Videre synes RAGE RNAi å regulere disse effektene, noe som tyder på at AGE-RAGE system endrer celle migrasjon gjennom ERK-fosforylering og regulering av nedstrøms veier. Våre funn gir ytterligere bevis på at AGE-RAGE spiller en viktig rolle i å bestemme malignitet av kreft i munnhulen.
Materialer og metoder
Reagenser
fenylmetylsulfonylfluorid fluorider (PMSF), storfe serum albumin (BSA), DL-glyseraldehyd, og PD98059 ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, Missouri, USA). DMEM medium, føtalt bovint serum (FBS), penicillin, streptomycin, Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), trypanblått, og Lipofectamine RNAiMAX ble innkjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). GAPDH (Cat No .: MAB374) ble kjøpt fra Chemicon (Temecula, CA, USA). ERK (Cat No .: SC-94), p-ERK (Cat No .: SC-7383), RAGE (Cat No .: SC-94), og Rage siRNA (Cat No .: SC-36374) ble kjøpt fra Santa Cruz bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). MMP2 (Cat No .: 2763-S) og MMP9 (Cat No .: 2551-S) ble kjøpt fra Epitomics (Burlingame, CA, USA). Nitrocellulosemembranene ble kjøpt fra PALL corp. (Ann Arbor, Michigan, USA). Forbedret chemiluminescence (ECL) ble kjøpt fra Millipore (Billerica, MA, USA). Wst-en kit ble kjøpt fra Clontech Laboratories, Inc. (Mountain View, CA, USA). Kultur-Insert ble kjøpt fra ibidi (Verona, WI, USA).
Utarbeidelse av aldre
aldre var forberedt ved å inkubere BSA (pH = 7,4) i PBS med 20 mM DL-glyseraldehyd på 37 ° C i en uke. Produktet ble dialysert i PBS ved 4 ° C i 2 timer, og denne syklusen ble gjentatt 5 ganger. Produktet ble deretter konsentrert ved 4 ° C ved anvendelse av en Amicon ultraproteinkonsentrasjon rør (Millipore) og sentrifugert ved 3000 rpm i 30 minutter før den ble lagret ved -80 ° C [28].
Cellekultur og behandling
munnhulekreft cellelinje SAS (japansk Innsamling av forsknings Bioressurser Cell Bank [JCRB], Japan) ble dyrket ved 37 ° C under 5% CO
2 atmosfære. Kulturen ble opprettholdt i DMEM-medium (Invitrogen) rutinemessig supplert med 10% FBS, 100 enheter /ml penicillin, 2 mM L-glutamin, og 100 ug /ml streptomycin. Celler ble inkubert serumfrie i 24 timer før behandling.
Trypan blått fargestoff utelukkelse assay
celler ble utsådd på 6-brønners plater ved en konsentrasjon på 10
5 per brønn og dyrket i 24 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt i henhold til deres evne til å utelukke 0,5% trypanblått (Invitrogen) etter behandling med 100-400 pg /ml aldre for 24 og 48 timer henholdsvis. Et like stort volum av trypanblått-farvestoff-oppløsning (0,1%, w /v), ble HBSS, og celleoppslemming kombinert og holdt ved romtemperatur i fem minutter. Prøvene ble deretter lastet opp på en hemocytometer å kategorisere celler som levende eller døde etter opptaket av fargestoffet. Alle tall som presenteres i denne studien er de midlere verdier av triplikate eksperimenter.
WST-1-analysen
Cellene ble sådd ut på 96-brønners plater ved en konsentrasjon på 5 x 10
3 per brønn og dyrket i 24 timer. Celleproliferasjon ble gjenkjent av WST-1 sett (Clontech) i kondisjonert medium. Prøvene ble fremstilt i henhold til protokollen beskrevet av produsenten. I korthet, etter behandling med AGE (0-400 ug /ml), ble det kondisjonerte mediet sentrifugert ved 2000 rpm i 10 minutter. Supernatanten ble deretter overført til 96-brønners plater (100 ul /brønn). Reaksjonsblandingen (100 pl) ble tilsatt til hver brønn, etterfulgt av inkubasjon i 30 minutter. I løpet av inkubasjonsperioden, ble prøvene holdt ved romtemperatur (RT) og beskyttet mot lys. Absorbansen av prøvene ble målt ved 490 nm. Referansebølgelengde bør være større enn 600 nm. Alle tall som presenteres i denne studien er middelverdier fra eksperimenter utført in triplo.
RNA interferens Eksperimenter
Cellene ble utsådd på 6-brønners plater ved en konsentrasjon på 2 x 10
5 celler per brønn og dyrket i 24 timer. Cellene ble så transfektert med RAGE siRNA (en pool av 3-target-spesifikke 19-25 nt siRNA; Santa Cruz) eller den senstråden sekvensen av RNAi som en negativ kontroll (5′-UUCUCCGCCCGUGUCACGU-3 «) [29]. Transfections ble utført ved bruk av Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. Spesielt fortynne 40 pmol av RNAi duplex i 250 ul Opti-MEM jeg redusert serum medium uten serum. Vi deretter forsiktig blande Lipofectamine RNAiMAX og fortynnet 4 pl av blandingen i 50 ul Opti-MEM I-redusert serummedium. Den fortynnede RNAi dupleks ble kombinert med fortynnet Lipofectamine RNAiMAX og inkubert i 20 minutter ved romtemperatur. Til slutt ble det RNAi duplex- Lipofectamine RNAiMAX komplekser til hver brønn. Dette resulterte i et sluttvolum på 600 pl og en endelig siRNA konsentrasjon på 20 nM. Celler ble inkubert i 48 timer før de ble brukt i forsøkene.
Western blot
proteiner (30 ug) ble løst ved anvendelse av 10% SDS-PAGE-gel og deretter overført på nitrocellulosemembraner (Pall Corp .). Membranene ble blokkert ved hjelp av ikke-fettholdig melk og inkubert over natten ved 4 ° C med følgende primære antistoffer: anti-p-ERK (fortynning av 1:1,000); anti-ERK (fortynning av 1:1,000); anti-MMP2 (fortynning av 1:1,000); anti-MMP9 (fortynning av 1:1,000); anti-RAGE (fortynning av 1:1,000;.. anti-GAPDH (fortynning av 1:40,000) Primære antistoffer ble deretter fjernet, og membranene ble vasket med PBST-buffer i 30 minutter Membranene ble deretter inkubert i 45 minutter ved RT med følgende sekundære antistoffer:. pepperrot-peroksidase-konjugert anti-mus (fortynning av 1:4,000) og anti-kanin (fortynning av 1:4,000) (Chemicon) til slutt, sekundære antistoffer ble fjernet og membranene ble vasket med PBST-buffer to ganger i 30 minutter. signaler ble påvist ved hjelp av Western Lighting Chemiluminescence Reagens Plus kit (Millipore). Densitetene for de signaler som ble målt ved bruk av et avbildningssystem, og signalene ble kvantifisert etter å ha blitt normalisert mot de av GAPDH. Alle tall som presenteres i dette papir er gjennomsnittsverdiene fra eksperimenter utført in triplo.
Cellemigrering migrering~~POS=HEADCOMP assay
cellene ble utsådd på 6-brønners plater ved hjelp av kultur-Insert (ibidi) ved en konsentrasjon på 6 x 10
5 celler pr brønn og deretter dyrket i 24 timer. Etter en periode på 24 timer i serumfrie forhold, ble det kultur-Setter fjernet og cellene ble vasket ved hjelp HBSS, før de blir behandlet med aldre for analyse av cellevandring.
Zymorgraphy analysen
Etter behandling med 200 til 400 ug /ml aldre for 4 eller 24 timer, ble cellene sådd ut på 7 cm skåler ved en konsentrasjon på 1 x 10
6 celler. Zymografi ble brukt for å påvise funksjonen av MMP2 og MMP9 i betinget medium. For å oppnå dette, brukte vi 7,5% SDS-PAGE gel som inneholder 0,1% gelatin (J.T.Baker, Center Valley, PA, USA). Gelen ble deretter vasket med 2,5% Triton X-100 i 30 minutter ved RT. Triton X 100 ble fjernet og gelen ble vasket med RO H
2O. Vi tilsatte deretter renaturering av buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.2,20% glycerol) i 30 minutter ved RT. Renaturering av buffer ble fjernet og gelen ble vasket med RO H
2O. Vi tilsatte deretter utvikle buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,8, 5 mM CaCl2, 1 mM ZnCl2) i 24 timer ved 37 ° C. Utvikling buffer ble fjernet og gelen ble vasket med RO H
2o. Gel farging ble gjennomført i 1 time ved romtemperatur ved hjelp PageBlue Protein Farging (Fermentas, Lafayette, CO, USA). Gel avfarging ble utført med RO H
2o ved RT. . (Fig S1)
Statistiske analyser
Vi har utført student t-test, enveis ANOVA, og p-verdiene av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater.
Influence of Ages på muntlige kreftceller
Vi først vurderes påvirkning av aldre på celle levedyktighet. SAS-celler ble behandlet med aldre (0-400 pg /ml) eller BSA (0-400 pg /ml) i 24 eller 48 timer, hvoretter antall celler og formeringshastigheten ble bestemt i henhold til trypan blå eksklusjon fargestoff (fig. 1A ) og WST-1-analyser (fig. 1B). Sammenlignet med kontrollceller, alder behandlede celler viste en signifikant reduksjon i antall celler (24 timer AGEs 100: 2,88 ± 0,16,
P
= 0,006; AGEs 200: 2,6 ± 0,25,
P
= 0,008; AGEs 400: 1,85 ± 0,05,
P
0,0001, 48 timer i alderen 100: 3,1 ± 0,18,
P
= 0,05; AGEs 200: 2,57 ± 0,17,
P
= 0,01; AGEs 400: 2,03 ± 0,08,
P
= 0,003). I motsetning til dette ble BSA vist å øke antall celler (som en negativ kontroll, 24 timer: 4,77 ± 0,32, NS; 48 timer: 9,25 ± 0,35,
P
= 0,0004) (figur 1A.). I tillegg ble celleproliferasjon vist å bli hemmet av AGE (Fig. 1B). Endelig behandling av celler med alder (400 mikrogram /ml, 0-4 timer) forbedret migrasjon; Men BSA ikke har noen effekt på migrasjon (Fig. 1C).
SAS celler ble behandlet med aldre (0-400 mg /ml) eller BSA (0-400 mg /ml) i 24 til 48 timer. ble detektert antall celler og spredning ved hjelp av trypanblått-eksklusjon fargestoff (A) og en WST-1-assay (B). AGE betydelig redusert antall celler; BSA (som en negativ kontroll) økt levedyktighet (A). AGE også hemmet celleformering (B). Behandling med aldre (400 mikrogram /ml, 0-4 timer). Forbedret cellemigrasjon, mens behandling med BSA ikke (C)
AGEs regulering av RAGE, MMP2, og MMP9
Celler ble behandlet med aldre (200 og 400 ug /ml) eller BSA (400 ug /ml) i 24 timer. Vi deretter brukt western blot analyse for å oppdage RAGE, MMP2, og MMP9. Sammenlignet med kontrollceller, viste resultatet at AGEs behandlede celler presentert en betydelig økning i RAGE (alder 400: 1,3 ± 0,03,
P
= 0,0007), MMP2 (alder 200: 1,28 ± 0,04,
P
= 0,002; AGEs 400: 1,47 ± 0,04,
P
= 0,004), og MMP9 (alder 400: 1,24 ± 0,03,
P
= 0,0008) (fig 2).. Videre ble funksjonaliteten MMP2 og MMP9 økt etter behandling med aldre for 4 eller 24 timer (Fig S2).
Etter behandling av cellene med aldre (200 og 400 mikrogram /ml) eller BSA (400 mikrogram /ml ) i 24 timer, RAGE, MMP2, og MMP9 ble oppdaget av western blot analyse (A). AGEs betydelig økt uttrykk for raseri, MMP2, og MMP9 (B).
Regulering av ERK-fosforylering av aldre
For å identifisere den sti av aldre, SAS celler ble behandlet med alder eller BSA i 24 timer. ERK-fosforylering ble så detektert ved hjelp av western blot-analyse. Våre resultater viser at behandling med alder betydelig økt ERK-fosforylering (alder 400: 1,26 ± 0,06,
P
= 0,01) (figur 3A.). ERK-fosforylering ble forsterket etter 4 timer AGEs behandling (fig S2); imidlertid, å forbehandle celler med PD98059 i 1 time resulterte i en reduksjon i ekspresjonen av MMP2 og MMP9 (fig. 3B og C). Det ser ut til at PD98059 forbehandling blokkert effekten av aldre på celle migrasjon (Fig 3D.); Men RAGE uttrykk ble ikke påvirket (alder 400: 1,27 ± 0,04,
P
= 0,003) (fig 3E.)
Western blot analyse som viser at behandling av SAS celler med aldre for 24 timer. resulterte i økt ERK-fosforylering (A). Forbehandling med PD98059 i 1 time redusert ERK-fosforylering, MMP2 og MMP9 (B og C), samt cellemigrering (D); men RAGE nivåene fortsatt økt (E).
Regulering av ERK av AGEs via RAGE
RAGE antistoffer (10 ng /ml forbehandling for en time) ble brukt til å blokkere AGE konjugasjon. Behandling med alder resulterte i en betydelig økning i ERK-fosforylering og uttrykk for MMP2, og MMP9 (ERK: 1,31 ± 0,03,
P
= 0,0008; MMP2: 1,38 ± 0,04,
P
= 0,0005, MMP9: 1,32 ± 0,09,
P
= 0,02). Sammenlignet med celler behandlet med alder alene, celler behandlet med både alder og RAGE antistoff viste signifikant hemmet ERK-fosforylering (
P
= 0,009) samt redusert uttrykk for MMP2 (
P
= 0,05) og MMP9 (
P
= 0,0003) (fig. 4 A og B). RAGE-antistoffer ble også vist seg å undertrykke cellemigrering (fig. 4C).
Bruken av RAGE-antistoff (10 ng /ml forbehandling i 1 time) for å blokkere AGE konjugering resulterte i en betydelig økning av ERK-fosforylering, MMP2, og MMP9 grunn aldre. Sammenlignet med alder behandling (#), RAGE antistoff blokkert ERK-fosforylering, MMP2, og MMP9 (A og B) samt cellemigrasjon (C).
RAGE RNAi (20 nM i 48 timer) ble så brukt til å avstille proteinekspresjon. Sammenlignet med RNAi negativ kontroll (N), ble RAGE RNAi vist å ha en betydelig undertrykke RAGE uttrykket (0,64 ± 0,07,
P
= 0,006) (Fig. 5A). Den undertrykkelse av cellemigrering av RAGE RNAi ble funnet å forekomme uavhengig av hverandre fra virkningene av alder (fig. 5B). Videre RAGE RNAi hemmet ERK-fosforylering (RNAi: 0,64 ± 0,08,
P
= 0,01; N + aldre: 1,26 ± 0,03,
P
= 0,001) MMP2 (N + aldre: 1,28 ± 0,04,
P
= 0,003), og utskillelsen av MMP9 (RNAi: 0,58 ± 0,06,
P
= 0,002, N + aldre: 1,36 ± 0,05,
P
= 0,003). Sammenlignet med N + aldre, behandling med RNAi + AGEshad en betydelig effekt på alle tre av disse prosessene (ERK:
P
= 0,02; MMP2:
P
0.003, MMP9:
P
= 0,04) (fig. 5C og D). Den negative kontrollen viste ikke signifikante effekter.
RAGE RNAi (20 nM i 48 timer) ble brukt til å slå protein uttrykk. Sammenlignet med RNAi negativ kontroll (N), RAGE RAGE RNAi betydelig redusert uttrykket (A). Undertrykkelsen av celle migrasjon av RAGE RNAi skjedd uavhengig av behandling med alder (B). RAGE RNAi også hemmet ERK-fosforylering, MMP2, og MMP9. Sammenlignet med N + aldre (#), RNAi + AGEs presentert en betydelig reduksjon (C og D) og den negative kontrollen hadde ingen effekt.
Diskusjoner
En sammenheng mellom kreft i munnhulen og DM har blitt demonstrert av tidligere forskere [30] – [32]. Pasienter som lider av kreft i munnhulen i forbindelse med DM er ansikt med svært invasive kreftceller, og lave overlevelse [26]. Imidlertid har den mekanisme som ligger til grunn forholdet mellom oral cancer og DM ikke blitt klarlagt. Dette er den første studien for å undersøke en mulig kobling mellom alder og kreft i munnhulen. Vi gjennomførte denne forskningen for å identifisere rollen til AGE-RAGE system i oral cancer, og for å belyse sammenhengen mellom kreft i munnhulen og DM
Forskere har tidligere rapportert at aldre og RAGE regulere cellemigrasjon [15]. – [17], [33]. Våre resultater bekrefter at AGEs forbedre celle migrasjon og også vise at AGEs redusere celle levedyktighet. Takino et al. innhentet lignende funn ved hjelp av glyseraldehyd-avledet AGEs [17]. Videre Bhawal et al. rapportert at RAGE er nært knyttet til invasivitet av munnhulekreft [15], og våre funn viser at AGEs regulerer celle migrasjon via uttrykk for raseri. I en klinisk setting, har uttrykket av MMP2 og MMP9 syntes å være nært knyttet til metastaser i munnhulekreft [34], [35]. Tider har videre blitt vist å øke utskillelsen av MMP2 [17] og regulere MMP9 uttrykk [36], [37] via ERK-reaksjonsveien [23], [38]. Våre resultater støtter disse tidligere funn; spesielt blir det ERK-fosforylering og ekspresjon av MMP2 og MMP9 regulert av aldre. I tillegg er CD44 en migrering faktor knyttet til Rage [39]. Men vi kunne observerte signifikant forskjell i CD44 ekspresjon følgende AGE behandling (data ikke vist). En tilsvarende rapport bekreftet at uttrykket av CD44 ikke påvirkes av AGEs [40]. Dette tyder på at AGEs-RAGE regulere cellemigrasjon via en sti som ikke er CD44 avhengig
Nyere studier har antydet at RAGE er et multiplum reseptor som regulerer celledeling gjennom sin ligand (S100 eller HMGB1) [41]. – [43]. Xu et al. og Meghnani et al. foreslår også at RAGE øker celledeling og tilhørende veier [44], [45]. Videre har HMGB1 blitt funnet å regulere celledeling og metastasering via RAGE og melanom hemmende aktivitet (MIA) sti i munnhulekreft [46]. I vår studie, aldre og BSA ser ut til å variere i deres effekt på SAS-celler. AGE ble vist å redusere antall celler; imidlertid økt BSA det. Mer spesifikt, i denne studien cellene ble inkubert serumfrie i 24 timer før behandling; dermed BSA kan ha fungert som en vekstfaktor. Våre funn som eldes redusert antall celler, mens økende ERK-fosforylering viser tydelig at AGE varierer i sine virkninger på celler. Valencia et al. viste også at divergerende veier av genuttrykk aktiveres av RAGE ligand S100 og aldre [47]. Derfor effekten av AGE-RAGE system skiller seg fra andre ligander
Bruk av PD98059 å blokkere ERK pathway resulterte i undertrykkelse av cellevandring og også redusert uttrykk for MMP2 og MMP9.; imidlertid ingen forskjell ble observert med hensyn til påvirkning av AGE i økende RAGE uttrykk. Bruken av RAGE antistoff og RNAi å blokkere AGEs-RAGE pathway resulterte i hemmet ERK-fosforylering og cellemigrasjon og også redusert uttrykk for MMP2 og MMP9. Disse funnene viser at effektene av aldre på celle migrasjon skje via ERK-fosforylering. Interessant nok en tidligere klinisk studie antydet at økningen i RAGE nivåer i kreft korrelert med metastase [15], [33]. I andre cellemodeller, RAGE syntes å regulere cellemigrering [15], [48], [49]. Våre resultater viser at effektene av RAGE RNAi innflytelse celle migrasjon, ERK-fosforylering, og MMP9 uttrykk uavhengig. Dette funnet gir ekstra støtte for påstanden om at RAGE formidler metastase gjennom uttrykket av MMP9 via ERK veien.
I denne rapporten, i alderen redusert celle levedyktighet og forbedret cellevandring, mens fremme ERK-fosforylering og styrke uttrykk for MMP2 og MMP9. PD98059, RAGE antistoff, og RNAi ble vist å megle AGE regulering. Dette er den første studie for å vise at RAGE regulerer ekspresjonen av MMP9 via ERK-reaksjonsveien. Enda viktigere, demonstrerte vi rollen som AGE-RAGE spiller i malignitet av munnhulekreft gjennom regulering ERK og nedstrøms trasé, til syvende og sist påvirker cellemigrasjon i kreft i munnhulen. Den mekanismen som de AGE-rage systemet fungerer i vår
in vitro
modell av munnhulekreft er presentert i Fig. 6. AGEs øke RAGE uttrykk, som stimulerer nedstrøms sti ERK-fosforylering og resulterer i oppregulering av MMP2 og MMP9. Dette i sin tur forbedrer cellemigrering, som manifesterer seg i malignitet av kreft. Disse funnene forklare hvorfor tilfeller av kreft i munnhulen samtidig med DM stede økt kreft invasjon og redusert overlevelse. Resultatene tyder også på at oppbyggingen av aldre på grunn av aldring eller DM øker sannsynligheten for å utvikle ondartet kreft.
AGEs øke RAGE uttrykk og stimulere nedstrøms vei av ERK-fosforylering. Dette har effekten av opp regulerende MMP2 og MMP9 uttrykk og styrke celle migrasjon, som manifesterer seg som malignitet.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Nedleggelse av celle migrasjon området. Migrasjon området ble målt ved hjelp ImageJ og kvantifisert ved å registrere endringer i såret området. AGEs betydelig redusert størrelsen på såret området, mens PD98059, RAGE antistoff, og RAGE RNAi trykt migrasjon på 4 timer. Analyse var opptreden av enveis ANOVA, og resultatet var statistisk signifikant (p 0,0001)
doi: 10,1371 /journal.pone.0110542.s001 plakater (TIF)
Figur S2..
Funksjonelt av MMP 2 og MMP 9. Etter behandling av SAS celler med alder (400 mikrogram /ml) i 0,5-4 timer, uttrykket av ERK-fosforylering ble oppdaget. Det funksjonelt av MMP 2 og MMP 9 ble påvist ved zymorgraphy følgende AGE behandling i 4 eller 24 timer. Resultatene viser at AGE øket ERK-fosforylering (A). MMP 2 og MMP 9 ble økt med aldre på 4 timer, men bare MMP 2 ble økt til 24 timer (B)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0110542.s002 plakater (TIF)
