Abstract
En nyere generasjon av anti-kreft narkotika rettet mot underliggende somatiske genetiske driver hendelser har ført til høy single-agenten eller single-pathway responsrater i utvalgte pasienter, men få pasienter oppnår komplett respons og en betydelig brøkdel av pasientene tilbakefall innen ett år. Det er således et stort behov for identifisering av kombinasjoner av målrettede midler som induserer mer komplett respons og forebygge sykdomsprogresjon. Vi beskriver resultatene av en kombinasjon skjermen på en enestående målestokk i pattedyrceller utført ved å bruke en samling av målrettede, klinisk medgjørlig midler over et stort panel av melanomcellelinjer. Vi finner at selv de mest synergistiske stoffet parene er effektiv bare i et diskret antall cellelinjer, som ligger til grunn en sterk sammenheng avhengighet for synergi med sterke, utbredt synergier ofte svarende til ikke-spesifikke eller off-target legemiddeleffekter som multimedikamentresistens protein 1 (MDR1) transporter hemming. Vi identifiserte stoffer sensitiverende cellelinjer som er BRAF
V600E mutant men egentlig motstandsdyktig mot BRAF inhibitor PLX4720, inkludert vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor /kinase innsats domene-reseptor (VEGFR /KDR) og blodplateavledet vekstfaktorreseptor (PDGFR) familie inhibitor cediranib. Kombinasjonen av cediranib og PLX4720 indusert apoptose
in vitro Hotell og tumorregresjon i dyremodeller. Denne synergistiske interaksjonen er sannsynlig på grunn av inngrep av flere reseptor-tyrosin-kinaser (RTK), noe som bekrefter potensialet av narkotika snarere enn genspesifikke kombinasjon oppdagelse tilnærminger. Pasienter med forhøyet biopsi KDR uttrykk viste redusert progresjonsfri overlevelse i forsøk med mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) kinase pathway hemmere. Dermed høy gjennomstrømming upartisk screening av målrettede medikamentkombinasjoner, med passende bibliotek utvalg og mekanistisk oppfølging kan gi klinisk-handlingsmedikamentkombinasjoner
Citation. Friedman AA, Amzallag A, Pruteanu-Malinici I, Baniya S, Cooper ZA, Piris A, et al. (2015) Landskap av Målrettet Anti-Cancer Drug Synergier i Melanoma Identifiserer en Novel BRAF-VEGFR /PDGFR kombinasjonsbehandling. PLoS ONE 10 (10): e0140310. doi: 10,1371 /journal.pone.0140310
Redaktør: Suzie Chen, Rutgers University, USA
mottatt: 22 august 2015; Godkjent: 24 september 2015; Publisert: 13 oktober 2015
Copyright: © 2015 Friedman et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (P01CA163222 og R21CA175907 til DEF, 1K08CA160692-01A1 og U54CA163125 til JAW, 1U54HG006097-01 til CHB), Dr. Miriam og Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (DEF), Doris Duke Medical Foundation (DEF), en Elsa U. Pardee Foundation grant (DEF), en Fred Lovejoy Resident forskning og utdanning Award (AAF), en Brigham og kvinner Hospital Hudavdelingen NIH Trening Grant T32AR007098-38 (AAF), og tilskudd fra Wellcome Trust (086357 og 102696, CHB, DAH)
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer .
Innledning
Selv om responsrater innenfor genetisk utvalgte subpopulasjoner av solide tumor kreftpasienter kan være høy, for eksempel 60-80% blant
BRAF
V600E
mutante melanom pasienter som får BRAF-hemmer vemurafenib [1], få pasienter oppnå mono komplett respons. Således, et betydelig antall pasienter har iboende resistens overfor MAPK-reaksjonsveien inhibering. Selv blant pasienter som responderer, vil de fleste utvikle ervervet resistens innen et år, ofte på grunn av flere mutasjoner eller bypass trasé [2, 3]. Nylig flere grupper har oppdaget mekanismer for ervervet resistens mot BRAF-rettet behandling, vanligvis i første omgang sensitive cellelinjer som A375 [4-7], og peker på kompleksiteten i å identifisere berging terapeutisk strategi og få studier har adressert
de novo
motstand mot vemurafenib i sammenheng BRAF
V600E [8]. Medikamentkombinasjoner har potensial til å ta
de novo Hotell og ervervet motstand, men å forutsi legemiddelkombinasjonen aktivitet fra enkle midler er ennå ikke mulig delvis fordi bare relativt små datasett kombinasjoner eksisterer. Kandidat-baserte oppdagelsen av kombinasjons narkotika mål som sekvense svulster for ekstra sjåfør somatiske mutasjoner [8] eller objektive RNAi eller cDNA skjermer kan gi handlingskraftige mål. Imidlertid kan disse metodene glipp potensielle høy-ordens interaksjoner med hemmere rettet mot flere proteiner og deres kliniske relevansen kan avhenge lange drug discovery innsats rundt nye mål. Dessuten, basert på sterk sammenheng avhengighet sett for monoterapi aktivitet er det ventet at kombinasjoner aktivitet og synergisme vil også være bestemt sammenheng. Men det er ennå ikke klart om kombinasjoner av målrettede midler kan være effektiv over et bredt spekter av svulst subtype, noe som gjør dem gjeldende for flere pasienter enn sine single agenten bestanddel eller om motstanden må tas opp av et stort antall kontekst spesifikke kombinasjoner adressering mindre grupper av pasienter enn de som utgjør ett enkelt virkemiddel. Flere grupper har begynt å identifisere legemiddelinteraksjoner på en saklig måte i kreftceller [9, 10], som har gitt viktig innsikt. Vi har tidligere beskrevet massivt-skalert monolegemiddelscreening over et stort panel av genotypisk-definerte cancercellelinjer [11]. For å forstå den generelle landskapet og potensialet i skalert legemiddelinteraksjons screening over kreftcellelinjer som en innledende fase av en kreftcelle-line Kombinasjon (C
3) prosjektet, vist vi en stor samling av melanom cellelinjer på tvers av flere tusen kombinasjoner av målrettede hemmere. Melanom ble valgt i lys av tilgjengeligheten av et stort antall cellelinjer skjuler en felles mutert onkogen (BRAF
V600E) og en validert målrettet terapi.
Resultater
Systematisk kombinasjon narkotika synergi oppdagelsen
for å få innsikt i landskapet av klinisk relevante synergistiske kombinasjoner målrettede midler i kreft, vi satt sammen et bibliotek av 108 forbindelser. Siden vi var interessert i å finne medikamentkombinasjoner med potensial for klinisk oversettelse og for hvilken mekanisme handling ville være medgjørlig, valgte vi godt karakterisert onkologi legemidler godkjent av Food and Drug Administration (FDA) eller sent i kliniske studier; to tredjedeler av disse midlene har vært i klinisk bruk (Fig 1A og S1 tabell). Vi har valgt de mest lovende signaltransduksjon hemmere i klinisk utvikling og de som ga et stort mangfold av molekylære mål til grovt dekke kreft signalveier; denne kategorien utgjorde det store flertallet av biblioteket vårt, på 67/108 narkotika. Vi suppleres disse med legemidler rettet mot cellesyklus regulatorer, epigenetiske modulatorer, nukleære hormonreseptorer, og andre nye mekanismer under intens pre-klinisk undersøkelse. Endelig har vi inkludert et begrenset antall legemidler representerer store tradisjonelle cytotoksiske chemotherapies. Dette stoffet panel utvides vesentlig utover en nylig rapportert kombinasjon skjermen i melanom utnytte 40 legemidler [10]. Et panel av 36 melanomcellelinjer ble valgt som representerer store genotypiske klasser (S2 Table) og inkluderte seks nye pasient avledet kortsiktige melanom kulturer ( 10 passasjer fra biopsi). Av de 30 tidligere etablerte cellelinjer 19 er blitt karakterisert på det genomiske nivå i ytterligere detalj (S2 tabell). Samlet sett løser dette skjermbildet et mye større antall medikamentkombinasjoner og cellelinjer enn tidligere rapportert [9, 10, 12]. Gitt praktiske begrensninger av screening stort antall kombinasjoner over hele dosen matriser av kombinasjoner, valgte vi to dosekombinasjoner fast-ratio. Vi utførte en skjerm kjørt inn over ti cellelinjer for å velge doser som resulterte i 70% levedyktighet å fange syntetiske dødelige hendelser (data ikke vist). Vi bygget et bibliotek med alle 5,778 kombinasjoner som tilsvarer alle mulige to-medikamentkombinasjoner på tvers av de 108 narkotika, og enkelt narkotika. Vi vist i 1536-godt ultra-high-throughput format ved hjelp av høy-innhold og automatisert bildeanalyse basert avlesning av celletall ved nukleær farging (fig 1B). I tillegg til celletelling ved kjerne flekk, vi også systematisk kartlagt medikamentkombinasjon virkning på celledød ved samtidig anvendelse av antistoffer mot spaltede PARP og normalisering til atom total telling for å oppnå en celledød poengsum. Totalt for alle legemiddelkombinasjoner på to konsentrasjoner på tvers av alle cellelinjer og måle både celletall og celledød, genererte vi et landskap av 800.000 kombinatoriske narkotika datapunkter (S3 Table). Gitt vår begrenset dekning av legemiddeldose matrise, brukte vi Bliss uavhengighet beregning av synergi å representere uventede kombinasjon effekter [13-15].
(A) Oppsummering av klinisk utviklingsfase av 108 legemidler som inngår i kombinasjonen narkotika panel. (B) Eksempel på rå UHTS data generert, demonstrerer legemer informasjon samlet inn fra DAPI kanal og apoptose data fra spaltet PARP immunfluorescens; positiv kontroll av HSP90-inhibitor 17-AAG behandling er vist. (C) Sammendrag matrise av kombinatorisk medikament data, hvor hvert punkt representerer virkningen av en av 5,778 kombinasjoner på standard medikamentkonsentrasjonen, som median effekten av medikamentkombinasjonen på tvers av alle 36 melanom cellelinjer på det relative celletall (til venstre) og den beregnede Bliss synergi poengsum for den kombinasjonen (til høyre). (D) Histogram av antall cellelinjer en gitt medikamentkombinasjon viste synergi. Peak rekke synergier ble sett i en cellelinje, noe som indikerer mange synergier er privat. (E) Som i (C), som viser median virkning av medikamentkombinasjonen (ved standard konsentrasjon) på den relative cPARP positive forhold (til venstre) og den beregnede Bliss synergi for at cPARP nivå (til høyre). (F) Grafisk fremstilling av medikamentkombinasjoner (legemiddel par forbundet med en kant) som viste en signifikant uventet høyt cPARP over en spådd nivå på den gitte celletall. Node størrelse indikerer antallet narkotika parene at gitt legemiddel vises med andre legemidler på «uventet apoptotisk» -liste. Edge farge indikerer stoffet par konsentrasjon (standard eller lav) hvor forhøyet cPARP ble funnet; kant mønster indikerer om forhøyet cPARP ble funnet i innstillingen for lavt celletall eller normal celletall ( 80% kontroll)., med forhøyet cPARP i innstillingen for normal levedyktighet potensielt representerer «treg» dødskinetikk for den kombinasjonen
Første analyse av synergi verdiene viste at et stort antall kombinasjoner demonstrert 40% Bliss uavhengighet i mer enn en cellelinje, inkludert flere legemidler med bred dødelighet og synergi da sammen med alle andre legemidler over cellelinje samling (fig 1C). Men bare 0,3% av synergistiske kombinasjoner viste ekte syntetisk dødelighet, hvor enkelte medikamenter ikke hadde noen effekt ( 80% levedyktighet), men sterk synergis levedyktighet 50%. Således er de fleste medikamenter med synergistiske interaksjoner viser noen målbar virkning av minst en monoterapi. Vi observerte at noen stoffer lysfølsomt celler til mange andre rusmidler, Disse inkluderte proteasominhibitor bortezomib, pro-apoptotiske B-cellelymfom 2 (BCL2) familiemedlem inhibitor ABT263, og microtubule inhibitor vinkristin (fig 1C). Interessant, de fleste av medikamentkombinasjoner som viser synergi viste slik synergi i tre eller færre linjer (56%; Fig 1D). Dermed fleste legemiddelkombinasjonen effekter avhenge sterkt på mobil sammenheng. Selv kombinasjoner som viser dyptgripende synergier i en undergruppe av cellelinjer ikke er synergistisk eller effektiv i andre cellelinjer. Interessant, dette er sant selv for kombinasjoner som kan forventes å være svært bredt synergistisk fordi de målrette to mekanistisk utfyllende cellulære prosesser. For eksempel er kombinasjonen av gemcitabin, et DNA-ødeleggende middel, sammen med DNA-skadereparasjons sti-kinase-inhibitor CHK1 AZD-7762, er sterkt synergistisk i bare et subsett (6/36) av cellelinjer. Selv om dette kan skyldes forskjeller i DNA-skader hastighet over cellelinjer, vi har observert flere andre tilfeller av sterke synergier som er sett bare i noen få linjer.
En rekke legemidler induserte økt celledød målt ved cPARP , inkludert ABT263 og den brede kinase inhibitor midostaurin (fig 1E). Færre narkotika viser bred synergi i cPARP induksjon forhold til celletall; ett unntak var nilutamid, en androgen reseptor antagonist. Generelt, legemiddelkombinasjoner reduserende legemer etter 72 timer viste også en økning i prosentandelen av celler som var positive for cPARP farging ( «fast» kinetikk). Men en undergruppe av kombinasjoner økt cPARP uten å påvirke celletall (S1 A og S1B fig). Vi hypotese at denne undergruppen representerer sannsynligvis kombinasjoner med «treg» kinetikk celledød induksjon. Vi utviklet en regresjonsmodell for dette forholdet å identifisere disse uteligger apoptose-induserende kombinasjoner i hver cellelinje. Overall, 4% kombinasjoner viste et overskudd økt cPARP forhold til celletall. Spesifikke narkotika indusert apoptose uventet oftere i dette settet med kombinasjoner (fig 1F). Ikke overraskende, ABT263 indusert høy cPARP bredt i forhold til celletall og ble beriket både «raske» og «treg» kinetiske mønstre kombinasjoner. Interessant, fingolimod, en partiell agonist av SP1R, en reseptor antas å være involvert i apoptotisk celle-gjenkjennelse av immunceller i stedet for i cellestyrte regulering av apoptose og bortezomib, viste en «fast» mønster dødsinduksjon. I kontrast, FK866, en nikotinamid phosphoribosyltransferase inhibitor viste en «slow» mønster av apoptose induksjon.
Drug synergi- og off-target effekter
For å prioritere synergistiske kombinasjoner for videre mekanistisk disseksjon, vi først analysert legemiddelinteraksjoner med de sterkeste Bliss uavhengighet score over flest antall cellelinjer. Flere av disse interaksjonene er tidligere beskrevet i litteraturen, validere skjermen identifisere
bona fide
synergis interaksjoner. Blant disse inngår MK1775, en WEE-en inhibitor, og AZD7762, en CHK1 /2-hemmer (S2A figur); dual hemming av både cellesyklus sjekkpunkt kinaser har tidligere blitt beskrevet i flere krefttyper i cellekultur og
in vivo product: [16]. Synergistisk interaksjon mellom målrettede inhibitorer og BCL2 familiemedlem inhibering er blitt tidligere beskrevet [17, 18] og vi også observert en slik interaksjon mellom høye doser av CHIR265, en pan Raf-inhibitor, og ABT263 (S2B Fig). ABT263 også lysfølsomt et stort antall cellelinjer ( 10) i det primære skjermen til bortezomib, og fytokjemikalier indol-3-carbinol. En spesielt sterk synergistisk interaksjon ble sett mellom BI78D3, en JNK inhibitor og TZDZ8, en GSK3p inhibitor (S2C fig). Men vi var ikke i stand til å observere synergi av RNAi knockdown av enten målet klasse sammen med medikamentell behandling (S2D figur) eller mellom en utvidet samling av andre JNK og GSK3p verktøy forbindelser (S2E figur); Videre var dette synergi sett på en rekke andre transformerte og ikke-transformerte celler (S2F Fig), noe som tyder på at dette var en bred, idiosynkratisk, og off-target cytotoksiske synergistisk interaksjon usannsynlig å være klinisk nyttig på grunn av sin aktivitet mot ikke-transform celler.
Vi har valgt ett av disse sterke synergi interaksjoner for ytterligere mekanistiske undersøkelser. Vi observerte en sterk interaksjon mellom lapatinib, en EGFR familie inhibitor, og vinkristin, en microtubule inhibitor (figur 2A). Vinkristin er sjelden brukt i melanom terapiregimer og EGFR familiemedlemmer er ikke kjent for å ha en driver rolle i melanomer unntatt i adaptive motstand mot BRAF-hemmere [7]. Vi bekreftet sterk ~ 10X sensibilisering av noen, men ikke alle, melanomceller til vinkristin med lapatinib, med en Bliss verdi 50% og Kombinasjon Index (CI) på 0,37 [19] (figur 2B og S3A og S3b figur), og flere andre EGFR familiemedlem hemmere inkludert erlotinib (S3C fig). Men vi var ikke i stand til å bevisstgjøre A375 celler til vinkristin etter enkel eller kombiknockdown av lapatinib mål EGFR og HER2 (S3D fig). Videre cellesyklus analyse viste synergistisk arrest i G
2 /M med vinkristin-lapatinib kombinasjon, som ville være forventet med økende vinkristin dose (Fig 2C). Lapatinib og andre 4-anilinoquinazoline-avledede tyrosin-kinase-inhibitorer er blitt beskrevet som inhibitorer av P-gp-familien av multiresistens (MDR) transportører [20, 21]. Verapamil, en kanonisk MDR1 inhibitor, resulterte i en lignende synergistisk interaksjon med vinkristin (S3E Fig). Gitt sterk synergi mellom vinkristin og lapatinibs i A375 men ikke WM451Lu celler, undersøkte vi hvorvidt differensial MDR familieuttrykk kan ligge til grunn for den cellelinjen spesifisiteten av den synergistiske interaksjon. Samlet, observerte vi en generell trend i retning av økt synergi mellom vinkristin og lapatinib i cellelinjer med høyere MDR1 mRNA uttrykk. (S3F fig). Fordi enkelt celle sammenheng kan påvirke hvor robust den generelle trenden, vi spesielt sammenlignet en følsom for en ufølsom cellelinje. Vi observerte åtte ganger uttrykk for MDR1 mRNA i A375 celler vs. WM451Lu celler (figur 2D). Videre lapatinib økt oppbevaring av en MDR substrat fargestoff på samme måte som verapamil (Fig 2E). Knockdown av MDR1 av RNAi i A375 celler sensitivisert cellene til vinkristin celleveksthemming (figur 2F og S3G Fig). Overekspresjon av MDR1 i WM451Lu celler indusert motstand mot vincristin i en lapatinibs avhengig måte (figur 2G og S3H Fig). Således, til tross for «rettet» natur av enkelte kinase inhibitorer, kan deres aktivitet mot MDR-familiemedlemmer gi en synergistisk effekt som ikke er relatert til deres primære mål. I samsvar med dette, observerte vi synergi mellom vinkristin og lapatinib tvers av en rekke andre raskt prolifererende celler (S3I Fig). Lignende funn av promiskuøse synergisinteraksjoner via biotilgjengelighet har blitt funnet i gjær anti-sopp narkotika kombinasjonsskjerm [22]. Et stort antall forbindelser på tvers av en rekke strukturelle klasser kan vise MDR-inhibering, som støtter vår observasjon at vincristin er sensibilisert av et stort antall andre stoffer (Fig 1 D).
(A) Screening resultater som viser virkningene på både konsentrasjoner av vinkristin og lapatinib, individuelt og som en kombinasjon, som viser sterk synergi på tvers av de fleste melanom cellelinjer som indikert av høy Bliss synergi score. (B) Bekreftelse av den synergistiske virkning av kombinasjonen av lapatinibs (5 uM) i A375 (
n
= 19), men ikke WM451Lu (
n
= 14) -celler. Feilfelt representerer S.D. Måle gjentak. (C) Representative flowcytometri data som viser lapatinibs potenserer G
2 /M skift av A375-cellepopulasjonen i samsvar med øket vinkristin virkning. (D) Logg
2 i forhold ekspresjon av den gitte multi-medikamentresistens transportøren i A375-celler versus WM451Lu, som viser økt ekspresjon MDR1 i A375-celler. Feilfelt representerer S.D. måle replikater (
n
= 9). (E) Calcein fargestoff fluks forsøk som viser øket fluorescens-intensitet (som indikerer nedsatt MDR fluksen) i nærvær av lapatinibs eller kontroll MDR inhibitor verapamil (begge ved 5 uM); kvantifisering av celle gråverdier vist til venstre. Feilfelt representerer S.D. måle gjentak (
n
= 4, 200 celler per replikere). (F) MDR1 knockdown etter siRNA bevirker en synergistisk effekt på cellelevedyktighet i nærvær av 5nM vinkristin. Feilfelt representerer S.D. måle replikater (
n
= 7). (G) Overekspresjon av MDR1 (i forhold til GFP kontroll) i WM451Lu avtar følsomheten for vinkristin, en effekt reversibel med 5 uM lapatinibs. Feilfelt representerer S.D. måle gjentak (
n
= 4)
VEGFR /PDGFR antagonister synergize med BRAF-hemmere
For å identifisere mer spesifikke synergistiske kombinasjoner, vi fokusert på kombinasjoner som kanskje adressere iboende motstand mot BRAF hemmer vemurafenib. Vi identifiserte flere BRAF
V600E cellelinjer, inkludert ISTMel1 og RPMI7951, noe som viste resistens mot PLX4720 selv ved høye doser (mer enn 5 uM, veksthemming 50%), sammenlignet med følsomme linjer som UACC62 og SkMel28 (IC
50 500nM) (figur 3A). Mange av de 107 andre rusmidler i vårt bibliotek viste synergis interaksjoner med PLX4720 i spesifikke celle sammenhenger (S4A Fig). Vi brukte den statistiske analysen av microarray (SAM) tilnærming [23] for å identifisere kombinasjoner med PLX4720 som var spesielt synergistisk i PLX4720-resistente cellelinjer (S4B Fig). Blant disse inkluderte HDAC hemmer vorinostat, nylig funnet å synergize med BRAF-hemmere i noen melanoma cellelinjer [24]. Vi bemerket betydelig synergi mellom RTK-inhibitor cediranib og PLX4720 i disse resistente cellelinjer (figur 3B), med en CI på 0,35 (S5a figur), men ikke i sensitive linjer, selv ved lave doser av PLX4720. Synergy ble også observert mellom cediranib med MEK hemmer selumetinib (AZD6244), og med trippelkombinasjonen av cediranib, PLX4720, og selumetinib, noe som tyder på en generell samhandling mellom cediranib og hemming av BRAF-drevet MAPK signal (S5b og S5C fig). Langsiktig vekst analyser bekreftet en sterk synergistisk interaksjon (figur 3C). Kombinasjonen av cediranib og PLX4720 hurtig indusert apoptose i resistente celler, som vist ved Annexin V-farging og Western blotting cPARP (figur 3D). Mens monoterapi PLX4720 behandling forårsaket cellesyklus arrest i følsomme cellelinjer, var det ingen signifikant effekt av stoffet kombinasjonen på cellesyklus (S5D fig). I motsetning til resultatene med lapatinib, fant vi ingen sensibilisering av resistente linjer til PLX4720 med MDR inhibitor verapamil (S5E figur).
(A) Virkning av PLX4720 (PLX4720) på tvers av melanomceller i primære skjermen, demonstrere noen
BRAF
mutante melanomer vise iboende motstand mot BRAF hemming. Resistance (definert som 50% levedyktighet i 5 pm PLX4720) i disse linjene ble bekreftet i sekundære analyser (nedenfor). (B) Cediranib vises synergieffekter med PLX4720 i flere egen resistente linjer i den primære skjermen; disse effektene ble verifisert i standard vekstforsøk i videregående skjermer (nedenfor, med 2 um cediranib). BRAF hemmer sensitiv linjer UACC62 og SkMel28 viste ingen synergi til enhver PLX4720 dose, mens resistente ISTMel1 og RPMI7051 linjer viste sterk synergi med cediranib (Bliss 30%). Feilfelt representerer S.D. måle gjentak (
n
= 3-4). (C) Langsiktig krystallfiolett-farget kolonivekstanalyser bekreftet vedvarende synergi mellom PLX4720 (PLX) og cediranib (sert) i resistente ISTMel1 og RPMI7951 linjer, men ikke PLX4720 sensitive linjer UACC62 og SkMel28. (D) Annexin V-analysene viste at cediranib apoptose når den kombineres med PLX4720 i resistente ISTMel1 celler, sammenlignet med følsom UACC62, og som bekreftet ved Western-blotting for å spaltes PARP (nedenfor). Feilfelt representerer S.D. måle replikater (
n
= 3). (E) Western blotting bekreftet uttrykk for cediranib mål PDGFRp, og variabelt, DDF og PDGFRα i PLX4720-insensitive ISTMel1 og RPMI7951 celler, med svakere eller fraværende uttrykk i PLX4720 sensitive UACC62 og SkMel28 celler. Tjuefire timers behandling med PLX4720 moderat undertrykt KDR og indusert PDGFRp uttrykk, et mønster også sett
in vivo plakater (S9A fig). (F) Western blotting bekreftet på målet undertrykkelse av PDGFRα og PDGFRp fosforylering (sistnevnte etter immunoprecipitation og blotting til fosfor-tyrosin gitt lav overflod). KDR fosforylering var for svak til å bli observert av Western rutinemessig i kultur, men ble sett
in vivo plakater (se S9A figur). (G) RNAi-mediert knockdown av KDR (til venstre) med bassenger eller individuelle sirnas viste synergi til ~ 30%; synergi var proporsjonal med KDR knockdown (se S7A figur). Feilfelt representerer S.D. måle replikater (
n
= 6). Til høyre, gjennomsnittlig Bliss verdier over flere gjentak viste økende synergi med samtidig knockdown av flere cediranib mål KDR og PDGFRp, og svakere, PDGFRα. Feilfelt representerer S.D. måle gjentak (
n
= 5-8).
Cediranib er en potent og selektiv hemmer av PDGFR og VEGFR familie av reseptor tyrosin kinaser i kliniske studier, som hovedsakelig brukes som et anti-angiogenese middel [25]. Mens PDGFRα og β overekspresjon tidligere har vært knyttet til ervervet resistens vemurafenib [6, 7, 26], har denne familien ikke vært implisert i celle-autonome primære vemurafenib motstand. For ytterligere å forstå mekanismen av medikamentkombinasjonen, testet vi en utvidet oversikt over RTK-inhibitorer for tiden i klinisk bruk eller utvikling. Noen, men ikke alle, tilsvar hemmere viste synergier med PLX4720, og i noen, men ikke alle resistente linjer (S6a fig). Interessant, bare cediranib og tivozanib, ikke mer spesifikke inhibitorer axitinib (VEGFR) eller crenolanib (PDGFR), viste konsistent og potent synergistisk aktivitet med PLX4720 over et bredt spekter av doser, noe som antyder en spesifikk inhiberende aktivitet av disse forbindelser på et delsett av mål . Cellelinje uttrykk databaser viste ekspresjon av cediranib mål i resistente cellelinjer (Fig S6B), som vi bekreftet ved Western-blotting (figur 3E). Generelt fant vi også at melanom cellelinjer uttrykke høyere nivåer av KDR enn noen annen avstamning i en stor samling av kreftcellelinjer (S6C Fig), noe som tyder på en bestemt celle-autonome rolle for KDR i melanom utvikling. Vi oppdaget på målet undertrykkelse av cediranib av fosforylering av både PDGFRα og PDGFRp (Fig 3F). Deretter forsøkte vi å rekapitulere synergi mellom PLX4720 og cediranib av knockdown av sine primære mål. siRNA knockdown av KDR viste en synergistisk nedgang i celle nummer når kombinert med PLX4720 behandling proporsjonal med knockdown effektivitet; Videre samtidig knockdown av flere cediranib mål inkludert PDGFRα og PDGFRp økt synergi med BRAF hemming (Fig 3G og S7A og S7b fig). Selv om vi ikke utelukker muligheten for at noe av den synergistiske aktiviteten skyldes hemming av andre RTK mål som ikke er inkludert i analysen, tyder disse resultater på at spesielt sterke synergistiske aktivitet av cediranib i kombinasjon med PLX4720 er grunnet hemming av KDR og beslektede RTK’er herunder PDGFRα og PDGFRp.
aktivering eller re-aktivering av store baner nedstrøms av RTK’er som mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) og fosfatidylinositol-3-kinase (PI OH (3) K) -AKT veier tidligere har vært innblandet i motstand mot målrettede terapier inkludert vemurafenib i både
in vitro Hotell og kliniske studier [8, 27-32]. I motsetning til de fleste studier av resistente cellelinjer, PLX4720 fullstendig undertrykt ERK-aktivering i egen-resistente linjer; Videre dual hemming av MAPK vei med PLX4720 og selumetinib viste ingen synergistisk interaksjon (S8A og S8B figur), og cediranib fortsatte å vise synergi i trippelkombinasjon med både PLX4720 og selumetinib (S5C fig). Disse resultatene foreslåtte ekstra trasé utover MAPK er relatert til cediranib aktivitet. Cediranib trykt S6K fosforylering i både sensitive (UACC62) og resistente (ISTMel1) linjer, og kombinasjonen trykt aktivering i resistente linjer av de fleste Akt sti komponenter ved pathway phospho-antistoff arrays (S8C Fig). For å finne ut om dette var rett og slett en markør for RTK hemming og /eller synergi, eller mekanismen av den observerte synergi, testet vi om PI3K /Akt pathway hemmere kan synergize med PLX4720. Interessant, Akt pathway hemming viste eneste variabelen og moderat synergi med PLX4720 tross for sterk sti undertrykkelse (S8D og S8E fig). Disse resultater antyder at undertrykkelse av MAPK eller PI3K aliserte nedstrøms for KDR /PDGFR RTK’er bare delvis bidrar til synergi mellom cediranib og PLX4720 og terapeutisk medgjørlig iboende resistensmekanismer strekke seg utover disse to veier. Blant potensielle nedstrømsveien påvirkes av PI3K /Akt sti suppresjon observert av medikamentkombinasjonen, er β-catenin et kjent substrat av GSK3P, hvis aktivering kan følge den reduserte Ser9 fosforylering observert med kombinasjonen. Selv om flere β-catenin pathway modulatorer viste ingen antagonisme eller synergi med PLX4720 i vår primære skjermen (S9A figur), og GSK3p har en rekke kjente substrater [33], denne veien kan være en av de potensielle effektorer av legemiddelkombinasjonen.
Deretter testet vi enten synergistisk hemming av vekst av melanomceller ved cediranib og PLX4720 kunne rekapitulert
in vivo
. I to xenograft modeller med de resistente linjer ISTMel1 og RPMI7951, observerte vi en sterk interaksjon mellom hemmere på tumorprogresjon (fig 4A og S9A-S9C Fig). ISTMel1 viste moderat innledende følsomhet for PLX4720, men cediranib trykkes senere veksten av svulster mens du er på PLX4720; i motsetning til dette i RPMI7951, kombinasjonen av cediranib og vemurafenib redusert innledende tumorvekst ut over virkningen av hvert av legemidlene alene.
(A) ISTMel1 xenografter ble samlet i immundefekte mus (
n
= 8 per gruppe), som ble behandlet med PLX4720 eller kontroll chow og gitt cediranib eller vann ved oral sonde. ISTMel1 xenotransplantater viste en initial respons på PLX4720 behandling alene etter ca to uker, med noen ekstra, men ikke-signifikant respons på cediranib behandling. Verdiene er vist som gjennomsnitt +/- SEM kjeder, med betydelige forskjeller i gjennomsnittlig tumorstørrelse på både PLX4720 og PLX4720 og cediranib-behandlede mus sammenlignet med kontrollgruppen behandling av ANOVA. Men kombinasjonen betydelig forsinket progresjon (definert som 500 mm
3 format) utover denne første reaksjon (høyre,
p
0,002 mellom PLX4720 og PLX4720 + cediranib armer av log-rank test) . (B) I motsetning til ISTMel1 xenotransplantater, RPMI7951 xenotransplantater viste en signifikant forskjell ved ANOVA-test innledende respons på PLX4720 versus PLX4720 og cediranib behandling etter tre uker, og, rett, viste en lengre forsinkelse av progresjon (definert som tumor 250 mm
3) helt PLX4720-resistente tumorer (
p
0,0001 mellom PLX4720 og PLX4720 og cediranib armer av log-rank test).
