Abstract
tyrosinkinaseinhibitorer så som erlotinib blir ofte brukt som et terapeutisk middel mot kreft på grunn av sin relativt lave bivirkningsprofil og, til tider, større effekt. Imidlertid er erlotinib motstand (ER) i ikke-småcellet lungekreft blir anerkjent som et stort problem. Derfor er forståelse mekanismen bak ER og utvikle effektive regimer nødvendig. Autofagi rolle i kreft har vært kontroversielt og er fortsatt uklart. I denne studien undersøkte vi effekten av lavdose erlotinib-cisplatin kombinasjon i erlotinib motstandsdyktig lunge adenokarsinom (ERPC9) celler og rolle autophagy i ER. ERPC9 celler ble etablert fra erlotinib sensitive PC9 celler. Passende behandlinger ble gjort over to dager og celleoverlevelse ble kvantifisert med Alamar blå analyse. LC3II og regulatoriske proteiner av autofagi ble målt ved western blot. Liten interfererende RNA (siRNA) ble anvendt for å inhibere translasjon av proteinet av interesse. I ERPC9 celler, kombinasjonsbehandlingen synergistisk indusert celledød og en betydelig reduksjon i autophagy. Ved baseline ERPC9 cellene hadde et signifikant høyere LC3II og lavere p-mTOR nivåer sammenlignet med PC9 celler. Tilsetningen av rapamycin øket motstand og 3-metyladenin lysfølsomt ERPC9 celler, noe som indikerer autophagy kan fungere som en beskyttende mekanisme. Videre undersøkelser viste at ERPC9 cellene næret høy utgangs Atg3 nivåer. Den høye basal Atg3 var målrettet og betydelig senket med kombinasjonsbehandling. siRNA transfeksjon av Atg3 resulterte i reversering av ER; 42,0% flere celler døde i erlotinib stående behandling med transfeksjon sammenlignet med ikke-transfektert ERPC9 celler. Vi avslører en ny rolle for Atg3 i markedsføringen av ER som hemming av Atg3 oversettelsen var i stand til å resultere i re-sensibilisering av ERPC9 celler som erlotinib stående behandling. Dessuten viser vi at kombinasjonen erlotinib-cisplatin er en effektiv behandling mot erlotinib motstandsdyktig kreft ved å målrette (ned-regulering) Atg3 mediert autofagi og induksjon av apoptotisk celledød
Citation. Lee JG, Wu R (2012) kombinasjon Erlotinib-Cisplatin og Atg3-mediert Autophagy i Erlotinib Resistant lungekreft. PLoS ONE 7 (10): e48532. doi: 10,1371 /journal.pone.0048532
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 8 mars 2012; Godkjent: 27 september 2012; Publisert: 31 oktober 2012
Copyright: © 2012 Lee, Wu. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Jasmine G . Lee ble finansiert delvis av National Institutes of Health (NIH) T32 HL07013. Dette prosjektet ble finansiert delvis av NIH tilskudd HL077902 og HL096373. Forfatterne rapporterer ingen økonomisk interessekonflikt om studien inkludert materialer eller metoder som brukes eller funnene som er angitt i denne artikkelen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er fortsatt den ledende årsak til kreft dødsfall og har en av de laveste overlevelse blant alle kreftformer, med en rapportert fem års overlevelse på 13% [1]. Lungekreft kan grovt kategoriseres i to hovedgrupper for prognostiske og behandlingsformål: småcellet lungekreft (SCLC) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Av alle lungekrefttilfellene, 85% er NSCLC [2] og er videre dele inn i tre grupper basert på deres histologiske kjennetegn: plateepitelkarsinom, stor celle karsinom, og adenokarsinom [2] – [4]. NSCLC tendens til å være mindre følsom overfor kjemoterapi enn SCLC, og selv med kirurgisk fjerning av tidlige stadium primærtumorer, opp til 50% av pasientene viser tilbakefall av deres primære cancere [4], [5]. På grunn av dette, er effektive kjemoterapiregimer som trengs og til tider, er systemisk kjemoterapi det eneste alternativet for lokalavansert svulster og /eller metastatisk sykdom.
Platinum basert kjemoterapeutika som
Cis
-diamminedichloroplatinum (II) (cisplatin) har tradisjonelt de viktigste agentene som brukes til å behandle NSCLC og har vist seg å forbedre pasientens overlevelse [6]. Men bærer cisplatin betydelige toksiske bivirkninger, spesielt ved høye doser, for eksempel: kvalme, oppkast, nyresvikt, ototoksisitet og nevrotoksisitet på grunn av sin ikke-spesifikke cytotoksiske effekter på både kreft og normale celler [7], [8].
i den senere tid er det en pågående interesse for forskning, utvikling og produksjon av kreftlegemidler som er rettet mot spesifikke patologiske trasé, slik at slike midler til å ha mindre giftige profiler og lavere risiko for bivirkninger. En slik Food and Drug Administration (FDA) godkjente middel som brukes i lunge adenokarsinom er erlotinib. Erlotinib er en tyrosinkinaseinhibitor (TKI) som hemmer den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) ved kompetitiv hemming av ATP-bindingssetet i tyrosin kinase domene [9], og deretter redusere nedstrøms proliferative signalveier [10]. EGFR er altfor uttrykt i mange kreftformer, inkludert 40-80% av NSCLC [11], [12]. Mutasjoner assosiert med EGFR, som mutasjoner som fører til overekspresjon av EGFR, betraktes som kritisk mekanisme for tumordannelse som EGFR er involvert i mange regulatoriske vekstprosesser som proliferasjon, apoptose, adhesjon, invasjon, og migrasjon [2], [10], [13 ]. Erlotinib har vist seg å være en effektiv behandling for NSCLC husing EGFR mutasjoner [14]. Men om 10 til 14 måneder etter behandlingsstart, noen lungekreft utvikle erlotinib motstand (ER) som fører til tilbakefall [15], [16]. Det er gjort få studier på de mekanismer og involverte veier av ervervet resistens mot TKI, men dette emnet er fremdeles kontroversiell og relativt uklart beret ytterligere klarlegging av de mulige molekylære mekanismer for motstand [17].
Autophagy har vært klassisk forstås å være en mekanisme for celleprotein homeostase og degradering av skadde cellulære komponenter og /eller organeller [18], [19]. Dens rolle er avgjørende som svekket autofagi er knyttet til ulike menneskelige sykdommer, inkludert kreft [19], [20]. Autophagy er også blitt beskrevet å virke som en «andre» bane av programmert celledød (apoptose den andre er) og omvendt en beskyttende mekanisme for celleintegritet [20], [21]. Men dens rolle i kreft og kreft motstand er fortsatt uklart: gjør autofagi fungere som en mekanisme for å fremme kreft motstand eller fremme kreft celledød [22], [23]? Derfor, bestemmelse og forstå rollen av autophagy i ER er viktig.
For å forbedre behandlingen av NSCLC, er det viktig å forstå den molekylære mekanismen som ligger til grunn ER og finne regimer som er effektive i behandling av erlotinib resistente kreftformer . Således, i denne studien undersøkte vi effekten av lavdose erlotinib-cisplatin kombinasjonsbehandling i erlotinib motstandsdyktig lunge adenokarsinom og bestemme rollen til autophagy i ER. Vi har også identifisere en nøkkel regulatorisk protein i autofagi vei som er i stand til å modulere ER.
Materialer og metoder
Cellelinjer og cellekultur
En erlotinib sensitive PC9 cellelinje , en human lunge adenokarsinom med overekspresjon av EGFR, var vennlig begavet fra Dr. Halmos (Columbia University) [24]. Det ble opprettholdt i RPMI 1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) med Antibiotikum-Anti-fungal (Invitrogen, Carlsbad, CA). Den ERPC9 cellelinjen ble etablert ved å dyrke PC9 celler i 5% FBS kultur medier som inneholder erlotinib. Celler ble først holdt på en erlotinib konsentrasjon på 33 nM (IC50), og dosen ble gradvis økt over en periode på 12 uker, inntil sluttkonsentrasjonen av erlotinib var 10 pM. Deretter, ved bruk av enkelt-celle-kloningsteknikker hvor bare aktivt delende celler ble valgt (som indikerer resistens), ble ERPC9 celler etablert. Deretter ble ERPC9-celler opprettholdt i 10% FBS i RPMI 1640 inneholdende slutt etablert erlotinib konsentrasjon på 10 uM.
* Cellelevedyktigheten ble kvantifisert ved bruk av Alamar blå-analysen. Kontrollgruppen fungerte som standard for cellenes levedyktighet og celledød. (A) I ERPC9 celler, kombinasjonsbehandlingen indusert betydelig mer celledød enn enkeltmedikamentelle behandlinger (p 0,0001). Erlotinib stående resulterte i 96,6% overlevelse, cisplatin 89,3%, og kombinasjonen 61,1%; denne effekten var synergis (CI 0,12). (B) I foreldre PC9 celler, kombinasjonsbehandlingen indusert betydelig mer celledød enn enkeltmedikamentelle behandlinger (p 0,0001) erlotinib stående resulterte i 79,6% overlevelse, cisplatin 76,1%, og kombinasjonen 49,6%; denne effekten var synergis (CI på 0,45). (C) I NHBE celler, erlotinib alene, cisplatin alene, og kombinasjonsbehandling viste minimal celledød eller endring i levedyktigheten blant de fire gruppene (p = 0,958) indikerer minimal toksisitet med kombinasjonsbehandling.
Normal menneskelige bronkial epitelvev ble hentet fra National Disease Forskning Interchange (Philadelphia, Pennsylvania) [25] – [27]. Vev ble ikke samlet inn fra pasienter diagnostisert med lungerelaterte sykdommer. Protease-dissosiert bronkiale epitelceller ble sådd ut på Transwell kamre (Corning, 24 mm) på 5 × 10
4 celler /cm
2 i bronkial epithelial vekst medium (Lonza). Etter 4-7 dager i en neddykket kultur tilstand eller når kulturene nådde konfluens, ble cellene overført til en luft-væske-grenseflate (ALI) kultur tilstand i et Hams F12 /DMEM (01:01) med tillegg av følgende åtte faktorer: transferrin (5 ug /ml), insulin (4 ug /ml), koleratoksin (20 ng /ml), epidermal vekstfaktor (10 ng /ml), dexametason (0,1 uM), bovin hypothalamus-ekstrakt (15 ug /ml) , BSA (0,5 mg /ml), og all
trans
-retinoic syre (30 nM), som mulig polarisering og mucociliary differensiering. NHBE celler ble dyrket i 7 dager etter overføring til ALI. Alle celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2.
* (A) Autophagy nivåer ble undersøkt ved western blot for LC3II og P62. (B) ERPC9-celler hadde signifikant høyere nivåer av LC3II enn i PC9 celler (p = 0,030), og signifikant lavere nivåer av p62 enn i PC9 celler (p 0,0001); indikerer høyere baseline autofagi nivåer i erlotinib motstandsceller. Concordantly, kan man se at det var betydelig lavere nivåer av LC3I i ERPC9 celler sammenlignet med PC9 celler (p = 0,008)
Narkotika:. IC50 verdier og behandlingsgruppene
Cisplatin , rapamycin og 3-metyladenin (3-MA) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA), og erlotinib ble kjøpt fra Selleck Chemicals (Huston, Texas, USA). 3-MA ble oppløst i vann, og alle andre medikamenter ble løst i dimetylsulfoksid (DMSO) for å danne lager konsentrasjoner av cisplatin 10 mM, erlotinib 10 uM, rapamycin 27,4 mM, og 3-MA 100 mM. 3-MA ble fremstilt friskt hver gang og andre stoffer ble opprettholdt ved -20 ° C og alt ble fortynnet til passende konsentrasjon før bruk. Lengden av behandlingen for alle forsøkene besto av to dager. Cellene ble først belagt og dyrket med 10% FBS i RPMI 1640 medium i 24 timer før oppstart av behandling for å tillate cellene å feste til platen. Den neste dag ble mediet byttet ut med 0.1% FBS i RPMI 1640 inneholdende hensiktsmessige medikamentkonsentrasjon i to dager. Ved bestemmelse av IC-verdier, ble 96-brønners plater som brukes og dose-reaksjoner ble utført ved bruk av sensitive PC9 celler ved behandling av celler i en seriell rekke medikamentkonsentrasjonene for hvert medikament (erlotinib eller cisplatin). Offisielle behandlingsgrupper bestod av en 2 x 2 faktoriell eksperimentell design [28]: kontroll (0,1% DMSO), erlotinib (10 nM), cisplatin (3 uM), og kombinasjonen av erlotinib og cisplatin (10 nM + 3 uM). Offisielle medikamentelle behandlinger ble utført i 6-brønns plater. Begge PC9 og ERPC9 cellelinjer gikk medikamentell behandling. Eksperimenter som krever bruk av rapamycin og 3-MA gjennomgikk den samme protokollen.
* autofagi nivåene ble målt gjennom western blot for LC3II. (A og C) I ERPC9-celler, var det en signifikant reduksjon i LC3II med kombinasjonsbehandling sammenlignet med andre gruppene (p = 0,011). Nedgangen i LC3II var synergistisk med kombinasjonsbehandling, speiling samme synergistisk trend for celledød. (B) Det var ingen signifikante forskjeller i LC3II nivåer i NHBE celler (p = 0,958). (D) Betydelig større LC3II (grønn) fluorescens ble observert i ERPC9 celler sammenlignet med PC9 celler (p 0,0001). I ERPC9 celler som gjennomgikk kombinasjonsbehandling, ble en signifikant reduksjon i grønn fluorescens observert, sammenlignet med alle andre grupper (P 0,0001). Grønn = LC3 og blå = DAPI.
celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble kvantifisert ved hjelp av Alamar blå analysen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Ved gjennomføringen av medikamentbehandling, ble den opprinnelige mediet erstattet med medium inneholdende 10% Alamar blå fargestoff og inkubert i 1 time i et 37 ° C fuktet inkubator med 5% CO2. Celleviabilitet og død ble deretter målt ved 530 nm eksitasjon bølgelengde og 590 nm emisjon ved hjelp Packard fluorocount. Forholdet mellom cellenes levedyktighet ble beregnet ved ligningen som følger: a. (Absorbans av behandlingsgruppe) /(absorbans av kontrollgruppen) x 100
* Rapamycin og 3-MA ble brukt for å vurdere rollen autofagi og sin tilknytning til erlotinib motstand. Passende grupper ble behandlet med enten (A) 10 nM av rapamycin eller (B) 5 uM av 3-MA med kombinasjonsmedikamentbehandling. I ERPC9 celler, øket celleoverlevelse 16,5% når rapamycin ble tilsatt til kombinasjonsbehandling (p = 0,004). Sammenlignet med 3-MA behandlede ERPC9-celler, var det en 10,5% reduksjon i celleoverlevelse i kombinasjon behandlingsgruppe og 9,1% reduksjon av 3-MA med kombinasjons-behandling (p = 0,032 og p = 0,037, respektivt). (C) Når 3-MA ble tilsatt som erlotinib-alene (p 0,0001) og cisplatin-alene (p 0,0001) behandling var det en 39,2% og 31,0% høyere celledød, respektivt, sammenlignet med behandling med enkeltmedikamentbehandling alene .
Western blot analyse
Celler ble lysert i iskald RIPA buffer (Millipore, Billerica, MA) som inneholder en kombinasjon av proteasehemmer og fosfatase hemmer cocktails (Sigma-Aldrich) . Lysated proteiner ble sentrifugert i 10 minutter ved 14000 rpm ved 4 ° C, og supernatantene ble kvantifisert for proteininnhold ved bruk av Bio-Rad Protein Assay Kit DC (Bio-Rad, Hercules, CA) og et spektrofotometer målt ved 650 nM. Proteiner ble deretter separert ved en 4~20% gradient SDS /PAGE-gel (Thermo Fisher Scientific, Newington, NH) og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Bio-Rad). Membranene ble blokkert med 5% ikke-fettholdig melk i Tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 0,05% Tween 20 (TBST) i 1 time ved romtemperatur (RT), og deretter probet med anti-p62 (1:1000, Millipore) , -LC3, -Beclin 1, -P-Akt, -Akt, p-mTOR, -mTOR, -Atg3, -Atg7, -Atg5-12 kompleks (1:1000, Cell signalering, Boston, MA), un-spaltet og -cleaved Caspase 3, un-spaltet og -cleaved PARP (1:500, Cell signalering), i 2,5% fettfri melk i TBST natten ved 4 ° C. Deretter ble membranene vasket i 30 minutter (x3) med TBST og ble probet med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (1:2000, cellesignalisering) i 2,5% ikke-fettholdig melk i TBST i 1 time ved RT. For å bestemme lik lasting og standardisere mengden av protein som er lagt, ble blottene deretter strippet og re-blottet med monoklonalt mus anti-β-aktin (Sigma-Aldrich) og forholdet mellom den båndintensitet (størrelse x tetthet) av interesse med dens tilhørende β-aktin ble tatt. Bånd ble avbildes med Fuji 4000 programvare eller via film.
* (A) Western blot p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, Beclin-en, Atg5-12, Atg7, og Atg3 vises . (B) Det var betydelig høyere Atg3 nivåer i ERPC9 celler sammenlignet med celler PC9 (p = 0,018) og (C) betydelig lavere p-mTOR nivå (p = 0,021) videre validere at Autophagy nivåene er høyere i ERPC9 celler.
Knock Down av Atg3 av siRNA Transfeksjon
Liten interfering RNA (siRNA) spesifikt rettet mot menneskelig Atg3 ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, USA). ERPC9 og PC9 celler ble sådd ut i 12 brønners plater (6 x 10
4 celler per brønn) og transfekteres med Atg3 siRNA i 24 timer i antibiotika fritt vekstmedium; ved hjelp av siRNA Lipofectamine RNAiMAX og OPTI-MEM I-redusert serum medium (Invitrogen). Prosedyrer ble utført etter produsentens protokoll.
* (A) p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, Beclin 1, Atg5-12, Atg7, og Atg3 ble målt gjennom western blot analyse. (B) Med erlotinib-cisplatin kombinasjonsbehandling, var det en betydelig endring bare i Atg3; Atg3 nivået ble betydelig redusert sammenlignet med alle andre grupper (p = 0,028). Dette tyder på at kombinasjonsbehandling kan målrette grunnlinjen overekspresjon av Atg3 i ERPC9 celler.
Immunocytochemistry
Celler ble vasket med PBS to ganger, og festes med 4% paraformaldehyde i PBS i 15 minutter ved RT. Cellene ble deretter ettervaskes to ganger med PBS, inkubert i PBS inneholdende 0,2% Trinol X i 5 minutter ved RT, og blokkert med blokkeringsbuffer (PBS med 3% BSA) i 5 minutter ved RT. Celler ble inkubert med primært antistoff, anti-LC3 (1:200, cellesignalisering) over natten i et 4 ° C mørkt rom, vaskes 3 ganger den neste dag, og inkubert med geite-anti-kanin-IgG Alexa Flour 488-antistoff (1:1000 , Invitrogen) i 1 time ved romtemperatur i et mørkt rom. Cellene ble deretter vasket med PBS og 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (Dapi, Vector Laboratories, Burlingame, CA) ble tilsatt for å farge kjernene. Zeiss LSM700 confocal (Carl Zeiss, Tyskland) ble brukt til å ta bilder, og alle bildene ble tatt på den samme innstillingen for å tillate konsistens. Bildeanalyse ble utført blindt.
* (A) Blokkering Atg3 oversettelse og autofagi med Atg3 siRNA transfeksjon i ERPC9 celler ble bekreftet av western blot analyse. (B) Når ERPC9-celler ble transfektert med Atg3 siRNA, cellene ble betydelig mer følsom for erlotinib (p = 0,043) og kombinasjonen (p = 0,002) medikamentell behandling sammenlignet med ERPC9 celler med ikke-spesifikk siRNA transfeksjon. Det var ingen signifikant forskjell i cisplatinbehandlede prøvene imidlertid (p = 0,924). (C) Atg3 siRNA transfeksjon var i stand til å produsere en betydelig økning i følsomhet overfor enkelt medikamentell behandling i foreldre PC9 cellelinjen også.
Farmakologisk and Statistical Analysis
Statistisk analyse og bestemmelse av signifikante forskjeller mellom grupper ble utført ved å anvende to-halet t-test og analyse av varians (ANOVA) når det passer. Alle statistiske analyser ble utført ved bruk av prismet programvare (La Jolla, CA). En p-verdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant i denne studien. Alle forsøkene ble utført minst tre ganger uavhengig av hverandre.
* Apoptose ble målt ved western blot for spaltede caspase 3 og spaltet PARP. (A og D) I ERPC9 celler behandlet med erlotinib-cisplatin i kombinasjon, en betydelig økning i spaltede kaspase 3 og spaltet PARP ble observert sammenlignet med ikke-behandlede celler (p = 0,045 og p = 0,007, respektivt). I tillegg var det signifikant økning i spaltede kaspase 3 og spaltet PARP sammenlignet med alle andre grupper (p = 0,030 og p = 0,003, henholdsvis). (B C) Ved studiestart var det betydelige lavere nivåer i både kløyvet caspase 3 og kløyvet PARP i ERPC9 forhold til PC9 celler (p 0,0001 og p = 0,0004, henholdsvis)
I tillegg. ble benyttet Chou-Talalay metode [29] for å få kombinasjonen indeks (CI) for å evaluere for synergi, additive effekter eller antagonisme av kombinasjonsbehandling av erlotinib og cisplatin (veldig sterk synergisme, sterk synergisme, moderat synergisme, svak synergisme, tilsetningsstoff, og antagonisme ble definert som CI 0,3, 0,3 CI 0,7, 0,7 CI 0,85, 0,85 CI 1, CI = 1, og CI . 1, henholdsvis)
Resultater
IC50 verdier i PC9 og ERPC9 Cells
Den hemmende konsentrasjon (IC) 50 verdier av erlotinib og cisplatin ble først etablert i PC9 celler før undersøke effektene av å kombinere de to agentene som en kombinasjonsbehandling i erlotinib motstandsdyktig PC9 (ERPC9) celler. Den bestemte IC50 for erlotinib var 33 nM i PC9 celler og 878 nM i ERPC9-celler (ca. 26 ganger høyere enn i PC9 celler) (data ikke vist); Dette bekrefter at ERPC9 celler ble etablert på en måte som tillater det å bli resistente og muligens etterligne det som er sett klinisk. Den cisplatin IC50 var 18 uM i PC9 celler og 40 uM i ERPC9-celler (data ikke vist). Gitt cisplatin IC 50 økte ikke signifikant, dette ytterligere støtter at ERPC9 celler demonstrerte spesifikk motstand mot erlotinib.
Erlotinib-cisplatin Kombinasjonsbehandling i ERPC9, PC9, og Normal menneskeBronkitt Epitelceller
Figur 1A og 1B viser prosentandelen av ERPC9 og PC9 celle overlevelse etter under to-dagers medikamentelle behandlinger. Når cellene ble behandlet med erlotinib-cisplatin i kombinasjon, 61,1% av ERPC9 celler overlevde; Dette var betydelig lavere sammenlignet med celler behandlet med erlotinib-alene (96,6%) og cisplatin-alene (89,3%). Med andre ord, drepte kombinasjonsbehandling et betydelig større antall celler (38,9%) i forhold til erlotinib-alene (0,4%, p = 0,001), cisplatin-alene (10,7%, p = 0,0002) og tak ikke-behandlede celler (0,0 %, p 0,0001). I tillegg kombinasjonsbehandling indusert sterk synergis celledød tross ERPC9 cellenes motstandsdyktighet overfor erlotinib (CI = 0,12 beregnet gjennom Chou-Talalay metode [29]). Det ble observert en lignende trend med synergistisk celledød i foreldre PC9 celler med kombinasjonen erlotinib-cisplatin behandling; celle overlevelse etter erlotinib stående behandling var 79,6%, cisplatin var 76,1%, og kombinasjonen var 49,6% (p 0,0001) (CI = 0,45). Disse funnene antyder at tilsetningen av cisplatin til erlotinib kan være en effektiv diett i å drepe erlotinib-resistente lungekreftceller, selv ved lave doser når de brukes i kombinasjon.
Normale humane bronkiale epitelceller (NHBE) celler ble brukt for å evaluere giftigheten av erlotinib-cisplatin kombinasjonsbehandling. To-dagers behandling med erlotinib-alene, cisplatin-alene, og erlotinib-cisplatin i kombinasjon viste minimal celledød og ingen signifikante forskjeller i celledød og levedyktighet hos de fire gruppene (p = 0,958), noe som indikerer en trygg terapeutisk indeks ved den aktuelle doserings for ikke-kreftceller (figur 1C).
Baseline autofagi Levels i ERPC9 Cells
autophagy rolle i kreft har vært omstridt og har ikke blitt studert i detalj [30]. For å undersøke autofagi rolle i akuttmottaket, var en sammenligning av baseline nivåer av autofagi mellom ERPC9 og PC9 celler målt gjennom western blot analyse for LC3II [31] og P62. Som vist i figur 2, LC3II nivåene var signifikant høyere i ERPC9 celler sammenlignet med celler PC9 (p = 0,030). I tillegg P62 nivåene var signifikant lavere i ERPC9 celler enn PC9 celler (p 0,0001). Begge disse resultatene tyder på at ERPC9 celler havn høyere baseline autofagi nivåer enn erlotinib sensitive PC9 celler.
Kombinasjons Erlotinib-cisplatin behandling og LC3II
Videre undersøkelse av kombinasjonsbehandling i ERPC9-celler viste signifikant lavere nivåer av LC3II sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper som vist i figur 3A og 3C (p = 0,011). Nedgangen i LC3II nivåer på western blot analyse var synergistisk, speiling samme synergistisk trend sett i celledød med kombinasjonsbehandling. Dette tyder på at autofagi kan være en tilhørende mekanisme ER, og erlotinib-cisplatin kombinasjonsbehandling kan fungere ved å målrette autofagi. Interessant, men det var ingen signifikante endringer i LC3II i NHBE cellene (Figur 3B).
De samme endringene i LC3II ble også visualisert gjennom immunfluorescens (figur 3D). Det var en betydelig reduksjon i LC3II fluorescens i erlotinib-cisplatin kombinasjon behandlede celler sammenlignet med de andre behandlingsgruppene (p 0,0001).
Modulation av Autophagy Endrer Følsomhet for behandling
For å bestemme om autofagi er en viktig overlevelsesmekanisme underliggende eR, autofagi induserende agent, rapamycin, og midlet, 3-MA, ble brukt. Hvis autofagi rolle er å fremme resistens og overlevelse mot behandling, er det forventet at det vil bli økt celleoverlevelse med induksjon av autophagy og en snakke reduksjon i celleoverlevelse når autofagi er sperret etter under kombinasjonsbehandling. Som hypotese, som vist i figur 4A, rapamycin med erlotinib-cisplatin kombinasjonsbehandling viste signifikant større celleoverlevelse og levedyktighet (16,5%) sammenlignet med celler som fikk erlotinib-cisplatin i kombinasjon uten rapamycin (p = 0,0004). Omvendt, når 3-MA ble tilsatt med erlotinib-cisplatin i kombinasjon, celleoverlevelse var signifikant lavere (9,1%) sammenlignet med celler kun behandlet med erlotinib-cisplatin kombinasjonsbehandling alene (p = 0,037) (figur 4B). I tillegg er kombinasjonen av 3-MA, erlotinib og cisplatin var i stand til å drepe signifikant flere celler enn 3-MA alene (44,6% og 34,1% celledød, henholdsvis) (p = 0,032). Som Figur 4B har vist at inhibering autofagi med 3-MA var i stand til å sensitivisere celler for kombinasjonsbehandling, viser figur 4C resultatene av 3-MA behandlede ERPC9 celler med erlotinib-alene og cisplatin-alene. Når 3-MA ble tilsatt som erlotinib-alene (p 0,0001) og cisplatin-alene (p 0,0001) behandling var det en 39,2% og 31,0% høyere celledød, respektivt, sammenlignet med behandling med enkeltmedikamentbehandling uten 3-MA . Disse er knyttet funnene ytterligere støtte at autofagi kan være en beskyttende mekanisme som tillater større overlevelse i ERPC9 celler.
Atg3 og p-mTOR i ERPC9 Cells
Figur 5 viser resultatene fra western blot analyse av nøkkel regulatoriske proteiner i autofagi veien: p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, Beclin-en, Atg5-12 komplekse, Atg7 og Atg3. Det var ingen signifikante forskjeller i p-Akt, Akt, mTOR, Beclin-en, Atg5-12 kompleks, og Atg7 mellom ERPC9 og PC9 celler (figur 5A). Men ved baseline, p-mTOR var betydelig lavere i ERPC9 celler sammenlignet med PC9 celler (p = 0,021) (figur 5C). I tillegg var det en signifikant høyere utgangsnivå Atg3 i ERPC9 celler sammenlignet med celler PC9 (p = 0,018) (figur 5B). En av de viktigste rolle Atg3 er å konvertere LC3I til LC3II for å fremme autofagi [32], og følgelig var det et betydelig lavere nivå av LC3I i ERPC9 celler enn PC9-celler (mer LC3I ble omdannet) (p = 0,008) (figur 2A) . Jo lavere nivå i p-mTOR støtter ytterligere funn av høyere basale nivåer av autofagi i ERPC9 celler. Mens, kan de ekstraordinære høye nivåer av Atg3 representerer en kritisk komponent i overdragelse og bidra til høyere basale nivåer av autofagi og promotering av ER.
Kombinasjonsbehandling Targets Atg3
For å ytterligere evaluere hvordan kombinasjonsbehandling nedregulerer autofagi spesifikt i ERPC9 celler, ble western blot analyse for endringer i regulatoriske autofagi proteiner utført. Som vist i figur 6A, var det ingen signifikante endringer i p-Akt, Akt, mTOR, p-mTOR, Beclin-en, Atg5-12 kompleks, og Atg7 blant behandlingsgruppene. Det var imidlertid et betydelig lavere nivå av Atg3 når de behandles med erlotinib-cisplatin i kombinasjon sammenlignet med referansereguleringsnivå (p = 0,005) (figur 6B). Dette funnet kan tyde på at erlotinib-cisplatin kombinasjonsbehandling kan liksom målrette over-uttrykk eller oversettelse av Atg3 sett i ERPC9 celler. I tillegg er disse funnene støtter at Atg3 er en kritisk komponent for overdragelse ER og overlevelse.
siRNA Hemming av Atg3 Snur Erlotinib Resistance
For å undersøke hvilken rolle de høye utgangsnivåer Atg3 sett videre i ERPC9 celler, ble ERPC9 celler transfektert med Atg3 siRNA og behandlet på riktig måte. siRNA transfeksjon var vellykket i å blokkere Atg3 oversettelse og autofagi aktivitet (representert ved lav LC3II og høye nivåer P62 i relative celler uten Atg3 siRNA) som vist i figur 7A. Det var ingen signifikant forskjell i celleoverlevelse i kontrollgruppen av ERPC9 celler transfektert med ikke-spesifikk siRNA (NS siRNA) sammenlignet med ERPC9 celler uten transfeksjon (p = 0,445). Men med Atg3 siRNA transfeksjon, ERPC9 celler ble re-sensibilisert for erlotinib stående behandling og hadde en tilhørende betydelig økning i celledød på 32,0% sammenlignet med erlotinib stående behandlet ERPC9 celler med NS siRNA transfeksjon (p = 0,043). ERPC9 celler ble også betydelig mer følsom for kombinasjonsbehandling etter Atg3 siRNA transfeksjon i forhold til NS siRNA transfekterte celler; 10,3% mer celledød ble observert (p = 0,002) (figur 7B). Men dette fenomenet ble ikke sett i cisplatinbehandlede ERPC9 celler transfektert med Atg3 siRNA; Det var ingen signifikant forskjell mellom behandlet cisplatin Atg3 siRNA og NS siRNA (70,2% vs. 70,8%, henholdsvis) (p = 0,924). Disse dataene tyder på, og underbygger at grunnlinjen oppregulering av Atg3 er intimt involvert i ER og celleoverlevelse og blokkerer translasjonen av Atg3 i ERPC9-celler er i stand til å reversere ER og meddele gjen følsomhet for erlotinib behandlinger. I tillegg blokkerer Atg3 ikke gi økning følsom overfor cisplatin medikamentbehandling, noe som tyder på at inhibering av Atg3 er spesifikk for ER.
Atg3 siRNA transfeksjon var i stand til å frembringe en betydelig økning i følsomhet overfor enkelte behandlinger i foreldre PC9 cellelinje. Erlotinib med Atg3 siRNA var i stand til å indusere 11,5% mer celledød i forhold til NS siRNA erlotinib behandling (p 0,0001) og cisplatin med Atg3 siRNA var i stand til å indusere 9,7% mer celledød i forhold til NS siRNA cisplatin behandling (p 0,0001). Forskjellen i celle-død mellom kombinasjons behandlede celler med Atg3 siRNA i forhold til kombinasjonsbehandling med NS siRNA var liten (4,5%); selv om denne forskjellen var signifikant (p = 0,002).
apoptose
Apoptose ble målt gjennom western blot analyse av spaltet caspase 3 og kløyvet PARP. Det var signifikant lavere nivåer av spaltede PARP (p = 0,004) og spaltet caspase 3 (p 0,0001) på ERPC9 celler sammenlignet med PC9 celler (figur 8B og 8C, henholdsvis).
