Abstract
kjemisk syntetisert små interfererende RNA (siRNA) er en utbredt molekylære verktøy som brukes til å slå ned gener i pattedyrceller. Men designe potent siRNA er fortsatt utfordrende. Blant verktøyene forutsi siRNA effekt, har svært få blitt godkjent for endogene mål i realistiske eksperimentelle forhold. Vi har tidligere beskrevet et verktøy for å hjelpe effektiv siRNA design (DSIR, Designer av siRNA), som fokuserer på iboende trekk ved siRNA sekvens. Her evaluert vi DSIR ytelse ved systematisk å undersøke styrken av siRNA det design å målrette ti kreftrelaterte gener. mRNA knockdown ble målt med kvantitativ RT-PCR i cellebaserte analyser, som avslører at over 60% av siRNA-sekvenser laget av DSIR stilnet deres målgener med minst 70%. Dempe effekten ble opprettholdt selv når lave siRNA konsentrasjoner ble brukt. Denne systematiske analyse viste spesielt at, for en delmengde av gener, konstruerer øker effektiviteten av siRNA betydelig når sekvensen som befinner seg nærmere den 5′-enden av mål-gen-kodende sekvens, noe som tyder på avstanden til 5′-enden som en ny funksjon for siRNA potens prediksjon. En ny versjon av DSIR innlemme disse nye funnene, samt en liste over validert siRNA mot de testede kreftgener, er gjort tilgjengelig på nettet (https://biodev.extra.cea.fr/DSIR).
Citation: Filhol O, CIAIS D, Lajaunie C, Charbonnier P, Foveau N, Vert JP, et al. (2012) DSIR: Vurdere Design av svært potent siRNA ved å teste et sett med kreft-Relevant målgener. PLoS ONE 7 (10): e48057. doi: 10,1371 /journal.pone.0048057
Redaktør: Szabolcs Semsey, Niels Bohr-instituttet, Danmark
mottatt: 1 august 2012; Godkjent: 20 september 2012; Publisert: 30 oktober 2012
Copyright: © 2012 Filhol et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er en del av det nasjonale programmet som heter «Cartes d’Identité des Tumeurs» program (CIT) finansiert og utviklet av Ligue Nationale Contre le Cancer. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
RNA interferens (RNAi) er prosessen der en dobbel-strandet RNA (dsRNA) stiller genuttrykk, enten ved å indusere nedbrytning av sekvens-spesifikk komplementær messenger RNA (mRNA) eller ved å undertrykke oversettelse [1]. Den endogene pattedyr RNAi pathway bruker ikke-kodende microRNAs (mirnas) for å modulere genekspresjon gjennom translasjonsforskning undertrykkelse og /eller mRNA cleavage, ved å målrette den 3-utranslaterte regioner (3’UTRs) av mRNA som de deler delvis komplementaritet [2]. Modellert på disse mirnas, kjemisk syntetisert dsRNA reagenser kortere enn 30 nukleotider ble funnet å utløse en sekvens-spesifikk RNAi respons uten å indusere cellens medfødte immunforsvaret i pattedyrsystemer [3], [4]. Duplex små interfererende RNA-molekyler (siRNA) teoretisk har potensial til å spesifikt hemme ekspresjonen av nesten hvilken som helst målgen. Derfor har de blitt et utbredt molekylære verktøy representerer et kraftig middel til å studere gen-funksjon [5], [6]. Prekliniske studier og noen tidlige kliniske studier har allerede vist at sirnas har potensial som nye behandlingsformer for en rekke sykdommer, blant annet kreft [7].
For RNAi å være pålitelig, sirnas må utformes med omhu, for å sikre effektiviteten og spesifisiteten av den valgte sekvensen for dets mål-genet [6], [8]. siRNA effekten er et mål på partnerskap mellom guiden-strand og RISC maskiner fører til mRNA cleavage. I motsetning til dette, korresponderer siRNA spesifisitet til korrekt gjenkjennelse av målse, unngår uønskede bivirkninger (f.eks, «off-target» effekt). Studier basert på både eksperimentelle data og beregnings tilnærminger har rapportert at den sekundære struktur av mål og deres tilgjengeligheten var også viktig, men i mindre grad, ved bestemmelse siRNA aktivitet [9], [10], [11], [12].
Flere programmer og webservere har blitt utviklet for å automatisere siRNA design. Disse redskapsdesignregler basert på nucleotide preferanser på bestemte posisjoner, sekvensfunksjoner, potensial hårnål formasjon, stabilitet profiler, strømfunksjoner, veide mønstre og sekundær struktur av målet mRNA. Disse siRNA funksjoner er oppsummert i oversiktsartikler [se [13], [14]]. Optimal siRNA funksjoner er best bestemmes basert på eksperimentelle data. Huesken et al. [15] publisert en rekke tilfeldig valgt 2182 siRNA, som ble analysert ved anvendelse av en high-throughput fluorescerende reportergenet system. Dette førte til utviklingen av en ny generasjon av algoritme basert på maskinlærings teknikker som i betydelig grad har forbedret siRNA utforming, med en rapportert Pearson korrelasjonskoeffisient på 0,66 til 0,67 mellom målte og forutsagte effekt. Nylig, en vurdering av ulike siRNA-designe verktøy konkluderte med at
Biopredsi product: [15],
Thermocomposition product: [16] og
DSIR,
en beregningsmodell utviklet av oss, [ ,,,0],17] var svært nøyaktige og pålitelige prediktorer for aktiv siRNA [18], [19]. DSIR er basert på en lineær modell som kombinerer spesielle nukleotider ved gitte posisjoner og bestemte motiver på siRNA guide-strand, inkludert to-nt overheng på 3 «enden [17]. Denne kombinasjonen gir effektiv siRNA, sannsynligvis på grunn av høy forekomst av RISC bindende og /eller Ago2-mediert spalting av målet mRNA komplementære tråden [18].
Men egenskaper som er avgjørende for optimal prediksjon av effektiv siRNA er omdiskutert [13], [14], [20]. Derfor, til tross for disse forbedringene, er det fortsatt ikke bestemt hvilke algoritme og web-verktøyet er optimal, og hvor godt spådd sirnas oppfører seg i realistiske eksperimentelle forhold. På den ene side, er ingen av tiden tilgjengelige siRNA designmetoder dekker hele siRNA-maskineri prosess. Så selv om den relative bidraget av funksjoner som siRNA effektivitet, spesifisitet eller mål tilgjengelighet har blitt gransket uavhengig for sin rolle i den resulterende endelige knockdown, en enkelt global studie har ennå ikke utført. På den annen side har meget heterogene datasett blitt brukt til å utforme de fleste av disse beregningsmodeller som forutsier effekt siRNA [21]. Disse datasettene ble oppnådd ved hjelp av ulike metoder for å måle mRNA knockdown, forskjellige siRNA konsentrasjoner og lengder (fra 19 til 21 nt), og brukes ulike celletyper eller transfeksjon systemer. Alle disse forskjeller er oppsummert i tabell 1. Spesielt, Huesken datasettet, ofte brukt for å utvikle siRNA konstruksjons algoritmer [15], [16], [17], [22], ble fremstilt ved bruk av et plasmid som koder for både et eksogent reporter-gen bærende mål cDNA innsatser med sin 3 «utranslatert region (UTR), og en referanse-genet [15]. Målesystemet kan ikke være hensiktsmessig når undersøker hvordan en siRNA oppfører seg mot sin mRNA målet i sitt naturlige mobilnettet miljø. Et annet problem som oppstår når du kombinerer data fra heterogene kilder er mangelen på detaljert informasjon om målet sekvens [23].
For å evaluere nøyaktigheten av automatiserte siRNA designverktøy i en realistisk eksperimentell miljø, fokuserte vi på den DSIR designverktøy og systematisk undersøkt hvor godt den oppfører seg i «real-life» ved å måle mRNA knockdown i et standardisert cellebasert assay. For å gjøre dette, vi etablert en kontrollert, normalisert eksperimentell prosedyre for siRNA transfeksjon og kvantitativ real-time time PCR (QRT-PCR) målinger. Vi vurderte stanse potens av et sett med DSIR designede, 21-nt siRNA duplex sekvenser rettet mot ti humane kreftrelaterte målgener. Ved hjelp av denne tilnærmingen, kvantifisert vi den generelle prediktiv kraft av siRNA utformingen algoritmen DSIR. Det er også mulig for oss å ytterligere undersøke faktorer potensielt forbedre DSIR ytelse.
Materialer og metoder
1 Mål og siRNA Selection
Vi i utgangspunktet valgte åtte menneskelige gener som er kjent for å være nøkkelen molekylær komponenter i celletransformasjon og kreftprosesser (tabell 2). Disse genene ble beholdt for terapeutisk evaluering i prekliniske studier knyttet til ulike tumormodeller av «siRNA konsortium», et prosjekt finansiert av Ligue Nationale Contre le Cancer. siRNA rettet mot regioner av den fulle lengde mål-mRNA-sekvens ble utformet med DSIR. Den 21-nt modell inkludert to-nt 3 «overheng [17]. sirnas med mer enn 80% av forventet utryddelse aktivitet ble beholdt, uten å forkaste siRNA inneholder polynukleotid traktater. Blant disse siRNA sekvenser, siRNA som overlappet eller var altfor stenger linjeavstand på målse ble ikke beholdt hvis mulig. Den siste settet besto av 88 siRNA tomannsboliger. En positiv kontroll siRNA rettet mot CSNK2B (tidligere validert etter [24]), og en negativ kontroll siRNA mot GFP ble også inkludert i denne første listen over siRNA.
I en ny runde med forsøk, en ekstra sett av 40 siRNA rettet mot to av de åtte gener målrettet i første runde, ERCC2 og HDAC6, og to nye mål gener, PARP1 og DNA Ligase 1 (LIG1) ble fremstilt. Dette settet ble brukt til å kontrollere bidrag av iboende mål funksjoner identifisert under den første runden av eksperimenter. Kriteriene for siRNA inkludering i andre runde var: 80% utryddelse aktivitet spådd av DSIR, en plassering i den kodende sekvensen (CDS) en del av målet, ingen polynukleotidsekvenser traktater og ingen potensielle off-mål tillatt, en utvidet panel av målnettsteder ved komplementær dekning av den samlede transkript-sekvensen med hensyn til siRNA sekvens utformet for det første settet. Detaljer om de to settene med siRNA er oppført i tilleggs Tabell 1.
siRNA syntese.
Alle siRNA for knockdown av de ti menneskelige gener ble syntetisert som tomannsboliger med SIGMA Proligo som 21 mers ( Tilsetnings Tabell S2).
2 Cellekultur og Transfeksjon
HeLa-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin, i en fuktet inkubator ved 37 ° C i 5% CO
2. Omtrent 1 x 10
5-celler ble inokulert i 12-brønners plater og dyrket i 24 timer. Medium ble endret til 0,4 ml OPTI-MEM (Gibco) før transfektere celler med 20 nM siRNA bruker Oligofectamine (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Transfekterte celler ble inkubert i 5 timer. Cellene ble deretter vasket en gang med PBS, DMEM 10% FBS ble tilsatt, og cellene ble dyrket i ytterligere 72 timer (bortsett fra BCL2L1 hvor cellene ble dyrket i bare 24 timer).
3 Sanntids-PCR-analyse Målinger og
Tre dager etter siRNA transfeksjon ble cellene høstet og RNA ble isolert ved anvendelse av RNA Helt miniprep-sett (Stratagene). RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av en Nanodrop. Reverse Transcription ble utført med StrataScript QPCR cDNA Synthesis kit (Stratagene), i henhold til produsentens instruksjoner. Genspesifikke primere (forover og bakover) ble utformet for å være kompatibel med en enkelt QRT-PCR termiske profil slik at multiple transkripter kunne analyseres samtidig. PrimerQuest (https://www.idtdna.com/SCITOOLS/Applications/PrimerQuest/) ble brukt for deres utforming. Primer sekvenser er oppført i Tilleggs Tabell S2. Kvantitativ PCR ble utført med FullVelocity SYBR grønn QPCR Master Mix ved hjelp av primer-konsentrasjonene angitt i tabell 2. PCR-betingelsene (primer konsentrasjoner, cDNA mengde) ble optimalisert og PCR-effektivitet ble bestemt for hvert mål-genet. PCR-reaksjonsblandingen (25 pl) ble plassert i Mx3000P instrument hvor de gjennomgikk følgende sykkel program, optimalisert for en 96-brønns blokk: 95 ° C i 5 minutter, umiddelbart etterfulgt av 45 sykluser med 10 sek ved 95 ° C og 30 sek ved 60 ° C. Ved slutten, ble PCR-produktene dissosiert ved inkubering i 1 minutt ved 95 ° C og deretter 30 sekunder ved 55 ° C, etterfulgt av en økning til 95 ° C. PCR kvalitet og spesifisitet ble bekreftet ved å analysere dissosiasjonskurve. For hvert sett av primere, ble et nei-mal kontroll (NTC) og en nei-reverse-forsterkning kontroll (NAC) inkludert. QRT-PCR-reaksjoner ble kjørt i triplikat, og kvantifisering ble utført ved hjelp av sammenlignende terskel-syklus-metoden. Kvantitative PCR data ble forhold analysert ved hjelp MxPro programvare (Stratagene, «Comparative Kvantifisering» program) med enten 36B4 eller hHPRT forsterkning signal som interne «normalizer» (for å korrigere for total RNA innhold) og merking mock transfekterte prøven som «kalibrator». Resultatene er uttrykt som relativ endring i ekspresjon sammenlignet med kontrollen. Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer for hver prøve.
4 Kvantitativ Real-time PCR data Normalisering og statistisk analyse
Hver PCR-kjøring inkludert tre biologiske replikater for hver behandling analysert. I tillegg ble alle forsøkene gjentatt tre ganger, uavhengig av hverandre, med ulike biologiske prøver. Hele prosedyren ble også utført to ganger, ved anvendelse av to forskjellige normaliserende gener. 18 utryddelse forholdet anslag
Q
* ble oppnådd fra disse data, basert på den følgende standard formel: hvor er den forsterkning hastighet på et tidlig stadium (ARES) av fremgangsmåten for målmolekylet er ARES for den normaliserende molekyl, er og
C
antall cykler som kreves for å oppnå en forhåndsdefinert nivå av signalet. Det ville ha vært praktisk å kombinere selvstendighet og homogenitet forutsetninger for å avgjøre tillit regioner. Men her denne prosessen er klart tvilsom, siden noen par av eksperimenter dele dimensjonerende forhold som andre ikke (for eksempel samme løp, eller samme normalisering genet). Av denne grunn ble en annen analyse utført, detaljene som kan finnes i det supplerende materiale. Extinction verdier for hver siRNA molekyl er gitt i Utfyllende tabell S3.
5 Western Blot analysen
Tre dager etter siRNA transfeksjon ble HeLa cellene høstet for protein utvinning i RIPA buffer (Tris HCl pH 7,4 10 mM, NaCl 150 mM, SDS 0,1%, Na-deoksykolat 0,5%, EDTA 1 mM, Triton X100 1%, Leupeptin 5 ug /ml aprotinin 5 ug /ml). Proteiner ble separert ved elektroforese på en 12% SDS-PAGE-gel før overføring til PVDF-membran i 1 time ved 100 V. primære antistoffer: polyklonalt antistoff CK2alpha (αCoc) [25] og monoklonalt HSP90 antistoff (klon 16F1 fra Stressgen) ble fortynnet 1 /500 i PBS inneholdende 3% ikke-fett melkepulver. Geit-anti-kanin eller anti-mus-IgG -peroxidase (Interchim) ble anvendt som sekundære antistoffer, fortynnet 1:5000 i PBS. Sekundære antistoff binding ble avslørt ved hjelp av ECL pluss reagenser (Amersham, #RPN 2105).
6 Statistiske analyser
påvirkning av ulike faktorer på siRNA effekten målt ble analysert ved montering lineære modeller og testing betydningen av hvert semester ved hjelp av R statistisk analyse programvare (https://www.r-project.org/). Betydningen av hver modell sikt og ekstra forklaringsvariabler ble testet ved bruk av ANOVA statistikk.
7 Sekundær Struktur Target mRNA og tilgjengelighets
Target nettstedet tilgjengelighet ble systematisk undersøkt enten ved hjelp av SFold webserveren ( https://sfold.wadsworth.org), hvor sannsynligheten profilen av forventet target tilgjengelighet kan kontrolleres visuelt ved hjelp av siRNA-modulen (se fig supplerende S2). Alternativt ble RNAplfold program (Wien pakke frigivelse 1.7.2) som brukes sammen med de tidligere definerte optimale sammenleggbare parametre (W = 80, L = 40 og u = 16), slik det er beskrevet i [22]. Jo høyere RNAplfold sannsynlighet, er det mer tilgjengelig målstedet. De RNAplfold sannsynlighetene for hver siRNA sekvens er oppført i Tilleggs tabell S3.
8 Potensielle Off-target Søk
Potential off-target genet knockdown ble oppdaget ved å bruke en in-house gjennomføringen av Wu -Manber algoritme, en variant av Baeza-Yates Skift-legge metoden [26]. I motsetning til Blast, utfører dette programmet en eksakt leting etter et gitt mønster (den korte siRNA sekvens) i en sekvens databank (NCBI RefSeq divisjon, slipper 32) åpner for uoverensstemmelser. I vår studie, ble standardverdien for antall uoverensstemmelser lov satt til tre, som anbefalt [13]. Identitet mellom mRNA og siRNA frø-regioner som omfatter nukleotider 2-8 antisensekjeden ble beregnet. Dette innebar å kjøre Wu-Manber implementering uten mismatch tillatt, og sjekke heptamer frø sekvenser mot en 3’UTR mRNA sekvens databank (bygget fra de menneskelige gener som er oppført i RefSeq, slipper 48). Antallet 3’UTR sekvenser matchet i det globale transkriptomet, antall frø matchende en 3’UTR sekvens ett, to og tre eller flere ganger er alle rapportert (tilleggs tabell S3). Disse egenskapene har blitt foreslått å være knyttet til RNAi off-mål [27], [28].
Resultater
1 Forsøksoppsett
Hovedmålet med denne studien var å vurdere effekten av siRNA sekvenser designet av DSIR. Effektiviteten ble vurdert endogent ved å måle prosentandelen av gjenværende ikke-spaltet mRNA i forhold til en kontroll, ikke-målrettede mRNA. En standardisert prosedyre ble etablert for å unngå skjevheter på grunn av eksperimentelle betingelser (dvs. celletype, transfeksjon forhold, konsentrasjon, kvantitativ sanntids RT-PCR, etc). I en første runde med eksperimenter, fokuserte vi på åtte mål gener knyttet til kreft. ERCC1 og ERCC2 er kjent for å være involvert i nucleotide excision reparasjon (NER) sti og er avgjørende for reparasjon av cisplatin-indusert DNA addukter (excision reparasjon kryss utfyller gnager reparasjon mangel) [29]. HDAC6 viser histon deacetylase aktivitet og undertrykker transkripsjon [30]. BCL2L1 (Bcl-X
L) er et antiapoptotic BCL-2 familiemedlem, og nøkkelen regulator i apoptotiske prosessen [31]. HIF1A (HIF1α) er en transkripsjonsfaktor indusert av hypoksi [32]. Til disse, tilsatte vi de tre underenheter av proteinkinase CK2, (i) CSNK2A1 (CK2α), (ii) CSNK2A2 (CK2α «) og (iii) CSNK2B (CK2β) [33]. Disse mRNA målgener er beskrevet, deres funksjoner, og tilsvarende antall siRNA reagenser testet er oppført i Tabell 2. Alle disse genene er naturlig uttrykt i humane HeLa celler, som er kjent for å være lett transfectable. Disse cellene ble valgt for å unngå eventuelle ytterligere variasjon på grunn av den transfeksjon trinn. For hvert mål, ble 10 eller flere 21-nt siRNA utformet med DSIR, og utvalgt som beskrevet i Materialer og Metoder. Gitt at en høy siRNA konsentrasjon kan føre til off-target effekter, og en lav konsentrasjon kan resultere i ikke-detekterbar genet Slå, vi rettet for et kompromiss ved å feste den siRNA-konsentrasjon på 20 nM. Fold-endringer i genuttrykk ble bestemt av ΔΔCt metoden, med normalisering til enten 36B4 eller HPRT vaktmester gener. Denne normalisering strategi basert på to referanse gener, har vist seg å være mer pålitelig enn normalisering med et enkelt referanse-genet [34]. HeLa celle transfeksjonseffektivitet ble kontrollert i alle eksperimentene ved å kvantifisere effekten av en tidligere validert siRNA [24] målretting CSNK2B. Forsøket ble betraktet som validert når den positive kontroll siRNA nedregulert CSNK2B med minst 80%. Vi har også utviklet en ny modell som gjør det mulig for normalisering med de to housekeeping gener, 36B4 og HPRT sammen. Vår analytisk tilnærming involvert normalisering ved hjelp av flere referanse gener og inter-run kalibrering. Dette bidro til å unngå feilspredning og avvik mellom platene (se detaljer i supplerende materiale). Til slutt, siden effekten av siRNA er til slutt nødvendig til produktnivå, ble et Western blot-assay for CSNK2A1 protein som brukes for å validere våre observasjoner. Alle disse resultatene og deres fullstendig analyse presenteres figur 1 for dette genet (og i supplerende figur S1 for andre målgener).
HeLa-celler ble transfektert med ti siRNA rettet mot CSNK2A, og to kontroll siRNA (GFP som en negativ kontroll og CSNK2B som en positiv kontroll) ved en sluttkonsentrasjon på 20 nM ved hjelp av Oligofectamine reagens. En ekstra kontroll besto i mock transfeksjon av celler (uten siRNA). Tre dager senere ble RNA og proteiner hentet for videre analyse. A. Effekt av siRNA behandling fra et typisk forsøk. For hver siRNA den relative mengden av målet mRNA til HPRT (svart) eller 36B4 (grå) ble plottet ved hjelp av komparativ analyse modul i MxPro programvare (Stratagene). B. Transfeksjon effektivitet kontroll. For hvert forsøk ble transfeksjonseffektiviteter kontrollert ved å kvantifisere gen stanse i forhold til en kontroll siRNA med kjent effektivitet. Resultater av eksperimenter hvor denne kontrollen ikke stillhet uttrykk med mer enn 70% ble ekskludert fra datasettet fordi transfeksjonseffektiviteten ble ansett for å være dårlig. C. Box plot representasjon av siRNA effektivitet i 10 sekvenser. For hver siRNA, effektivitet spådd av DSIR og målte effektiviteten er indikert. Målte virkningsgrad var statistisk bestemt fra triplikat RT-qPCR kvantifisering av mål-mRNA etter siRNA behandling, på grunnlag av tre uavhengige eksperimenter. Expression nivåer ble normalisert til HPRT (svart) og 36B4 (rød) vaktmester gener. Log (Q) = 1 representerer ingen reduksjon i mål mRNA etter behandling og log (Q) = 1/4 tilsvarer ca 75% effektivitet. Se avsnitt 2.6 for ytterligere detaljer om den statistiske analysen. Totalt siRNA effektivitet og betydning verdier er gitt i supplerende materiale. D. Western blot-analyse av stanse effektivitet, ved anvendelse av anti-CK2alpha antistoff. Protein lasting ble normalisert for HSP90 nivåer.
2 Vurdere DSIR Design by Måling siRNA aktivitet
Den globale siRNA virkningsgrad per target genet er oppsummert i tabell 3. For å evaluere hvor vellykket den DSIR designmodellen design sirnas, har vi utviklet et graderingssystem. sirnas som ga minst 70% målet genet knockdown ble ansett som svært effektiv; andre siRNA ble vurdert enten moderat effektiv (50-70%) eller ineffektiv ( 50%). Ifølge denne rangering, inneholder hele datasettet siRNA mer enn 56% effektiv, og 25% er moderat effektive siRNA. Denne suksessgrad viser at DSIR fungerer godt i det virkelige eksperimenter.
neste fokusert på hver skive separat for å bestemme suksessraten for utryddelse ved å telle antall effektive siRNA sekvenser over totalt antall siRNA testet for hvert gen (Tabell 3). Disse data viser en slående heterogenitet av suksessraten fra en mål-gen til den neste, noe som tyder på forskjellige reaksjoner på siRNA-mediert reaksjonsvei stanse. Faktisk QRT-PCR målinger av følgende karakterutskrifter, ERCC1, CSNK2B, CSNK2A1, CSNK2A2, avslører en tilfredsstillende lyddemping profil (med 9/10, 7/10, 7/10 og 10/10 effektiv siRNA, henholdsvis). I kontrast, ERCC2 og HDAC6 (4/15 og 3/13, henholdsvis) ser ut til å være ganske motstandsdyktig mot stanse, med bare noen få effektiv siRNA til tross for et høyere antall siRNA reagenser testet. Mellom suksess er observert for HIF1A og BCL2L1, med effektiv siRNA aktivitet i 5/9 og 7/12 tilfeller, henholdsvis. Dette i motsetning bildet fremhever at, i form av stanse, alle genene er ikke like. Dette var noe overraskende som uttrykk nivåer for alle disse målgener ble dokumentert til å være like lav. Derfor, hvis vi forkaste målgener som er mest ildfast å stanse, ERCC2 og HDAC6, spår DSIR mer enn 70% effektive siRNA sekvenser. Disse observasjonene markere ikke-ubetydelig rolle målet mRNA ved vurdering av beregningsmodeller forutsi siRNA effekt.
3 Forholdet mellom siRNA Effekt og potensial off-target effekter
Det er vist at siRNA kan ikke-spesifikt mot urelaterte gener presentere bare delvis sekvens komplementaritet. Dette er kjent som off-target-effekter (OTE). To typer av ERK er nå skilles [35]. Den første av disse er OTE formidlet av Ago2 handler på mål som er svært lik den faktiske siRNA mål. Dette synes å være meget potente, selv om denne typen av target-effekten er forholdsvis sjelden. Den andre typen OTE har blitt observert på mål som inneholder frø kampene i sin 3’UTR region [36]. Dette innebærer en mekanisme som synes å være lik den til regulering miRNA [27], [36], [37]. Siden OTE kunne gjøre rede for lavere effektivitet av en utvanningseffekt, undersøkte vi dette aspektet ved systematisk screening hver siRNA for potensielle off-er rettet mot områder. Først, observerte vi at hverken antallet partielle komplementære off-mål, eller de determinanter som er knyttet til frøet komplement frekvens klasse signifikant relatert til siRNA effektivitet (se nedenfor 3.4). I tillegg Du et al. [38] rapporterte at posisjonen av mistilpasning i duplex og identiteten av basen som utgjør den mistilpasning kan påvirke siRNA funksjonalitet. For å studere effekter av mismatch mellom siRNA og mRNA mål mer presist i forhold til RNAi stanse aktiviteten, vi fokusert på kryssreaksjon som kan eksistere mellom CSNK2A2 genet målet og siRNA rettet mot CSNK2A1, der tre siRNA sekvenser fra vår datasett ( si_031, si_034 og si_035) har blitt identifisert som å ha potensiell ERK (se figur 2A). Selv om disse tre siRNA har vist seg å drastisk redusere CSNK2A1 uttrykk, ingen av dem hadde noen effekt på nivået av CSNK2A2 transkript, som åpenbart av QRT-PCR (se figur 2B). Videre har vi lagt merke til at plasseringen av uoverensstemmelser for hver siRNA guide-strand sekvens (si_031: 6,19,21; si_034: 3,6,12; si_035: 2,5,8) innenfor CSNK2A2 transkripsjon var ikke nødvendigvis i avtale med tolerposisjonsavhengig uoverensstemmelser beskrevet tidligere [38]. For eksempel ble stilling 12 funnet å være svakt tolereres, mens posisjonene 1, 2, 5, 7, 8, 18 og 19 ble funnet å være godt tolerert. I vårt tilfelle, det aktive siRNA (si_035) inneholder tre høy toleranse posisjoner som også kunne ha forårsaket CSNK2A2 knockdown. Men ingen effekt ble observert. Dette tyder på at denne kombinasjonen ikke tolereres, eller at OTE skyldes nesten perfekt komplementaritet er mye mer kompleks.
A. Tre siRNA sekvenser rettet mot CSNK2A1 identifisert som potensielle off-mål for CSNK2A2, med tre uoverensstemmelser på ulike posisjoner (med små bokstaver). Jakten celler ble transfektert med tre siRNA mot CSNK2A1 (CK2α) (si_31, si_34 og si_35), eller mot CSNK2A2 (CK2α «) (si_41) og GFP kontroll siRNA. Alle sirnas ble anvendt ved en sluttkonsentrasjon på 20 nM, og transfektert ved hjelp av Oligofectamine reagens. Mock transfekterte celler (uten siRNA) ble også inkludert. Tre dager senere, RNA ble ekstrahert for videre analyse. B. Relativ CSNK2A2 mRNA mengden bestemmes av QRT-PCR. For hver siRNA, mengde målet (eller off-target) mRNA i forhold til HPRT (svart) eller 36B4 (grå) ble plottet.
En annen måte å redusere OTE er å senke siRNA konsentrasjon. Vår validering ble utført med 20 nM siRNA, men vi også testet lavere mengder for å ytterligere vurdere effektive sekvenser. Som vist i figur 3, konsentrasjoner så lave som 1 nM er like effektiv som 20 nM for tre siRNA sekvenser rettet mot CSNK2B og to siRNA sekvenser rettet mot LIG1 (genet target tilsatt i den andre runden av tester, se nedenfor). Disse resultatene indikerer at siRNA designet av DSIR kan være kraftig, selv i «fysiologiske» forhold, hvor konsentrasjonen kan være så lav som 1 nM.
En rekke konsentrasjoner av tre sirnas rettet mot CSNK2B, alle med høy effektivitet global (siRNA_26, _29 og si_30) (panel A), og to siRNA rettet mot LIG1 (siRNA_133 og _137) (panel B) ble transfektert inn i HeLa-celler for å bestemme forholdet mellom totale effektiviteten og mengden transfektert. siRNA_GFP ble anvendt som en negativ kontroll. Diagrammet viser gjennomsnittsverdier +/- standardavvik fra RT-qPCR kvantifisering av to uavhengige forsøk normalisert til HPRT vaktmester-genet.
4 Utforske funksjoner som påvirker siRNA Potens
alle de siRNA utformet ved hjelp av DSIR hadde en anslått styrke på minst 80%. Bidraget og betydning av flere tidligere publiserte siRNA design kriterier eller faktorer som antas å spille en rolle i genet stanse, og som ikke er eksplisitt tatt hensyn til av DSIR modell, ble analysert. Påvirkningen av noen av disse funksjonene på de variasjonene som observeres i efficacies av de 88 siRNA testet i den første runden av eksperimentene ble analysert. For å gjøre dette, må vi først montert en lineær modell for å forklare siRNA efficacies målt som en funksjon av 13 funksjoner: (1) DSIR score, (2) målgenet, (3) posisjonen i målet genet (i bp relativ til 5’end), (4) plasseringen i målet genet (5 «UTR, CDS eller 3» UTR), (5) antall potensielle off-mål for siRNA, (6) fravær eller tilstedeværelse av et polynukleotid kanalen (med = 4 identiske påfølgende nukleotider) i siRNA, (7) antall treff for siRNA på global menneskelig transkriptom, (8-10) antall mRNA sekvenser matching i sin 3’UTR region , (11) lengden av target ekson, (12) nærværet av en ekson-ekson krysset ved målstedet, og (13) målstedet tilgjengelighet, beregnet som beskrevet i Materialer og Metoder. All denne informasjonen er gitt i supplerende tabell S3. ANOVA tester med en betydning terskelen på 5% for P-verdiene viste at bare tre av disse tretten kovariater korrelerte signifikant med effekt; disse var som følger: identiteten av målgenet, posisjonen i målgenet, og plasseringen i målgenet (som definert ovenfor). Spesielt i det smale området over 80%, DSIR stillingen synes ikke å være signifikant korrelert til effekten måles, noe som antyder at det bør brukes bare for å velge siRNA over en terskel, men ikke for å rangere dem. Videre er ingen av de andre kovariabler som er foreslått som konstruksjonskriterier (antall off-mål, nærværet av et polynukleotid tarmkanalen, målsete tilgjengeligheten) viste noen tegn på å være i stand til å forutsi effekten målt i vår sett siRNA (ikke vist ).
Vi har derfor re-estimert en lineær modell med bare tre betydelig medvirkende kovariater. Først, plasseringen av målet området i 5 «UTR, CDS eller 3» UTR har en betydelig innvirkning på effektiviteten måles (Pval 0,0003).
