Abstract
Hunder med naturlig forekommende kreft representerer en viktig stor dyremodell for legemiddelutvikling og testing nye immunterapi. Imidlertid har dårlig definerte immunophenotypes canine leukocytter begrenset studiet av tumor immunologi i hunder. Oppbyggingen av myeloide avledet suppressorceller (MDSCs) er kjent for å være en viktig mekanisme for immunsuppresjon i tumorbærende mus og i humane pasienter. Vi har søkt å identifisere MDSCs i blodet til hunder med cancer. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra hunder med avansert eller tidlig fase kreft og fra alderstilpassede friske kontroller ble analysert ved hjelp av strømningscytometri og mikroskopi. Undertrykkende funksjon ble testet i T-celleformering og cytokin utdypning analyser. Semi-kvantitativ RT-PCR ble anvendt for å identifisere mulige mekanismer som er ansvarlig for immunsuppresjon. PBMC fra hunder med avansert eller metastatisk kreft viste en signifikant høyere andel av CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler sammenlignet med hunder diagnostisert med tidlig stadium ikke-metastatiske svulster og friske hunder. Disse CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler utgjør en undergruppe av aktiverte granulocytter som co-renser med PBMC, display polymorfonukleære granulocytter morfologi, og demonstrere en potent evne til å undertrykke spredning og IFN-γ produksjon i T celler fra normale og tumorbærende donorer. Videre disse cellene uttrykte kjennetegn undertrykkende faktorer for menneskelig MDSC inkludert ARG1, iNOS2, TGF-β og IL-10. Oppsummert våre data viser at MDSCs akkumuleres i blodet hos hunder med fremskreden kreft og kan måles ved hjelp av denne tre-markør immunfenotypen, og dermed muliggjør prospektive studier som kan overvåke MDSC byrde
Citation. Goulart MR, Pluhar GE , Ohlfest JR (2012) Identifisering av myelogen Avledet suppressor celler i Hunder med naturlig forekommende kreft. PLoS ONE 7 (3): e33274. doi: 10,1371 /journal.pone.0033274
Redaktør: Sophia N. Karagianniss, Kings College London, Storbritannia
mottatt: 28 oktober 2011; Godkjent: 10 februar 2012; Publisert: 13 mars 2012
Copyright: © 2012 Goulart et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til Dr. Ohlfest fra National Institutes of Health (NIH R21-NS055738), og American Cancer Society (RSG-09-189-01-LIB). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er den ledende dødsårsaken hos voksne hunder i USA, Australia, Japan og Europa og regnes som den store helsevesenet bekymring for hundeeiere. Omtrent fire millioner hunder er diagnostisert med kreft hvert år i USA [1]. Naturlig forekommende malignances i hunder deler mange funksjoner med menneskelige kreftformer inkludert lignende tumorbiologi, genetikk, forekomst, histologisk utseende, og respons på konvensjonelle behandlinger (anmeldt i [2]). Tumorer hos hunder videre forholdsvis raskere enn de samme sykdommer hos mennesker, slik at spørsmål knyttet til behandlingseffekt (progresjon og overlevelses) løses raskere i hunder. En viktig fordel med hund-modell er muligheten til å teste eksperimentelle terapeutiske midler ved humane skala doser i innstilling av minimal restsykdom, som er vanskelig å gjøre på en meningsfylt måte i små gnagere som har relativt raske tumorvekstkinetikk. I tillegg, fordi standarden på omsorg for de fleste hunde svulster er dårlig etablert, er det mye mer fleksibilitet i studie design i forhold til kliniske studier. Sammen disse funksjonene gjør hunden en fremragende plattform for translasjonell medisin.
Pet hunder med kreft er raskt blitt et viktig verktøy som brukes i legemiddelutvikling. En av de beste eksemplene på dette er den siste parallell utvikling av SU11654, en multi-målrettet tyrosinkinasehemmer, og sunitinibmaleat (SU11248). Begge stoffene er potente hemmere av PDGFR, VEGFR, KIT, og FLT3. Studier hos hunder med forskjellige faste tumorer viste at plasmakonsentrasjonen av SU11654, mutasjons status av KIT, og inhibering av KIT fosforylering var sterkt prediktivt for klinisk effekt. Optimal dosering parametere og toksisitet ble etablert i hunder også. Disse banebrytende studier i stor grad til rette for videre utvikling av hele denne klassen av narkotika, særlig godkjenning av sunitinibmaleat av US Food and Drug Administration for behandling av nyrecellekreft (RCC) og gastrointestinal stromal celle svulster, som ofte inneholder lignende KIT mutasjoner [3]. Det ble senere kjent at sunitinib markert utarmer MDSCs og gjenoppretter T-celle funksjon i menneske RCC pasienter [4], en observasjon som ikke kunne vært gjort i hunder på den tiden på grunn av begrenset canine reagenser og dårlig definerte markører for canine leukocytter. Vi, og andre, skal teste nye immun-basert terapi hos hunder med ulike kreftformer, men immun overvåking i disse studiene har blitt forvirret av det samme problemet. For å sette feltet i perspektiv, har en overflate immunfenotypen for canine naturlige drepeceller ikke er definert, MHC alleler er dårlig forstått, og mange av de merkene som brukes er avhengige av kryssreaktive antistoff hvor spesifisitet må testes empirisk. Det er avgjørende at nye reagenser blir utviklet og at immunophenotypes av alle store hjørnetann leukocytter delsettene blir bestemt. Legging denne grunnleggende fundament vil tillate unik innsikt til å bli gjort etter hvert som nye små molekyl narkotika og immunterapi er testet hos hunder som et forspill til menneskelige forsøk.
Oppbyggingen av MDSCs i tumorbærende mus og mennesker med kreft er kjent å være en viktig mekanisme for tumor unnslippe fra immunovervåkning [5], [6], [7]. MDSCs omfatter en fenotypisk heterogen populasjon av myeloide celler i tidlige stadier av differensiering som utvider i kreft og mange andre patologiske tilstander, og har en potent evne til å undertrykke T-cellefunksjonen, spesielt T-celleformering og effektor cytokinproduksjon [6], [8] . MDSCs kan deles inn monocyttiske og granulocytiske subtyper. En kilde til uenighet i dette feltet er at MDSC heterogenitet har gjort sammenligninger mellom kreftpasienter og murine tumormodeller utfordrende (se referanse [9] for utmerket perspektiv). De molekylære mekanismer som MDSCs inhiberer T-cellefunksjonen er under undersøkelse. Studier har implisert oppregulering av arginase 1 (ARG1), induserbar nitrogenoksidsyntase (iNOS2) og reaktive oksygenarter (ROS) som viktige faktorer for MDSC-medierte immun-suppresjon [8], [10], [11]. ARG1 kan dypt påvirke T-celle funksjon på svulststedet ved L-arginin utarming, utløser aminosyren sult svar og apoptose i lymfocytter [7]. En annen mekanisme for immunsuppresjon er kjemokin nitrering, som demper effektor-T-celle-infiltrasjon i tumorstedet [12]. Videre er MDSC utvidelse assosiert med nedregulering av L-selektin på CD4
+ og CD8
+ T-celler [13]. Dette reduserer T celletrafikken til sekundære lymfeorganer hvor tumor-reaktive T-celler kan være primet [13]. På grunn av evnen til MDSCs til å nedregulere immunrespons mot tumorer i mus og i mennesker, hypotese vi at disse cellene vil også spille en viktig rolle i tumor-indusert immunsuppresjon hos hunder med cancer. Derfor er målet med denne studien var å identifisere overflatemarkører som preger eksistensen av MDSCs hos hunder.
Materialer og Metoder
Studiepopulasjon og prøvetaking
Beskrivelsen av alle hunder i denne studien er oppsummert i tabell 1 og 2, med mer informasjon gitt i tabell S1 og S2.
Tabell S3 er en oppsummering av prøvene analysert i hver figur. Kliniske data ble hentet fra pasientjournaler. Kontroll hundene var bestemt på å være sunn basert på fysisk undersøkelse, eier observasjoner og fullstendig blodtelling eksamener. For hunder med kreft, ble diagnosen og svulst staging basert på komplette fysiske undersøkelser, histopatologi av tumorbiopsi-prøver, blodprøver og spesialiserte imaging tester, for eksempel CT skanner, ultralyd eller røntgen, for å vurdere svulst plassering og størrelse, samt tilstedeværelse av metastatisk sykdom. Hunder med store, nekrotiske eller flere masser, lytisk eller alvorlig bein ødeleggelse (med osteosarkom) eller tilstedeværelse av metastaser, ble plassert i avansert stadium /metastatisk gruppe. Dyr presenterer med små masser eller ingen metastatiske noduler ble plassert i et tidlig stadium ikke-metastaserende gruppe. Tabeller S1 og S2 lister også detaljer om noen behandling som hunder med kreft hadde fått før eller ved tidspunktet for blodprøvetaking for denne studien.
Blodprøver fra både kreft og friske kontroll hunder ble oppnådd spesielt for denne studien . Prøvene ble samlet i hepariniserte rør ved onkologi og fellesskaps praksis Tjenester av Veterinary Medical Center ved University of Minnesota i henhold til Institutional Animal Care og bruk komité retningslinjer. Prøvene ble trukket etter at eierne signerte klienten samtykkeskjema. Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) og godkjent studie med tittelen som «Flowcytometriske immunfenotyping av perifere blodceller hos hunder» via utpekt medlem gjennomgang under kodenummeret 0912A75493. Med mindre annet er uttrykkelig oppgitt, blir cellene analysert for dette manuskriptet co-renset med perifere mononukleære blodceller (PBMC) av hunder med kreft eller alderstilpassede friske kontroller som ble isolert ved hjelp av Ficoll (Sigma) gradient sentrifugering som følger. Heparinisert perifert blod ble fortynnet 1:03 med sterilt PBS (Invitrogen) og lagt over Ficoll-Histopaque (Sigma). Prøvene ble sentrifugert ved 400 x g i 30 min. De oppsamlede ved grenseflaten PBMC ble overført til et nytt rør, vasket to ganger med PBS og resuspendert med frysing oppløsning bestående av 90% føtalt bovint serum (Invitrogen) 10% dimetylsulfoksid (DMSO) (Sigma) og deretter fryses ved -80 C. Til slutt, PBMC ble tint i 2 minutter i et 37 ° C vannbad før farging og analyse. For analyse av ferske prøver ble PBMC isolert som ovenfor, resuspendert i FACS buffer, farget med antistoffer og umiddelbart analysert ved flowcytometri eller FACS som angitt.
flowcytometrisk analyse
PBMC prøvene ble isolert fra friskt blod eller tint og resuspendert i FACS-buffer. Ikke-spesifikk binding ble blokkert ved forbehandling av cellene med 10 pg /ml canine gamma-globulin (Jackson Immunoresearch) i 20 minutter ved romtemperatur. Celler ble først merkes ved hjelp av indirekte farging med 0,1 ug av ukonjugert mus anti-hund CD11b antistoff (klon CA16.3E10, ABD Serotec) eller lgG1 isotype kontroll (ABD Serotec) og 0,5 ug av PE-konjugert geit F (ab «) 2 anti -mouse IgG (Abcam) sekundært antistoff ved 4 ° C i 30 minutter i et mørkt rom. Etter indirekte farging ble cellene vasket to ganger og farget med 0,3 pg av FITC-konjugert anti-rotte hund MHCII (klon YKIX334.2, ABD Serotec) og 0,15 ug av kryss-reaktive, Alexa 647 fluor-konjugert mus-anti-human CD14 antistoff (klone TÜK4, ABD Serotec) eller isotypes kontroller ved 4 ° C i 30 min i et mørkt rom i henhold til produsentens protokoll. Antistoff-merkede celler ble vasket to ganger og resuspendert i FACS-buffer. Celler ble inkubert i 10 minutter ved romtemperatur i mørke med 7-amino-actinomycin D (7AAD, sluttkonsentrasjon på 1 pg /ml, Calbiochem) og deretter analysert på et Becton Dickinson Canto tre-laser strømningscytometer. Data ble videre analysert med FlowJo programvare (Tre stjerne). Analyse portene ble satt basert på 7AAD negative befolkningen. Prosentandelen av MDSCs ble beregnet basert på prosentandelen av CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler i den totale levende PBMC befolkningen. I ett eksperiment (figur S1), anti-muse-PE-konjugert CD11b (klon M1 /70 eBioscience) og anti-mus APC-konjugert Gr-1 (klon RB6-8C5 eBioscience) antistoffer ble også brukt til å verifisere kryssreaktivitet med hund celler.
isolering av MDSCs, PMN og T-celler
for funksjonelle analyser, RT-PCR og celle morfologi analyse, ferske blodprøver fra en svulst bærende hund ble brukt til isolering av CD11b
+ CD14
-MHCII
– eller CD11b
+ CD14
+ MHCII
– celler, som vist, ved hjelp av en BD FACSAria celle sorter. For T-celle isolasjon, ble PBMC isolert som tidligere beskrevet fra friske blodprøver av friske hunder og farget med 0,3 mikrogram av FITC-konjugert mus anti-hund CD3 (klon CA17.2A12, ABD Serotec), 0,15 ug Pacific blue-konjugert mus anti-hund CD4 (klone YKIX302.9, ABD Serotec) og 0,15 ug Alexa700 konjugert mus anti-hund CD8 (klone YCATE55.9, ABD Serotec) antistoffer. Polymorfonukleære leukocytter (PMN) ble renset fra cellepelleten av en Ficoll-gradient fra friskt hundeblodprøver, etter fjerning av PBMC (øverst i gradienten) og erytrocytter av RBC lyseringsbuffer (eBioscience).
Ex Vivo
Proliferation
Analyse av MDSC hemmende aktivitet på T-celledeling ble målt ved
3H-tymidin inkorporering i DNA. Kort sagt ble PBMC fra de angitte hundene sådd ut i U-bunn 96-brønners plater (5 x 10
4cells /brønn) i medium bestående av RPMI 1640 inneholdende L-arginin (150 pM) (Invitrogen) supplert med penicillin /streptomycin (Invitrogen) og 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Invitrogen) ved 37 ° C, i en 5% CO
2 inkubator. CD11b
+ CD14
-MHCII
– eller CD11b
+ CD14
+ MHCII
– celler fra en hund med kreft ble sortert og lagt til kreft (autologe) eller friske responder PBMC som angitt. Concanavalin A (5 mikrogram /ml) (Sigma) og rekombinant humant IL-2 (10 IE /ml) (R primer sekvenser for husholdningsgenet ble konstruert fra hjørnetann β-aktin-genet ved hjelp Primer3Plus (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). For påvisning av cytokinene IL-10 og TGF-β, primer sekvenser av IL-10 og TGF-β ble oppnådd fra publiserte kilder [14]. BLAST-algoritmen (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ble anvendt for å sikre primer spesifisitet til målgenet. Først cDNA syntese ble gjort ved hjelp av en QuantiTect Reverse Transcription (Qiagen). De to-trinns PCR-reaksjonen ble utført i en 12,5 ul volum inneholdende 2 x SYBR grønn masterblanding (Quanta Biosciences), 0.675U GoTaq Polymerase, 2 nM MgCl
2 (Promega), 0,2 mM dNTP (Stratagene), 0,2 uM av hver primer-par og 50 ng av cDNA-templat. Reaksjonsbetingelsene besto av innledende denaturering ved 94 ° C i 2 minutter, deretter sykluser med denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 60 ° C i 45 s, forlengelse ved 72 ° C i 45 s og endelig forlengelse ved 72 ° C i 5 minutter i en DNA-motor Thermal Cycler (Bio-Rad). Den optimale varmebehandlingstemperaturen for hvert primerpar ble etablert før studien (se Primersekvensene i tabell S4). PCR produktene ble kjørt på 2% agarosegel som inneholder 0,5 mL /ml etidiumbromid og fotografert etter 590 nm ultrafiolett lys på et Eagle Eye II bilde stasjon (Stratagene). Negative kontroll reaksjoner ble utført ved hjelp av RNA som ikke ble utsatt for revers transkripsjon PCR.
Statistical Analysis
Forskjellene mellom to gruppene ble analysert ved hjelp av uparet, tosidige Student
t-test
. Alle testene ble utført med Prism 4 programvare (Graph Pad Software, Inc). P-verdier 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
Hunder med avansert kreft har forhøyede nivåer av granulocytic CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler. at samtidig rense med PBMC
Perifere blodprøver fra 45 hunder diagnostisert med kreft og 18 friske kontroll hunder ble samlet (tabell 1 og 2). Alle hunder med kreft gikk klinisk iscenesettelse av sin sykdom ved å utføre komplette fysiske undersøkelser, blodprøver, mammografi for å vurdere svulst plassering og størrelse og metastaser, og histopatologisk diagnose laget av diagnostisk eller biopsi av svulsten. Blant de 45 hundene diagnostisert med kreft, ble 30 hunder klassifisert som å ha avansert eller metastatisk sykdom og 15 hunder ble klassifisert som tidlig stadium /ikke-metastatisk eller lav karakter sykdom basert på kliniske stadieinndeling. Hver gruppe ble videre inndelt i henhold til histologisk diagnose inn sarkomer, karsinom eller mast celle svulster (beskrevet i tabell S1 og S2). Prosentandelene av putative MDSCs hos hunder med cancer og sunne hunder ble evaluert ved flow cytometri. PBMC fra hunder med avansert eller metastatisk kreft viste en markant økning i CD11b
+ CD14
-MHCII
– brøkdel av celler, som står for det meste av cellene i live celle gate, sammenlignet med hunder diagnostisert med tidlig stadium ikke-metastatiske svulster eller friske hund kontroller (fig. 1a). Denne undergruppe av celler oppviste en polymorfonukleære granulocytisk morfologi ved heterogene faser av utviklingen (Fig. 1B), som ligner en granulocytisk undergruppe av MDSCs identifisert i mus [15] og mennesker [16].
PBMC fra friske hunder og hunder med kreft ble farget for myeloid markør CD11b, monocytic markør CD14 og MHC II. (A) Representant flowcytometrisk analyse av fremover og sidespredning og inngjerdet CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler fra hunder med avansert eller metastaserende svulster i forhold til hunder med tidlig stadium ikke-metastatiske svulster og sunn kontroll hunder. Tomter er representative for hund med avansert metastatisk hemangiosarcoma (øverst), tidlig stadium blære overgangsordning celle karsinom (i midten) og en frisk hund. (B) FACS sortert CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler ble farget med diff-rask for cellemorfologi evaluering. Et representativt eksempel på polymorfonukleære granulocytter morfologi CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler er vist på 63 × forstørrelse
Hunder med avansert eller metastatisk kreft hadde en betydelig større. fraksjon av antatte MDSCs (36,04 ± 2.542, gjennomsnitt ± SEM) i forhold til hunder med tidlig stadium ikke-metastatiske tumorer (9,40 ± 0,953, gjennomsnitt ± SEM) og friske kontrollhunder (10,24 ± 1.412, gjennomsnitt ± SEM) (fig. 2A). Dessuten, denne høyden i CD11b
+ CD14
-MHCII
– brøkdel så ikke ut til å være begrenset til en bestemt tumortype. Forskjellene var statistisk signifikante i hunder med sarkomer, karsinomer, og mastcelle tumorer sammenlignet med friske kontroller (fig. 2B). Motsatt, prosentandelen av CD11b
+ MHCII
– celler som gjorde uttrykkelig CD14 var ikke signifikant forskjellig mellom en gruppe. Derfor hyppigheten av CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler som co-rense PBMC korrelerer med tumorbyrde. Dette funnet er i samsvar med tidligere publiserte data om MDSC nivåer og tumorbelastning i mus og mennesker [17], [18].
(A) Analyse av gjennomsnittlig CD11
+ CD14
-MHCII
– befolkning frekvens hos hunder med avansert stadium eller metastatiske tumorer (n = 30) sammenlignet med tidlig stadium ikke-metastatiske tumorer (n = 15) og kontroll hunder (n = 18). Det var en betydelig høyere andel av CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler hos hunder med avansert kreft versus tidlig stadium ikke-metastatiske svulster og friske hunder (36.04% vs 9,40% and10.24% . henholdsvis B) Gjennomsnittlig CD11b
+ CD14
-MHCII
– befolkning frekvens i de store kreft undergrupper: avansert stadium eller metastatisk sarkomer (n = 18), tidlig stadium ikke-metastatisk sarkomer (n = 6) , avansert stadium eller metastatisk karsinom (n = 7) tidlig stadium ikke-metastatisk karsinom (n = 7), avansert stadium eller metastatiske mast celle svulster (n = 5) og tidlig stadium ikke-metastatisk mast celle svulster (n = 2) sammenlignet med kontrollhunder (n = 18). Betydelig forhøyede prosent ble påvist i alle avanserte svulster undergrupper i forhold til tidlig stadium svulster og friske hunder. Prosenter av CD11b
+ CD14
+ MHCII
– celler var ikke signifikant mellom gruppene (* viser P 0,001). Gjennomsnitt ± SEM vises
CD11b
+ CD14
-MHCII
-. Celler er funksjonelt definert som MDSCs
For å teste om CD11b
+ CD14
-MHCII
– undergruppe var i stand til å hemme T-celle funksjon, gjennomførte vi en rekke samarbeidskultur eksperimenter. Renset CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler fra tre forskjellige undertyper av kreft samtidig var dyrket med autologe eller sunne responder PBMC. I alle tilfeller, CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler utviste en potent evne til å undertrykke proliferativ respons på en doseavhengig måte. Representative eksempler på proliferativ undertrykkelse er vist ved hjelp av prøver fra en hund med tonsill- plateepitelkarsinom (fig. 3A) og prostata adenokarsinom (fig. 3B). For å bestemme om undertrykkelse var en artefakt av å bruke respondere fra tumorbærende hunder, vi analysert for proliferativ undertrykkelse ved hjelp av vanlige respondere. Tillegg av CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler, men ikke normale PMN, svekket spredning av PBMC fra friske hunder (Fig 3C.). Videre ble mengden av IFN-γ sekresjon vurderes i kondisjonert medium fra disse co-kulturer, avsløre at CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler, men ikke normale PMN, undertrykte utskillelsen av IFN -γ (fig 3D.)
CD11b
+ CD14
-MHCII
-. celler ble sortert fra perifer blodprøve av hunder med kreft og deretter co-dyrket med autologe PBMC (A , B) eller frisk hund PBMC (C) i nærvær av mitogen for 72 t. Representative eksempler fra i alt åtte hunder er vist. Grafene representerer proliferative responser etter tilsetting av CD11b
+ CD14
-MHCII
– isolert fra en enkelt hund med plateepitelkarsinom (3A), prostata adenokarsinom (3B) og osteosarkom (3C). Ikke-stimulerte PBMC ble brukt som negativ kontroll og PBMC stimulert i fravær av CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler ble brukt som positiv kontroll for spredning. PBMC ble også co-inkubert med PMN, for å kontrollere for tilstedeværelsen av ytterligere celler (3C, 3D). Proliferative responser ble målt ved
3H-tymidin inkorporering. CPM, teller per minutt. Mengden av IFN-γ sekresjon i ko-kulturen ble bestemt ved anvendelse av canine spesifikk IFN-y-ELISA-analyse (3D). Alle forsøk ble utført in triplo. Gjennomsnitt ± SEM vises.
MDSCs undertrykke både CD4
+ og CD8
+ T-celler
For ytterligere å avhøre den direkte effekten på T-lymfocytter, renset CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler fra en hund med osteosarkom ble ko-dyrket med renset CD4
+ og CD8
+ T-celler fra en frisk hund i 72 timer. Ikke-stimulerte celler og CD4
+ og CD8
+ celler ko-inkubert med friske PBMC ble anvendt som kontroller. Som forventet, CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler hemmet spredning av CD8
+ (Fig. 4A) og CD4
+ T-celler (Fig. 4B) mens PBMC fra en normal hund ikke. Samlet utgjør disse dataene viser at CD11b
+ CD14
-MHCII
-. Celler er faktisk funksjonelt definert som canine MDSCs
Facs sortert CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler isolert fra en hund med osteosarkom eller sunne PBMC ble co-inkubert med mitogen-stimulerte CD4
+ og CD8
+ T-celler isolert fra en frisk hund for 72 hs. Det er ingen stimulerte celler ble anvendt som negativ kontroll. Proliferative responser ble målt ved
3H-tymidininkorporering fra eksperimenter utført i tre eksemplarer. CPM, teller per minutt. Gjennomsnitt ± SEM vises
CD11b
+ CD14
-MHCII
-. Celler uttrykker kjennetegn MDSC-avledet immunsuppressive faktorer
Det er vist at MDSCs kan hemme T-cellefunksjonen ved produksjon av oppløselige faktorer som arginase-1, reaktive oksygenforbindelser, nitrogenoksid og TGF-β (8-10). For å kunne vurdere om CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler fra hunder med kreft kunne utnytte disse mekanismene for å mekle T-celle undertrykkelse, vurderte vi uttrykk for ARG1 og iNOS2, samt immunsuppressive cytokiner TGF-β og IL-10, i denne cellepopulasjon og fra PMN ble isolert fra perifert blod av friske hunder. PCR-analyse av RNA ekstrahert fra FACS isolert CD11b
+ CD14
-MHCII
-cellene bekreftet ekspresjon av ARG-1, iNOS2 enzymer og immunundertrykkende cytokiner TGF-β og IL-10-mRNA (fig. 5A) . I motsetning til dette ble normale hunde PMN ikke uttrykke ARG1, selv om iNOS, TGF-β og IL-10-mRNA kunne påvises (Fig. 5B). Ettersom mRNA for ARG-1, iNOS2, TGF-β og IL-10 ble alle funnet, konkluderer vi med at disse faktorene kan spille en rolle ved inhibering av T-celleformering og effektorfunksjon. Men siden PMN ble isolert fra friske hunder uttrykte ikke detekterbar ARG-1 mRNA eller påvirke T-cellefunksjonen, noe som antyder at Arg-1 kan være en tumor-indusert mekanisme som MDSCs kunne anvende for T-celle-undertrykkelse. . Dette funnet var ikke uventet og har tidligere vært dokumentert i menneskelige MDSC studier [19]
RT-PCR analyse av FACS renset CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler oppdaget uttrykk for ARG1 og iNOS2, samt TGF-p og IL-10 immunosuppressive cytokiner. ARG-1-ekspresjon ble ikke påvist i normale PMN. CD11b
+ CD14
-MHCII
– celler ble isolert fra perifert blod fra en hund med osteosarkom og PMN ble isolert fra en frisk hund. NRT, RNA-templat i fravær av revers transkriptase. Resultatene er representative tre eksperimenter.
Diskusjoner
innen sammenlignende onkologi viser store løftet for å fremme utviklingen av nye behandlingsformer for kjæledyr hunder og menneskelige pasienter likt. Imidlertid har det sparsommelige reagenser og dårlig definert immunfenotypen av hjørnetann leukocytter behersket vår evne til å forstå svulst immunologi hos hunder med naturlig forekommende kreft. Våre data viser at det finnes MDSCs i perifert blod fra hundene, som er forhøyet i alle typer fremskreden eller metastatisk kreft analyserte sammenlignet med tidlig stadium ikke-metastatisk kreft og friske kontroller. Med denne grunnleggende fundament av kunnskap på plass, vil det nå være mulig å prospektivt overvåke MDSC byrden hos hunder behandlet med eksperimentelle narkotika og immunterapi. Den CD11b
+ CD14
-MHCII
– cellepopulasjon som vi definert som MDSC co-renset med PBMC, hadde polymorfonukleære granulocystisk morfologi, undertrykt T celleproliferasjon og effektor funksjon, uttrykt kjennetegn undertrykkende faktorer av menneskelige MDSC, og positivt korrelert med tumorbyrde. Proliferasjonsanalyser viste forholdsvis svak proliferasjon i PBMC fra tumorbærende hunder (Fig. 3A, B) sammenlignet med normale respondere (Fig. 3C) i fravær av eksogent MDSC. Dette gjenspeiler trolig forhøyede nivåer av endogen (ikke eksperimentelt lagt til) MDSCs og regulatoriske T-celler i PBMC fra hunder med kreft. Videre er det viktig å merke seg at en andre delmengde av MDSC som er mer monocyttisk i naturen er allment verdsatt i murine og humane tumor immunologi. Vi har funnet noe bevis for selektiv ekspansjon av et CD14
+ monocytt-lignende celle i blodet hos hunder med cancer. Men CD11b
+ MHCII
– celler som ble renset fra hunder med avansert kreft som også var CD14
+ potent hemmet T-celledeling (figur S2), avslører at selv om monocytic MDSC er ikke en dominerende befolkningen hunder med cancer, er de faktisk til stede. Dette funnet av preferanse utvidelse av granulocytic MDSC er ikke overraskende, og er i samsvar med tilsvarende undersøkelser gjennomført i murine tumormodeller [15]. Totalt sett, våre data er konsistente med en global tilstand av immunsuppresjon hos hunder med avansert kreft som sannsynligvis skyldes flere mekanismer.
Den praktiske leveransen av denne studien er en enkel tre overflate markør immunfenotypen som kan brukes til å prospektivt overvåke MDSC byrde hos hunder. Vi har utført pilotstudier for å se etter flere markører. Konkrete foreløpige resultater som er verdt å merke seg er som følger. Vi har ikke vært i stand til å demonstrere vellykket flekker ved hjelp av anti-humane CD66b antistoffer. CD66b er en aktiverings markør uttrykt på noen menneskelig MDSC [19]. Den mest brukte markeringen for MDSC i mus er Gr-1, og et antistoff mot mus Gr-1 kryssreagerer med pent canine-celler, som gjør anti-mus CD11b (figur S1). Videre studier vil være nødvendig for å avgjøre om canine celler som er identifisert av anti-mus Gr-1 og CD11b antistoffer er faktisk MDSCs.
En mulig begrensning av denne studien at mange av prøvene vi analysert ble frosset, tint før analyse, noe som kan ha påvirket celle levedyktighet.
