Abstract
microRNAs (mirnas) er en klasse av små ikke-kodende RNA-molekyler som spiller viktige roller i kreftutvikling og tumorprogresjon. I denne studien undersøkte vi roller og mekanismer for MIR-140 i menneskets ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Vi fant ut at MIR-140 er betydelig nedregulert i NSCLC vev og cellelinjer. Både gevinst-of-funksjon og tap-av-funksjon studier viste at MIR-140 undertrykker NSCLC celleproliferasjon, migrasjon og invasjon in vitro. Viktigere, overekspresjon av MIR-140 effektivt undertrykt tumorvekst og metastasering i nakne musemodeller. Integrert analyse identifisert IGF1R som en direkte og funksjonell målet på MIR-140. Knockdown av IGF1R hemmet celledeling og invasjon som minner om MIR-140 overekspresjon, mens overekspresjon av IGF1R svekket funksjon av MIR-140 i NSCLC celler. Sammen våre resultater markere betydningen av MIR-140 og IGF1R i utvikling og progresjon av NSCLC
Citation. Yuan Y, Shen Y, Xue L, Fan H (2013) MIR-140 Undertrykker tumorvekst og metastasering av ikke-småcellet lungekreft etter Targeting Insulin-like Growth Factor 1 Receptor. PLoS ONE 8 (9): e73604. doi: 10,1371 /journal.pone.0073604
Redaktør: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, USA
mottatt: May 26, 2013; Godkjent: 24 juli 2013; Publisert: 10.09.2013
Copyright: © 2013 Yuan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den fremste årsaken til kreft. relaterte dødsfall på verdensbasis, og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for minst 80% av alle lungekreft tilfeller [1,2]. Til tross for nylige fremskritt i diagnostikk og behandling av denne kreftformen, forblir den globale dødeligheten av NSCLC høy, og 5-års total overlevelsesrate forbundet med NSCLC er et dystert 11% [3]. Gitt dette, er en god forståelse av de molekylære mekanismene som ligger til grunn NSCLC utvikling og progresjon presserende behov.
microRNAs (mirnas) er en klasse av små ikke-kodende RNA-molekyler som negativt regulerer uttrykket av målgener ved enten mRNA degradering eller translasjonell inhibering [4]. mirnas kan regulere ekspresjonen av et bredt utvalg av målgener; Derfor er de involvert i et bredt spekter av biologiske prosesser, inkludert celle proliferasjon, apoptose, differensiering og migrering [5-7]. Nylig, montering bevis indikerer at unormal ekspresjon av mirnas korrelerer med en rekke kreftformer, og at mirnas kan fungere som onkogener og tumor suppressorer [8,9]. I lungekreft, flere mirnas, som la-7 familie, MIR-200, har MIR-486 og MIR-146a blitt identifisert som kreftdempere [10-14]; på den annen side, MIR-31, ble MIR-212 og MIR-196a funnet å fremme NSCLC kreft [15-17].
MIR-140 har fått mye oppmerksomhet fordi det er involvert i utvikling og progresjon av forskjellige typer kreft, inkludert brystkreft, osteosarkom, tykktarmskreft og leverkreft [18-20]. Disse funnene tyder på at Mir-140 fungerer som en tumor-suppressor rolle i disse kreftformene; Men til vår kunnskap, sine roller og potensielle mekanismer i NSCLC er fortsatt uklart. I denne studien, gir vi den første bevis for en rolle MIR-140 i NSCLC tumorigenesis og progresjon, og delvis belyser den molekylære mekanismen bak denne effekten. Vi fant ut at MIR-140 er nedregulert i NSCLC vev og cellelinjer. Overekspresjon av MIR-140 hemmet tumorvekst, invasjon og metastasering av NSCLC celler. Videre identifiserte vi IGF1R som et målgen av MIR-140 og bekreftet at MIR-140 utøver sin virkning på hemming av tumorvekst og metastase ved downregulating IGF1R. Våre funn viser en ny rolle MIR-140 som en tumor suppressor i NSCLC.
Materialer og metoder
Pasientprøver og cellelinjer
Menneskelig NSCLCs og deres matchet normalt vev (minst 5 cm fra primærtumor) ble oppnådd fra 30 pasienter på Zhongshan Hospital, Fudan University (Shanghai, Kina). Vevene ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C til RNA-ekstraksjon. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient og denne studien ble godkjent av Medical Ethics and Human Clinical Trial Utvalget ved Zhongshan Hospital. Fem NSCLC cellelinjer (A549, SK-MES-1, H157, H520 og H460) og en normal lunge bronkie epitelcellelinje BEAS-2B ble kjøpt fra American Type Culture Collection og dyrket i DMEM (Thermo Scientific HyClone, Beijing, Kina) supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin, og 100 mg /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Alle celler ble inkubert i 5% CO
2 fuktig atmosfære ved 37 ° C.
RNA isolering og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR)
RNA ble ekstrahert fra vev og cellelinjer ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Uttrykket av modne miRNAs ble analysert ved bruk av TaqMan mikroRNA Analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). En to-trinns QRT-PCR ble ansatt med spesifikke primere for MIR-140 er utviklet av Applied Biosystems. U6 snRNA ble amplifisert som en intern kontroll. QRT-PCR-analyser for
IGF1R Hotell og
p-aktin
ble utført ved hjelp av SYBR Premiks Ex Taq (Takara Bio, Dalian, Kina). Primerne som ble brukt var som følger: IGF1R forover-primer, 5′-GAGAAGGAGGAGGCTGAATACCG-3 «; IGF1R revers primer, 5»-GTGATGTTGTAGGTGTCTGCGGC-3 «; β-aktin forover-primer, 5»-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3 «; og β-aktin revers primer, 5»-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3 «. Real-time PCR ble utført ved hjelp av ABI 7900 real-time PCR maskin. Den relative uttrykk for hvert gen ble beregnet og normalisert ved hjelp av to
-ΔΔCt metode i forhold til U6 snRNA eller β-aktin.
lentivirusinfeksjon og oligonukleotid transfeksjon
Mir-140 forløper og IGF1R siRNA ble kjøpt fra Origene (Rockville, Maryland, USA). Den pre-MIR-140 sekvens og IGF1R siRNA sekvens ble klonet inn pCDH-CMV-MCS-EF1-coGFP konstruksjoner (System biovitenskap, California, USA). Produksjon og rensing av lentivirus ble utført som tidligere beskrevet [21]. Målceller (1 x 10
6) ble infisert med 1 x 10
7 lentivirus overførende enheter i nærvær av 10 ug /ml polybrene (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Tom lentiviral vektor ble anvendt som en kontroll. Mir-140 hemmer og negativ kontroll ble oppnådd fra Genepharma (Shanghai, Kina). Oligonukleotid transfeksjon ble utført ved anvendelse av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Celler ble samlet inn 48 timer etter transfeksjon.
Plasmid konstruksjon og luciferaserapportørplasmid analyser
Den kodende sekvens av IGF1R ble kjøpt fra Origene og klonet inn pcDNA3.1 (+) for å generere IGF1R ekspresjonsvektorer. Villtype IGF1R 3 «UTR (WT) ble amplifisert med de følgende primere: 5′-ATACTCGAGTTTCCATGCAACCTCCTTCTGC-3′ (fremover) og 5»-AGCAAGCTTTCCATCTTCCAAGGAGGAGGCT-3 «(revers). Endonukleaserestriksjon områder (
Xho
I /
Hin
dill) ble innlemmet i primere til rette for ligering inn i pGL3 Basic Vector (Promega, Madison, WI, USA). Seterettet mutagenese av MIR-140 frø sekvens i IGF1R 3′-UTR (Mut) ble utført ved hjelp av QuikChange ™ seterettet mutagenese Kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA). For luciferase-analyser, ble reporter plasmid kotransfektert med en styre Renilla luciferase-vektoren inn i A549 og H157-celler i nærvær av enten MIR-140 eller MIR-kontroll. Etter 48 timer ble cellene høstet og luciferase-aktiviteten ble målt ved anvendelse av dobbel-luciferase reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA).
celleproliferasjon, cellesyklus, og celle apoptose analyser
Celler (2 x 10
3) ble sådd ut i 96-brønners plater i 100 ul kulturmedium og dyrket. Spredning av cellene ble analysert på angitte tidspunkter ved hjelp av en CCK-8 kit (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. For cellesyklusanalyse, ble infiserte eller transfekterte cellene fiksert i 75% etanol og farget med 50 ug /ml propidiumjodid (PI). Cellesyklusfordelingen ble analysert på en FACScan flyt-cytometer (BD Biosciences, Bedford, MD, USA). Cell apoptose analysene ble utført ved hjelp av en Annexin V-FITC /PI apoptose Detection Kit (BD Biosciences). 1 × 10
4 celler ble farget i henhold til produsentens protokoll og deretter analysert med en flowcytometri (BD Biosciences) utstyrt med en Cellquest programvare (BD Biosciences).
sårtilheling og invasjon analyser
Cell migrasjon ble vurdert ved sårtilheling analyser. Celler ble sådd ut i seks-brønns plater og dyrket til 100% konfluens. Sår ble generert i cellen monolayer med en plast pipette. Cellene ble deretter skylt med PBS og dyrket i ytterligere 48 timer. Spredningen av sårheling ble observert og fotografert under et mikroskop. For invasjon analyser, 1 × 10
5 celler i serumfritt medium ble lagt inn i det øvre kammeret i et innstikk-belagt med Matrigel (BD Biovitenskap). Det nedre kammer ble fylt med DMEM med 10% føtalt bovint serum. Etter 48 timers inkubering ble cellene igjen på den øvre overflate av membranen fjernet, mens cellene som hadde invadert gjennom membranen ble farget med 20% metanol og 0,2% krystall fiolett, avbildes, og tellet under et mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).
ble utført Western blotting
Western blotting-analyse som beskrevet tidligere [22]. Kort, proteiner ble ekstrahert med RIPA buffer supplert med proteasehemmere og kvantifisert ved BCA-metoden (Beyotime, Jiangsu, Kina). Lysatene (25 ug) ble separert på SDS-PAGE og deretter elektrooverført til nitrocellulosemembraner (Whatman, Maidstone, UK). Membranene ble blokkert i 2 timer ved romtemperatur med 5% fettfri tørrmelk-løsning og deretter immunoblottet over natten ved 4 ° C med primære antistoffer mot IGF1R og β-aktin (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA). Etter vasking ble membranene probet med HRP-konjugerte sekundære antistoffer. Signaler ble visualisert med Enhanced Chemiluminescence Plus Kit (GE Healthcare).
Dyreforsøk
Alle dyreforsøk ble godkjent av etisk komité for dyreforsøk ved University of Fudan Animal Care Committee, Shanghai, Kina. For tumorvekstmålinger, A549-celler infisert med enten MIR-140-overekspresjon lentivirus eller styre lentivirus ble injisert subkutant inn i høyre scapulas av nakne mus (5 uker gamle BALB /c-nu /nu, 5 pr gruppe, 1.5 × 10
6 celler for hver mus). Musene ble observert over 5 uker for tumordannelse. Svulsten volum (V) ble overvåket ukentlig og beregnes med formelen: V = 0,5 × lengde × bredde
2. For in vivo-analyser metastasering, ble 1,5 x 10
6 A549-MIR-140 eller A549-MIR-kontrollceller injisert inn i halevenen til nakne mus (fem pr gruppe). Etter 6 uker, ble musene drept, og lungemetastatisk kolonisering ble overvåket og kvantifisert.
Statistisk analyse
Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra minst tre uavhengige forsøk. Forskjellen mellom gruppene ble analysert ved hjelp av Student
t
-test når man sammenligner kun to grupper eller en-veis analyse av varians når man sammenligner flere enn to grupper. Korrelasjonen mellom MIR-140 og IGF1R uttrykk ble evaluert med Spearmans korrelasjonsanalyse.
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Uttrykk av MIR-140 er redusert hos NSCLC vev og cellelinjer
For å studere uttrykk og betydning av MIR-140 i NSCLC kreftutvikling, målte vi uttrykk for MIR-140 i 30 par med NSCLC vev og deres matchede normale lunge vev ved hjelp av kvantitativ revers transkriptase PCR (QRT-PCR). Resultatene viste at MIR-140-ekspresjon ble betydelig redusert i NSCLC-vev sammenlignet med deres matchede normale vev (Figur 1a). I tillegg ble ekspresjon av MIR-140 i fem NSCLC-cellelinjer bestemt. Som vist i figur 1B, ble de relative ekspresjonsnivåer for MIR-140 i disse NSCLC-cellene betydelig redusert sammenlignet med den for den normale cellelinje BEAS-2B. Videre ble sammenhengen mellom Mir-140 uttrykk nivåer og clinicopathologic parametere analysert. Den statistiske analysen viste at nedregulering av MIR-140 ble signifikant korrelert med tumorstadium og metastase, mens ingen signifikant korrelasjon ble observert i andre parametere (tabell 1). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at nedregulering av MIR-140 kan spille viktige roller i NSCLC kreftutvikling og progresjon.
(A) uttrykket nivåer av MIR-140 i 30 par med NSCLC vev og deres matchet normal lunge vev ble målt ved QRT-PCR. U6 snRNA ble anvendt som en intern kontroll. (B) uttrykket nivåer av MIR-140 i normal lunge epitelcellelinje (BEAS-2B) og 5-småcellet lungekreft cellelinjer (A549: adenocarcinoma cellelinje; H157, SK-MES1, H520: squamous kreftcellelinjer, H460: storcellet kreft cellelinje). *
P
0,05, **
P
. 0,01
Antall
Median uttrykk
Characteristicof casesof speil 140
P
Age (years)≥60180.4214±0.04680.4336 60120.3751±0.0291SexMale210.3972±0.04810.5377Female90.4226±0.0352Smoking statusNo80.4219±0.03930.1834Yes220.3723±0.0436HistologyAC160.3854±0.05020.3670SCC140.3578±0.0440StageI70.5539±0.03570.0059II130.3737±0.0406III100.3005±0.0251MetastasisNo130.4932±0.04560.0008Yes170.3104±0.0413Table 1. Forholdet mellom MIR-140 uttrykk og clinicopathologic parametre i NSCLC.
CSV ned CSV
MIR-140 hemmer NSCLC celledeling in vitro
For å bedre forstå rollen av MIR-140 i utvikling av NSCLC, vi først bygget en lentiviral vektor uttrykker Mir-140 og etablerte stabile cellelinjer, betegnet som A549-MIR-140 og H157-MIR-140 etter lentivirus infeksjon. Vellykket overekspresjon av modne MIR-140 i disse cellene ble bekreftet ved QRT-PCR (figur 2A). Som vist i figur 2B, overekspresjon av MIR-140 undertrykte betydelig celleproliferasjon av A549 og H157-celler sammenlignet med deres tilsvarende kontroller. MIR-140 overekspresjon ble også funnet å indusere celle apoptose i A549 og H157 celler (Figur 2C). I samsvar med disse resultatene, MIR-140 overekspresjon utløst en akkumulering av celler ved G1 fase, og redusert antall celler i S-fasen i begge cellelinjer (figur 2D). I motsetning til dette, knockdown av MIR-140 ved anvendelse av anti-MIR-140 i H520-celler fremmet cellevekst, mens ingen signifikant endring i cellesyklus og celle apoptose ble påvist (figur S1). Samlet utgjør disse resultatene viser at MIR-140 er i stand til å regulere NSCLC cellevekst.
(A) A549 og H157 celler ble infisert med MIR-140 eller MIR-kontroll lentivirus, og uttrykk for MIR-140 ble analysert ved QRT-PCR. (B) cellenes levedyktighet assay (CCK-8). (C) celle apoptose analyser. (D) cellesyklusanalyse. *
P
0,05, **
P
. 0,01
MIR-140 undertrykker NSCLC celle migrasjon og invasjon in vitro
Vi videre undersøkt om MIR-140 kan også hemme celle migrasjon og invasjon i NSCLC. Bruke sårtilheling analysen, fant vi at overekspresjon av MIR-140 dramatisk undertrykte tumorcelle mobilitet i A549 og H157 celler sammenlignet med tilhørende kontroller (figur 3A). Tilsvarende Transwell-forsøk med Matrigel viste at MIR-140 markert redusert invasiv kapasitet til A549 og H157-celler (Figur 3B). I kontrast, ble såret helbredelse og invasjon av H520 celler øker når endogent MIR-140 ble stille med anti-MIR-140 (figur S1). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at Mir-140 kan undertrykke NSCLC celle migrasjon og invasjon in vitro.
sårheling analyser (A) og invasjons analyser (B) av A549 og H157 celler infisert med MIR-140 eller MIR-kontroll lentivirus. Invasjonen analysene ble bestemt ved bruk av Transwell analyser med Matrigel. Forstørrelse: 100 ×. **
P
. 0,01
MIR-140 hemmer tumorvekst og metastase hos NSCLC-celler i nakne mus
For ytterligere å bestemme effekten av speil 140 på NSCLC tumorvekst og metastaser in vivo, ble A549-MIR-140-celler og A549-MIR-kontrollceller inokulert subkutant i flanken på nakne mus, og dyrene ble nøye overvåket for tumorvekst i 5 uker. Resultatene er vist som MIR-140-tumorer som overuttrykker var betydelig mindre i størrelse og tumorvolum sammenlignet med kontrolltumorer (figur 4A og B). Videre undersøkte vi effekten av MIR-140 overekspresjon på NSCLC metastaser in vivo. A549-MIR-140 celler og A549-MIR-kontrollceller ble injisert inn i nakne mus ved halevenen injeksjoner. Musene ble avlivet 6 uker etter injeksjon, og deres lunger ble skåret ut for å observere metastatisk Nidi på overflaten av dem. Som vist på figur 4C, ble antallet lungemetastase knuter dramatisk redusert i A549-MIR-140 gruppen sammenlignet med A549-MIR-kontrollgruppe. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at MIR-140 overekspresjon kan undertrykke tumorigenesis og metastasering av NSCLC celler in vivo.
(A) fotografering av svulster dannes. (B) vekstkurve tegnes ved å måle tumorvolumer på de angitte dager. (C) representant H E-farget deler av lunge vev isolert fra mus (100 ×). De totale antallet metastatiske lesjoner i lungene ble talt. **
P
. 0,01
MIR-140 nedregulerer IGF1R ved direkte rettet mot sin 3 «UTR
For å belyse de molekylære mekanismer som MIR-140 utfører sin funksjon, søkte vi etter potensielle mål av MIR-140 ved hjelp av ulike beregningsmetoder, som for eksempel TargetScan og Miranda. Spesielt har vi fokusert på onkogener. IGF1R ble identifisert som en kandidat mål av MIR-140, fordi den komplementære sekvens av MIR-140 ble identifisert i sin 3 «UTR av TargetScan analyse (figur 5A). Vi fant at den gjennomsnittlige ekspresjonsnivået av IGF1R var signifikant høyere i NSCLC-vev enn i passet normale vev (Figur S2). I tillegg ble det en statistisk signifikant invers korrelasjon observert av Spearmans korrelasjonsanalyse mellom uttrykk nivåer av MIR-140 og IGF1R mRNA (figur 5B). Videre QRT-PCR og Western blotting-analyse viste at overekspresjon av MIR-140 vesentlig redusert uttrykk for IGF1R i A549 og H157 celler, og at knockdown av MIR-140 økt IGF1R uttrykk i H520 celler (figur 5C og D). For å validere om IGF1R er den direkte nedstrøms målet på MIR-140, ble et fragment av IGF1R 3 «UTR inneholder den antatte MIR-140 bindingssetet klonet inn en luciferase reporter vektor. Luciferase reporter-analyser viste at oppregulering av MIR-140 reduserte signifikant den relative luciferaseaktiviteten av IGF1R-3’UTR i A549 og H157-celler, men hadde ingen virkning på den mutante av IGF1R-3’UTR (figur 5E). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at Mir-140 nedregulerer IGF1R uttrykk ved direkte rettet mot sin 3 «UTR.
(A) antatte bindende sekvenser av MIR-140 i IGF1R 3′ UTR. Mutasjonen ble generert i IGF1R 3 «UTR av mutere 3 nt som er anerkjent av MIR-140. Enten villtype (WT) og mutant (Mut) IGF1R 3 «UTR ble subklonet inn i nevnte dobbeltport-luciferase reporter vektor. (B) en statistisk invers korrelasjon mellom MIR-140 og IGF1R mRNA nivåer i NSCLC vev av Spearmans korrelasjonsanalyse. (C, D) ekspresjon av IGF1R i A549, H157 og H520-celler etter infeksjon eller transfeksjon ble målt ved QRT-PCR og Western blotting. (E) Luciferase-analyse i A549 og H157-celler ko-transfektert med MIR-140 og et luciferase reporter inneholdende IGF1R 3»-UTR (WT) eller en mutant (Mut). Luciferasepreparater aktiviteter ble målt 48 timer etter transfeksjon. **
P
. 0,01
IGF1R er involvert i MIR-140-indusert undertrykkelse av NSCLC cellevekst og invasjon
For ytterligere å undersøke om speil 140 utøver sin tumor suppressor funksjon gjennom nedregulering av IGF1R, utførte vi gain-of-funksjon og tap-av-funksjonsanalyser. For det første, ble A549-celler infisert med lentivirale konstrukter inneholdende IGF1R siRNA eller den negative kontroll. Western blotting-analyse bekreftet at ekspresjon av IGF1R ble undertrykket (figur 6A). Som forventet, IGF1R knockdown signifikant hemmet cellevekst, indusert G1 arrest, og økt apoptose i A549-celler (figur 6B, C og D). Videre Transwell-analyser indikerte at IGF1R nedregulering undertrykkes celle invasjon av A549-celler (Figur 6E). Disse resultatene var tilsvarende virkningene av MIR-140 overekspresjon. Deretter ble A549-MIR-140 celler transfektert med IGF1R plasmider som mangler 3 «UTR. Som vist på figur 6B, C og D, overekspresjon av IGF1R vesentlig reddet MIR-140-indusert hemming av cellevekst, cellesyklus og apoptose. Den hemmende effekten av MIR-140 på celle invasjon ble også motvirket av IGF1R overekspresjon (figur 6E). Samlet utgjør disse dataene viser at IGF1R er en funksjonell mål av MIR-140.
A549 celler ble infisert med bestemt si IGF1R, eller transfektert med IGF1R plasmid mangler 3 «UTR sammen med MIR-140. (A) Western blotting-analyse. (B) cellenes levedyktighet assay (CCK-8). (C) cellesyklusanalyse. (D) celle apoptose analyser. (E) Transwell invasjons analyser. *
P
0,05, **
P
. 0,01
Diskusjoner
mirnas har blitt rapportert å spille viktige roller i kreftutvikling og tumorprogresjon [23,24]. Endringer i ekspresjon mirnas er innblandet i nesten alle aspekter av kreft biologi, inkludert cellevekst, apoptose, migrasjon og /eller invasjon, og de kan fungere enten som tumor-suppressorer eller onkogener [25]. I denne studien har vi fokusert på MIR-140, som har blitt antydet som en mulig svulst suppressor i menneskelige malignances. Song et al. viste at overekspresjon av MIR-140 hemmet celleproliferasjon i både osteosarkom og tykktarmskreft cellelinjer [19]. Mer nylig, Yang og medarbeidere rapporterte at MIR-140-5p er betydelig redusert i HCC vev og cellelinjer, og dets overekspresjon undertrykker tumorvekst og metastase ved å målrette transformerende vekstfaktor-reseptor β 1 og fibroblast vekstfaktor 9 [20]. Til dags dato, men rollen som MIR-140 i NSCLC kreftutvikling og de molekylære mekanismer som MIR-140 utøver sine funksjoner forblir uklart.
I denne studien, viste vi at Mir-140 uttrykk ble betydelig redusert i NSCLC vev og cellelinjer. Overekspresjon av MIR-140 kan effektivt hindre NSCLC celleproliferasjon, indusere cellesyklus arrest, forbedre apoptose, og undertrykke tumorvekst i nakne mus. Videre MIR-140 overekspresjon betydelig undertrykt cellemotilitet og invasjon in vitro og tumor metastaser in vivo. Følgelig knockdown av MIR-140 forfremmet celleproliferasjon og invasjon. Disse resultatene tyder på at Mir-140 kan være en roman tumor-suppressor miRNA i NSCLC.
For å belyse de underliggende mekanismene som er involvert i MIR-140-indusert hemming på NSCLC vekst og metastasering, vi brukt ulike prediksjon algoritmer for å forutsi genet mål for MIR-140. Insulin-lignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF1R) onkogen, som ofte overuttrykt i mange ondartede sykdommer og fungerer som en viktig regulator av cellevekst, overlevelse, og metastase [26-29], ble identifisert som en kritisk nedstrøms mål for mir -140, og denne konklusjonen understøttes av følgende bevis: (A) komplementære sekvens av MIR-140 er identifisert i den 3 «UTR av IGF1R mRNA; (B) overekspresjon av MIR-140 betydelig redusert IGF1R nivåer hos NSCLC celler, mens knockdown av MIR-140 enhancedIGF1R uttrykk; (C) MIR-140 overekspresjon reduserte aktiviteten av et luciferase reporter inneholdende villtype-3 «UTR av IGF1R mRNA; (D) hemmende effekter av MIR-140 på NSCLC celleproliferasjon, apoptose, og invasjonen ble reversert av overekspresjon av IGF1R; (F) IGF1R ble oppregulert i NSCLC vev og omvendt korrelert med uttrykket nivåer av MIR-140. Sammen utgjør disse dataene sterkt at MIR-140 hemmer NSCLC vekst og metastasering gjennom downregulating IGF1R.
I konklusjonen, denne studien viste at MIR-140 er betydelig nedregulert i NSCLC vev og cellelinjer. Overekspresjon av MIR-140 hemmer tumorvekst og metastasering av NSCLC gjennom direkte rettet mot IGF1R. Våre data tyder på at det ofte nedregulert MIR-140 fører til økt uttrykk av IGF1R og i sin tur bidrar til utvikling og progresjon av NSCLC.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Konckdown av MIR-140 fremmer celle spredning, migrasjon og invasjon av H520 celler. (A) H520-celler ble transfektert med anti-MIR-140 eller anti-kontroll, og ekspresjon av MIR-140 ble analysert ved QRT-PCR. (B) cellenes levedyktighet assay (CCK-8). (C) celle apoptose analyser. (D) cellesyklusanalyse. (E) sårtilheling analyser. (F) Transwell invasjons analyser. *
P
0,05, **
P
0,01
doi:. 10,1371 /journal.pone.0073604.s001 plakater (TIF)
Figur S2 .
IGF1R er oppregulert i NSCLC vev. Uttrykket av IGF1R hos NSCLC vev og matchet normale lungevev ble målt ved QRT-PCR. **
P
0,01
doi:. 10,1371 /journal.pone.0073604.s002 plakater (TIF)
