Abstract
Blærekreft er den fjerde vanligste årsaken til kreft hos menn i USA. Invasive atferd er veldig avgjørende for prognose. I denne studien har vi identifisert mammalian target of rapamycin kompleks 2 (mTORC2) som en sentral regulator av blærekreft celle migrasjon og invasjon. mTORC2 aktivitet ble bedømt ved graden av fosforylering av Ser473 i AKT og bestemt til å være omtrent fem ganger høyere i prøver av humant invasiv blærekreft i motsetning til ikke-invasiv human blærekreft. De udødeliggjorte ondartede blærecellelinjer, UMUC-3, J82 og T24 viste høyere referanse mTORC2 aktivitet i forhold til den godartede blære papilloma-avledet cellelinje RT4 og den normale urothelial cellelinje HU1. De ondartede blære kreftceller også vist økt migrasjon i Transwell og denudasjon analyser, økt invasjon av matrigel, og økt kapasitet til å invadere menneskelige blære prøver. Gene stanse all rictor, en kritisk komponent i mTORC2, vesentlig hemmet blærekreft celle migrasjon og invasjon. Dette ble fulgt av en signifikant nedgang i Rac1 aktivering og paxillin fosforylering. Disse studiene identifiserer mTORC2 som et viktig mål for å nøytralisere blærekreft invasjon
Citation. Gupta S, Hau AM, Beach JR, Harwalker J, Mantuano E, Gonias SL, et al. (2013) mammalian target of Rapamycin Complex 2 (mTORC2) Er en kritisk avgjørelse blærekreft invasjon. PLoS ONE 8 (11): e81081. doi: 10,1371 /journal.pone.0081081
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 11 juli 2013; Godkjent: 08.10.2013; Publisert: 27.11.2013
Copyright: © 2013 Gupta et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av case Western Reserve University /Cleveland Clinic CTSA Grant Antall UL1 RR024989 fra National Cancer Institute, og en KL2 karriereutvikling award (RR024990) til dE Hansel. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blære kreft står for mer enn 70.000 nye krefttilfeller i USA årlig, med en estimert global forekomst av 386,000 tilfeller per år [1,2]. Urothelial karsinom (UCA) utgjør ca 95% av alle blære kreft, med pasientens utfall hovedsakelig påvirket av patologisk karakter og scene [3]. Grade er en primær bidragsyter til atferd i ikke-invasiv UCA, som er delt inn i lav grad og høy grad av kategorier. Lavgradig sykdom viser hyppig lokalt residiv på blæren overflaten, men sjelden progresjon til invasiv sykdom [4]. Høy grad av sykdommen utvikler seg til invasjonen i 40-50% av pasientene [5]. Når invasjonen skjer, reduserer sykdomsspesifikk overlevelse med økende patologisk trinn (dvs. dybden av invasjonen i blæreveggen), til tross for terapeutisk intervensjon.
Blærekreft er fortsatt et relativt studerte sykdom og de cellulære mekanismene som bestemmer kreft progresjon er ufullstendig forstått. Høy grad av sykdom ofte viser
RB Hotell og
TP53
mutasjoner og
PTEN
sletting; Imidlertid kan disse genetiske endringer observeres i både invasive og ikke-invasive lesjoner. Identifisering av pro-invasive baner i blærekreft har vært mer utfordrende. Nyere arbeider har vist at fibroblast-vekstfaktor-reseptor-1 (FGFR1) fremmer invasjon av blærecancerceller som uttrykker ZEB1, en markør av epitelial-mesenchymale overgang (EMT) [6]; FGFR hemning i denne studien reduserte metastatisk spredning av orthotopically implanterte blærekreftceller. FOXQ1 uttrykk var også assosiert med en EMT signatur i blæren kreftceller og stanse all FOXQ1 økt E-cadherin uttrykk, redusert vimentin uttrykk og svekket invasiv oppførsel [7]. Den phosphoinositide-3 kinase-AKT-mammalian target of rapamycin (mTOR) veien har blitt identifisert som en kandidat sti i blærekreft progresjon i flere nyere clinicopathological studier [8,9]. Selv om vi har identifisert en rolle for mTORC1 i å fremme blærekreft spredning
in vitro Hotell og blærekreft xenograft vekst
in vivo product: [9], har rollen mTOR signalering i blærekreft invasjonen ikke vært utforsket.
mTORC2 er et attraktivt mål for inhibering av blærekreft invasjon fordi det har vist seg å påvirke cytoskeletal remodellering, cancer celle adhesjon og migrering [10-12]. mTORC2 skiller seg fra mTORC1 ved tilstedeværelsen av rictor, protor og mSin1 underenheter, som er nødvendig for full-kinase-aktivitet [13,14]. Nedstrøms effektorer inkluderer AKT og Rho GTPases (Rho, Rac og Cdc42) som regulerer adhesjon og migrasjon [12,15,16]. mTORC2 kan også regulere EMT [17] og har vært innblandet i invasjon og metastasering i tykktarm og brystkreft [10,18]. Selektiv målretting av mTORC2 reduserer kreft metastase i musemodeller [10]; imidlertid dens rolle i blærekreft, invasjon og metastase er ukjent.
I denne studien vi undersøke rollen av mTORC2 i blærekreft celle invasjon. Vi har benyttet humane blærecancer prøver for å vise at øket mTORC2 aktivitet er forbundet med en invasiv fenotype. Disse studiene er kombinert med
in vitro Hotell og romanen
ex vivo
menneskelige blæreveggen invasjon analyser for å vise den kritiske rollen mTORC2 i blærekreft celle migrasjon og invasjon. Endringer i Rho GTPase signale er detaljert. Resultatene fra denne studien tyder på at mTORC2 kan bli en spennende roman mål i begrenser blærekreft progresjon.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
RT4, UMUC3, T24 og J82-celler ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). HU1 celler var en generøs gave fra R. Rackley (Cleveland Clinic). Celler ble dyrket i RPMI-1640 (GIBCO, Invitrogen Corp., Grand Island, NY) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, GIBCO) og antibiotisk /antimykotisk oppløsning (Sigma, Inc., St. Louis, MO). Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. Serum sult ble utført i 16 timer ved å opprettholde celler i medium som manglet serum, med tre fosfat-bufret saltløsning (PBS) vaskinger i løpet av denne tidsperioden. Til serum-stimulere celler, ble 10% FBS tilsatt. Rapamycin ble innhentet fra Santa Cruz Bioteknologi (Dallas, TX).
pasientprøver
All forskning som omfatter mennesker deltakere ble godkjent av Cleveland Clinic IRB og skriftlig samtykke ble innhentet fra pasienter. Friske vevsprøver ble oppnådd ved tidspunktet for kirurgi, flash frosset og lagret ved -80 ° C. Frosne snitt ble analysert ved hjelp av mikroskopi for å bekrefte at mer enn 90% av cellene i prøvene underkastet immunoblotanalyse ble tumorceller. Tumor karakteren ble bekreftet av en patolog. For immunoblot analyse, ble vevsprøver homogenisert ved hjelp av strøm Gen 500 homogenisator (Thermo Scientific, San Diego, California).
Rictor lyddemping
siGENOME ikke-måls kontroll (NTC) siRNA og siGENOME SMARTpool Rictor spesifikke siRNA ble hentet fra Dharmacon (Thermo Scientific). Transfeksjoner ble utført i 48 timer ved hjelp av Lipofectamine® RNAiMAX reagens (Invitrogen). Lyddemping ble bekreftet ved immunblotanalyse.
immunoblotanalyse
Celler og vevsprøver ble ekstrahert i RIPA-buffer inneholdende protease inhibitor cocktail (Sigma) og fosfatase-inhibitor cocktail 1 og 2 (Sigma) og underkastet SDS-PAGE på 4-15% stigning gels. Proteiner ble overført til Hybond ECL membraner (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) ved hjelp av Bio-Rad transblot semidry overføringssystem (Life Science Research, Hercules, CA). Membranene ble blokkert med 1% bovint serum albumin og inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C i blokkeringsløsning. Antistoffer, som ble hentet fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA), målrettet rictor (1: 1000), p-AKT (Thr308, 1: 1000), p-AKT (Ser473, 1: 1000), pan-AKT (1 : 2000), p-S6 (1: 2000), total-S6 (1: 2000), og aktin (1: 5000). Blottene ble inkubert med alkalisk fosfatase-konjugert sekundære antistoffer (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) ved romtemperatur i 1 time og utviklet ved hjelp av ECF ™ Western blotting reagenvolumer pakker (GE Healthcare). Densitometry ble utført ved hjelp av Imagequant programvare (GE Healthcare).
Cell spredning og morfometrisk analyse
Celler ble trypsinert og belagt med lav tetthet på borosilikat kammerdekkglass slips (Nalge Nunc International, Naperville, IL) belagt med 20 pg /ml fibronektin. Tid lapse bildebehandling ble utført ved hjelp av en Leica TCS-SP2 med en Plan-Apochromat 63x /1.4 NA olje objektiv (Leica, Buffalo Grove, IL) i 24 timer og celle morfologi ble analysert ved hjelp av Image J programvare (http: //rsbweb.nih gov /ij /). Det totale arealet av individuelle celler ble kvantifisert for hver tilsvarende tidspunkt og plottet i forhold til medgått tid.
Modifisert scratch såret migrasjonsanalyser
Modifisert scratch såret migrasjon analysene ble utført som tidligere beskrevet [19 ]. I korte trekk vevskulturplater ble forbehandlet med 20 ng /ml fibronektin i PBS i 1 time. En tynn strimmel av polydimetylsiloksan (PDMS) ble plassert i midten av hver brønn og tillatt å overholde. Celler ble sådd ut på toppen, og inkubert i 18 timer, hvoretter PDMS strimlene ble fjernet for å avdekke en uaffisert fibronektin matrise. Flere synsfelt per brønn ble fotografert med jevne mellomrom ved hjelp av Leica DM IRE2 mikroskop (Leica) og MetaMorph bildebehandlingsprogrammer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Transwell invasjons analyser
Transwell invasjon analysene ble utført som tidligere beskrevet [9] med 8 micron PET membraner (Corning Life Sciences, Tewksbury, MA) belagt med Matrigel (BD Biosciences, San Jose, California). Celler ble sådd ut på membraner i serumfritt medium (SFM), og tillatt å migrere i 24 timer mot et sammenkoblet kammer som inneholder medium supplert med 10% FBS. Membraner ble fiksert med 4% paraformaldehyd, permeabilisert i 0,1% Triton X-100, og farget med DAPI. Toppen av membranen ble tørkes av med en bomullspinne slik at kun transmigrating celler ble talt opp. Synsfelt ved 200x forstørrelse ble tilfeldig fotografert med Leica DMR mikroskop og antall celler tilstede ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare.
blæreveggen invasjon analysen
For blære slice analyser, frisk, full -thickness skiver av blæreveggen ble oppnådd fra pasienter som gjennomgår radikal cystectomy og ble oppnådd fra sykdomsfrie partier av blæreveggen ved en urologisk patolog. Basalmembranen ble strippet for å eksponere bindevev (lamina propria) og den ytre del av perivesical fett ble innleiret i agaren. Vevet ble opprettholdt i RPMI /10% FBS med antibiotika /antimykotika i 7-10 dager. Blære kreft celler ble merket med CellTrackerTM Rød, seeded på vevet skive, og inkuberes i 3-7 dager med vanlige endringer av medium på 24 timers mellomrom. For å vurdere invasiv dybde av tumorceller, ble vev vinkelrett snittet 10 mikron mellomrom for å se alle vev lag og celler ble visualisert ved anvendelse hematoxylin og eosin (H skala bar 80 mikrometer);
B
, non-invasiv høyverdig papillær UCA (ikke-inv HG; skala bar 80 mikrometer); og
C
, invasiv høyverdig UCA å bestemme mTORC2 aktivitet (skala bar 100 mikrometer).
D
, immunoblotting for p-Ser473 som en markør av mTORC2 aktivitet ble utført, og viser høyere mTORC2 aktivitet både non-invasiv HG og invasive lesjoner.
E
, densitometry ble brukt til å kvantifisere p-Ser473 /total AKT signalintensitet; gjennomsnitt og standardfeil for gjennomsnittet (SEM) ble normalisert til den gjennomsnittlige signalintensitet for de ikke-invasive LG prøver.
mTORC1 og mTORC2 aktiveres i Ondartede blærekreft Cells
Vi sammenlignet mTORC1 og mTORC2 signalering i hTERT-udødelig normale urotelialceller (HU1) [22], godartet blære papilloma-avledet RT4 celler og i invasive UMUC-3, T24, og J82 blære kreftceller. mTORC1 aktivitet ble bestemt ved å måle fosforylering av p70 S6-kinase (p-S6), mens mTORC2 aktivitet ble bestemt ved p-Ser473 AKT nivåer. Under grunnlinjebetingelser, i serumholdig medium, og HU1 RT4 celler viste lave nivåer av AKT-fosforylering ved treonin 308 (p-Thr308), som reflekterer aktivering av PI3K og PDK1 oppstrøms for AKT (figur 2A). p-Ser473 og p-S6 også var lav i HU1 og RT4 celler. De tre ondartede blærekreftcellelinjer vist økte p-Thr308, p-S6, og p-Ser473 nivåer.
En
viser immunoblotting høyere mTORC1 (p-S6) og mTORC2 (p -Ser473) aktivitet i ondartet UMUC-3, T24 og J82 blære kreftceller sammenlignet med normale urothelial HU1 celler og godartede RT4 celler.
B
, serum stimulering indusert mTORC2 aktivitet i maligne blæren kreftceller. mTORC1 signale var lydhør overfor rapamycin i denne modellen; mTORC2 var det ikke.
Neste vi evaluert mTORC1 og mTORC2 aktivitet i blæren kreftceller som ble gjort hvil av serum sult og deretter stimulert ved å legge serum (figur 2B). I RT4 celler, p-Ser473 var knapt synlig før og etter serum stimulering. I T24 og J82-celler, p-Ser473 var minimal etter serum sult men øket vesentlig ved tilsetning av serum. UMUC-3 celler demonstrerte p-Ser473 selv etter serum sult og en beskjeden økning i p-Ser473 etter tilsetting serum. Disse resultatene tyder på at mTORC2 aktiveres i respons til stimulering serum i invasive blærekreftceller. I motsetning til dette økte p-S6 som respons på stimulering serum i benign og maligne blærekreftceller. Lav dose rapamycin (10 nM), en hemmer av mTORC1, selektivt blokkert p-S6 og hadde liten eller ingen effekt på mTORC2 aktivitet [9].
I tidskurs eksperimenter i J82 celler, økt mTORC2 aktivitet raskt etter serum stimulering og ble opprettholdt gjennom minst 6 timer i kultur (figur 3A). Kinetikken til mTORC2 (p-Ser473) aktivering og deaktivering var lik dem som er identifisert for mTORC1 (p-S6). For å bekrefte at p-Ser473 spesielt reflektert mTORC2 aktivitet, forstummet vi rictor i J82 celler ved hjelp av samle siRNA. Som vist i figur 3B, rictor gen-Silencing var effektiv og fullstendig ablateres fosforylering av Ser473 residuet på AKT som reaksjon på serum. Fosforylering av mTORC1 målet, S6, var upåvirket, demonstrere spesifisitet i taushet hendelsen. Non-targeting kontroll (NTC) siRNA endret ikke rictor nivåer eller respons på serum stimulering. Lignende resultater ble oppnådd i forsøk med T24-celler (resultater ikke vist). Disse funnene demonstrerer effektiv rictor gen-taushet en tilhørende reduksjon i mTORC2 signalering.
En
, serum stimulering i J82 celler viser høye nivåer av mTORC2 (p-Ser473) aktivitet etter 5 min som vedvarer gjennom seks timer.
B
, rictor gen-Silencing bruker samlet siRNA dramatisk reduserer påvisbare rictor protein og ablates p-Ser473 i forhold til det som ble observert i celler transfektert med NTC siRNA. Ingen effekt på mTORC1 signale (p-S6) ble detektert.
mTORC2 er en kritisk regulator av celle migrasjon og invasjon i blærekreft
Vi brukte en modifisert ripe sår analyse for å vurdere cellemigrasjon i T24 blære kreft celler som ble transfektert med NTC eller rictor-spesifikke siRNA (figur 4A). Grunnen var fibronektin-belagt. I celler transfektert med NTC siRNA, ble det observert betydelig migrering bare i nærvær av serum. Rictor-spesifikk siRNA reverserte effektene av serum på cellemigrering. Figur 4B oppsummerer effektene av rictor-stanse for T24 cellemigrering som en funksjon av tiden. Statistisk signifikant reduksjon i cellemigrasjon ble assosiert med rictor gen-Silencing 10-24 timer. Lignende resultater ble oppnådd da rictor ble stille i J82 celler og cellemigrasjon ble undersøkt (resultater ikke vist).
En
, serum sult blokkert J82 blærekreft cellemotilitet. Tilsetning av serum indusert robust migrering av J82-celler som ble transfektert med NTC siRNA, som bestemt ved anvendelse av en modifisert ripe assay. Migrasjon ble hemmet av rictor gen-demping. Scale bar 100 mikrometer.
B
, viser kvantifisering en reduksjon i avstanden av migrering av celler transfektert med rictor spesifikke siRNA (□) sammenlignet med celler transfektert med NTC siRNA (▲). Også vist er celler som var ikke serum-stimulert (♦). Totalt 6 rammer ble analysert for hvert tidspunkt per tilstand.
C
, transwell invasjon på Matrigel-belagte membraner viser høyere antall maligne blæren kreftceller som invaderer. D, rictor gen-tie reduserer celle invasjon av alle tre ondartede blære cellelinjer i transwell analysen. (*) Statistisk signifikant sammenligning bruker student t-test, p. 0,05)
Blærekreft celle invasjon ble opprinnelig undersøkt ved hjelp av rekonstituert Matrigel i Boyden kamre. Hver av de tre maligne blærekreftcellelinjer viste signifikant økt invasjon gjennom Matrigel, sammenlignet med de ikke-maligne RT4 celler (Figur 4C). Rictor gen-tie betydelig redusert invasjon av ondartede blærekreftceller (Figur 4D). I J82-celler, ble invasjon inhibert med mer enn 80%. Effekten av rictor gen-Silencing antydet at mTORC2 kan være et viktig mål for å hemme invasjon av blærekreft.
Menneskeblæreveggen invasjon av blærekreftceller krever mTORC2
For å støtte vår hypotese videre at mTORC2 kan være avgjørende for å regulere blærekreft celle invasjon, har vi utviklet en ny
ex vivo
modellsystem for å teste invasjonen av normal blæreveggen. Full-tykkelse deler av voksent menneske blære som inkluderte lamina propria (LP, fibroblast-dominerende bindevev med blodkar), muskularis propria (MP; tette bunter av glatt muskulatur) og peri-vesical fett (PV fett, primært fibroadipose vev og blodkar ) ble forankret i agar og badet i cellekulturmediet (figur 5A). Vi sås disse preparater med fluoresceinmerkede maligne J82-celler og tillatt disse cellene til å trenge gjennom blæreveggen i 72 timer. J82 celler som ble utsatt for rictor gen-Silencing eller behandlet med NTC siRNA også ble inokulert på blæreveggen forberedelsene. Invaderende celler ble lett identifisert ved lysmikroskopi (figur 5B). Immunhistokjemisk farging for pancytokeratin (cytokeratin AE1 /3) bekreftet at de invaderende cellene epitelial opprinnelse (figur 5C). Fluorescent avbildning av invaderende celler er vist figur 5D. Det ble observert en signifikant økning i invasjon når de ondartede J82-celler ble sammenlignet med celler (RT4 p 0,05, figur 5E). Rictor gen-silencing i J82 cellene betydelig redusert invasiv dybde (figur 5F), noe som indikerer en viktig rolle for mTORC2 i å regulere J82 celle invasjon i vår
ex vivo
menneskelig modellsystem.
En
, skjematisk viser orientering av menneskelig blæreveggen invasjon analysen som inkluderer lamina propria (LP), muskularis propria (MP) og perivesical fett (PV fett). B, H E avsnittet viser invaderende J82 celler i lamina propria etter 72 h (skala bar 200 mikron)
C
, celler markert i forrige panel viste positiv farging for pancytokeratin (skala bar 100 mikrometer).
D
viser immunofluorescent flekken invasjon av ondartede J82 celler (røde), på 72 timer (skala bar 50 mikrometer).
E
, kvantifisering av vev invasjon av RT4 og J82 celler (mikron).
F
, rictor gen-tie hemmer betydelig invasjon av blæren helt J82 celler. (*) Statistisk signifikant sammenligning bruker student t-test, p. 0,05)
Rac1 er en nedstrøms effektor av mTORC2 i blæren kreftceller
Deretter undersøkte vi effekten av rictor gen-Silencing på J82 celle spredning. Celler som ble transfektert med NTC siRNA og lov til å spre seg på fibronektin viste bred cytoplasmatiske utvidelser og en flat morfologiske utseende (Figur 6A). I kontrast, rictor gen-Silencing ga mindre ovale celler som ikke klarte å spre seg. Kvantifisering av overflatearealet som dekkes av adherente celler bekreftet at rictor gen-tie vesentlig attenuert spredning av J82-celler (Figur 6B). Vi neste brukte J82 celler for å evaluere fosforylering av paxillin, som regulerer brennvidde heft dannelse og omsetning, og kan regulere lamellipodium formasjon [23]. Rictor gen-Silencing reduserte nivået fosfor-paxillin i maligne J82 celler i forhold til NTC transfekterte celler. Analyse av Rac1 aktivering i J82 celler viste en betydelig reduksjon i nivået av GTP-lastet (aktivert) Rac1 (Rac1-GTP) når rictor ble stille (figur 6D). Densitometry viste at rictor knockdown redusert Rac1 nivåer til 60,2% av rictor-uttrykke celler. I motsetning ble GTP-aktivert RhoA beskjedent redusert med rictor stanse, med rictor knockdown redusere RhoA aktivitet til 83,3% av rictor-uttrykke celler (figur 6E).
J82-celler ble transfektert med enten rictor spesifikke siRNA eller NTC siRNA 72 timer før starten av forsøket.
En
viser immunfluorescens farging brede cytoplasmatiske prosesser og perifer fosfor-paxillin i celler som er transfektert med NTC siRNA. Dette er redusert i celler med rictor gen-demping. Målestokken 30 mikrometer.
B
, celleoverflate områder ble bestemt for J82 celler transfektert med NTC (♦) eller rictor spesifikke siRNA (▲) og lov til å spre seg i de angitte tidsrom (gjennomsnitt ± SEM, n 15 for hver gang punkt, (*) p 0,05).
C
, immunoblotting for fosfo-paxillin i J82-celler som ble transfektert med rictor spesifikk eller NTC siRNA og tillates å følge i 30 minutter.
D
, GTP-Rac1 ble bestemt i J82 celler transfektert med NTC eller Rictor spesifikke siRNA. Rictor knockdown redusert Rac1 nivåene til 60,2% av kontroll. Celler med GTPyS ble analysert som en positiv kontroll og BNP som negativ kontroll.
E
, GTP-lastet RhoA i J82 celler transfektert med rictor spesifikk eller NTC siRNA. Rictor knockdown redusert RhoA nivåer til 83,3% av kontroll.
Diskusjoner
I blærekreft, lokal invasjon inn i muskularis propria (detrusor muskelen) er en viktig faktor for prognose og påfølgende pasient terapi. Signalveier som er unikt involvert i blærekreft celle invasjon bør være førsteklasses mål for legemiddelutvikling. Men ofte er beskrevet genetiske og signal- endringer i blærekreft har ikke vært betraktet i sammenheng med invasjon. HG UCA, som utvikler invasive atferd i en undergruppe av pasienter, havner ofte mutasjoner i
TP53 Hotell og
RB
. Mutasjoner og /eller tap av disse onkogener har vært implisert i defekte cellesyklusregulering [21]. Endringer i fosfatase og tensin homolog (PTEN) lipid /protein fosfatase er påvist hos omtrent 30% av pasienter med blærekreft og omfatter homozygot genet sletting, tap av heterozygositet (LOH), og genmutasjon [24]. Imidlertid er den ultimate effekten av
PTEN
på nedstrøms signalkaskader som mTORC2 i blærekreft invasjon uklart.
I denne studien, viste vi at mTORC2 aktivitet korrelerer med menneskelig blærekreft klasse og invasjon. På mekanistisk nivå, styrer mTORC2 blærekreft celle spredning, migrasjon og invasjon av Matrigel. mTORC2 regulerer også blærekreft invasjon i en roman
ex vivo
human blære modell som fanger opp det komplekse mikromiljøet i blæreveggen. Økt mTORC2 aktivitet resulterer i aktivering av Rac1, som er kjent for å fremme cellespredning og migrasjon [25]. Disse resultatene foreslår at aktivert mTORC2 kan utgjøre en kritisk og kan målrettes signale element i blærekreft invasjon.
mTORC2 representerer en av to signalerings armer av mTOR kaskade. mTORC2 eksisterer som et kompleks som omfatter mTOR og mLST8 og skiller seg fra den mTORC1 ved tilstedeværelse av rictor, protor og mSIN1 [26]. I motsetning til den mTORC1 kompleks som regulerer translasjon i respons til næringsstatus og vekstfaktorer, styrer mTORC2 prosesser som krever cytoskeletal re-modellering, for eksempel celle spredning og migrering. mTORC2 kan aktiveres av insulinstimulert PI3K, som fremmer tilknytning av mTORC2 med ribosomer [27,28]. Cyklisk adenosinmonofosfat (cAMP) og glykogen-syntase-kinase-hemmer 3β mTORC2 aktivering [16,29].
Når den er aktivert, fosforylerer mTORC2 Ser473 i AKT, som har blitt foreslått å regulere AKT-aktivitet og stabilitet [30]. Rho familie GTPases rapporteres å fungere som viktige nedstrøms effektorer av mTORC2 [10,12,17,31]. Nøytrofilmigrasjon mot chemoattractants reguleres av mTORC2 ved en mekanisme som innebærer MyoII og regulering av RhoA aktivitet [32]. I tykktarm kreft celler, induserer rictor gen-Silencing mesenchymale-epitel overgang (MET) og hemmer cellemotilitet av effekter på både RhoA og Rac1 [10]. Mens redusert E-cadherin har blitt rapportert i de ondartede cellelinjer UMUC-3, J82 og T24 cellelinjer i forhold til RT4 celler [6], knockdown av rictor i vår modell system synes ikke å reversere denne fenotype (data ikke vist).
I våre forsøk med J82 blære kreftceller, rictor gen-tie vesentlig redusert Rac1 aktivering samtidig ha en mer beskjeden effekt på RhoA. I mange cellesystemer, finnes veier å regulere Rac1 og RhoA gjensidig [33]. Således kan selv en beskjeden reduksjon i RhoA aktivering i forbindelse med rictor gen-stanse ha betydning i blærekreftceller. De merkede effekter av rictor lyddemping på celle spredning, migrasjon og invasjon er i samsvar med våre biokjemiske resultater som tyder på at Rac1 er store målet for mTORC2 i blærekreft. En påminnelse er at rictor downdown reduserer også p-Ser473, som kan gi ytterligere nedstrøms endringer i AKT signale som kan påvirke invasjon uavhengig av Rho GTPase aktivitet.
Når man sammenligner mTORC2 aktivering i blærekreft cellelinjer, fant vi at UMUC-3-celler var unik ved at påvisbar p-Ser473 er til stede selv i fravær av serum. Økningen i basalnivået av p-Ser473 i UMUC-3-celler gjenspeiler mest sannsynlig den homozygote delesjon av null
PTEN
i disse cellene [9,34], noe som eliminerer en viktig suppressor av mTOR signalering. UMUC-3 celler kan representere en modell for blære kreft celler som
PTEN
er mutert. Kreftformer med
PTEN
delesjon eller mutasjon ofte er motstandsdyktig mot bestemte anticancermidler som virker på oppstrømsiden av PTEN slik som de mot epidermal vekstfaktor-reseptor [35]. De T24 og J82-celler kan være foretrukket modeller for blærekreft som oppstår i fravær av
PTEN
mutasjon. Disse celler viste i det vesentlige ikke-detekterbare nivåer av P-Ser473 i fravær av serum og sterk stimulering av mTORC2 aktivitet når serum ble tilsatt.
Involvering av Rac1 som en viktig nedstrøms mål av mTORC2 i reguleringen av blærekreft invasjon kan koble en rekke nyere funn i litteraturen. En studie viste at Rac1 regulerer blærekreft celle invasjon og aktin omorganisering nedstrøms intebundet kinase (ILK) [36]. En annen gruppe har rapportert at rictor kan fysisk samhandle med ILK [37] for å indusere fosforylering av AKT på Ser473, som representerer en mTORC2 spesifikk signatur. Rac1 har blitt rapportert å direkte samhandle med mTOR i en GTP-uavhengig måte [38].
I konklusjonen, våre studier viser at mTORC2 er en kritisk regulator av blærekreft migrasjon og invasjon, med effekter formidlet primært gjennom Rac1.
