Abstract
Sirkulasjonstumorceller (CTCs) har dukket opp som en potensiell biomarkør i diagnose, prognose, behandling og overvåking av lungekreft. Imidlertid er CTC deteksjon ikke bare kostbart, men dens følsomhet er også lav, og dermed begrenser dens bruk og innsamling av robuste data angående betydningen av CTCs i lungekreft. Vi forsøkte å søke kliniske variabler som øker prediksjon av CTCs hos pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Kliniske prøver og patologiske data ble samlet inn fra 169 NSCLC pasienter. CTCs ble oppdaget av CellSearch og tumor markører ble påvist ved hjelp av Luminex Xmap analysen. Univariatanalyser avslørte at histologi, tumorstadium, tumorstørrelse, invasivitet, tumor karakter og karsinoembryonisk antigen (CEA) assosiert med tilstedeværelse av CTCs. Men nivået på CTCs var ikke assosiert med graden av lymfeknuteaffeksjon (N) eller svulst prognostiske markører Ki-67, CA125, CA199, Cyfra21-1, og SCCA. Ved hjelp av logistisk regresjonsanalyse, fant vi at kombinasjonen av CTCs med svulst markør CEA har en bedre sykdom prediksjon. Avanserte scenen NSCLC pasienter med forhøyet CEA hadde høyere antall CTCs. Disse dataene antyder en nyttig prediksjon modell ved å kombinere CTCs med serum CEA i NSCLC
Citation. Chen X, Wang X, Han H, Liu Z, Hu JF, Li W (2015) Kombinasjon av sirkulerende tumorceller med Serum carcinoembryonic Antigen Forbedrer klinisk Prediksjon av ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 10 (5): e0126276. doi: 10,1371 /journal.pone.0126276
Academic Redaktør: Jeffrey Chalmers, The Ohio State University, USA
mottatt: 01.11.2014; Godkjent: 31 mars 2015; Publisert: 21. mai 2015
Copyright: © 2015 Chen et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av California Institute of regenerativ medisin (CIRM) (RT2-01942), National Natural Science Foundation of China (CN) (# 81071920 # 81372835 # . 81272294, # 31430021), Jilin-provinsen Science and Technology Department (11ZDGG003, # 20120720), og National Health and Family Planning Commission av Folkerepublikken Kina (CN) (# 2001133)
Konkurrerende interesser: de forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for 75-80% av lungekrefttilfeller. NSCLC er vanligvis ikke diagnostisert før sykdommen har nådd avansert stadium, noe som fører til lav overlevelse, med en 5-års overlevelse på 20% [1,2]. Et antall av biomarkører er blitt anvendt i klinikken som prognostiske markører for NSCLC. Disse inkluderer carcinoembryonic antigen (CEA), kreft antigen (CA) -199, CA-125, plateepitelkarsinom antigen (SCC-Ag), og cytokeratin-19 fragmenter antigen 21-1 (CYFRA21-1). Forhøyede nivåer av disse markørene har blitt assosiert med dårlig prognose [3-12]. Blant dem, CEA og Cyfra 21-1 er de mest sensitive kreftmarkører i NSCLC [13,14].
Sirkulasjonstumorceller (CTCs) er kreftceller som forlater den primære svulsten nettstedet og inn i blodbanen, der de kan spres til andre organer. CTCs kan identifiseres i perifert blod ved histologisk farging for epitel og kreft-spesifikke markører. Foreløpig er det bare deteksjon kit godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) den CellSearch system (Veridex, NJ), som bruker spesifikke antistoffer for å identifisere og kvantifisere CTCs i en 7,5 ml blodprøve.
Å Hittil rolle CTCs i NSCLC er fortsatt uklart. For eksempel, mens noen studier korrelere CTCs med dårlig prognose [15-18], andre fant ingen sammenheng [19]. En fersk meta-analyse av 20 studier med til sammen 1576 pasienter viste at tilstedeværelsen av CTCs var assosiert med dårlig prognose hos NSCLC pasienter [20]. Av notatet, den prognostiske verdien av CTCs fortsatt kontroversielt. Tidligere studier har rapportert at omtrent 30% av NSCLC har minst ett CTC per 7,5 ml blod, og ca 15% av NSCLC har fem eller flere CTCs per 7,5 ml blod, med høyere CTC-nivåer i pasienter med fjernmetastaser [ ,,,0],15, 21-22]. I tillegg til den lave følsomhet, har den høye prisen for CTC deteksjon gjorde det vanskelig å bli en rutinemessig klinisk test for NSCLC, spesielt i kinesiske populasjoner.
For å oppnå en bedre forståelse av betydningen av CTCs ved NSCLC vi har satt i gang en prospektiv, enkelt institusjon studie for å karakterisere CTCs i NSCLC pasienter og undersøkt forholdet mellom CTCs og andre kliniske faktorer. Vi forsøkte å teste hypotesen om at tilstedeværelsen av CTCs i kombinasjon med kreft biomarkører kan bedre forutsi tumor invasivitet i NSCLC.
Materialer og metoder
Study befolkningen
Denne studien ble utført ved det første sykehuset i Jilin University (Changchun, Jilin, Kina). Studien ble godkjent av etikkomiteen av det første sykehuset i Jilin Medical University, og gjennomført i henhold til Helsinkideklarasjonen prinsipper. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle inkluderte pasienter før eventuelle inngrep. Pasienter med histologisk bekreftet NSCLC var kvalifisert. Før behandling, ble Tumor Node Metastase (TNM) avholder (7th edition) vurderes av Computated tomografi (CT) skanner [23].
CTC analyse
CellSearch system (Veridex, NJ, USA) ble anvendt for å kvantifisere CTCs i 7,5 ml blodprøver trukket fra pasienter innen syv dager før behandlingen (definert som grunnlinje). Blodprøver ble tatt i 10 ml CellSave (Veridex) konserverings rør, oppbevares i romtemperatur, og behandlet innen 96 timer etter prøvetaking, i henhold til produsentens instruksjoner. CTCs er definert som celler med rund til oval morfologi, a, 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) positiv kjerne av 4 uM eller større, positiv cytoplasmatisk farging for cytokeratins (CK-8, CK-18, og CK -19), og fravær av CD45-ekspresjon.
Tumor markør analyse
Sera ble separert fra en 2 ml prøve av koagulert blod fra hver pasient. En Luminex Xmap analysen (Luminex, Austin, TX, USA) var bruk for å påvise tumor markører carcinoembryonic antigen (CEA), kreft antigen (CA) -199, CA-125, plateepitelkarsinom antigen (SCC-Ag), og cytokeratin -19 fragmenter antigen 21-1 (CYFRA21-1). Nivået av hver markør ble sammenlignet med de normale referanseverdiene av 5 ng /ml CEA, 35 U /ml CA19-9, 35 U /ml CA125, 1,5 ng /mL SCC, og 5 ng /ml CYFRA21-1. På grunn av grensen for serum volum, bare 109 pasienter hadde sitt serum analysert for CEA nivåer, 70 pasienter for CA125, 76 pasienter for CA199, 107 pasienter for CYFRA21-1, og 75 patenter for SCCA.
Patologi prøven og immunhistokjemi
vevsprøver ble oppnådd fra pasienter med stadium IIIB eller IV NSCLC for patologisk analyse. Tumorprøver ble fiksert i formalin, innstøpt i parafin, skåret i 4 mm seksjoner, og festet til glassplater. Celleformering ble bestemt ved immunohistokjemi hjelp av et monoklonalt antistoff mot Ki-67 (MAIXIN-BIO Inc., Kina). Ki-67 farging i færre enn 25% av celler som ble ansett som negativt, mens farging i 25% av cellene ble ansett for å være Ki-67 positive [24].
Statistisk analyse
Individuelle variabler ble vurdert ved univariat analyse ved hjelp av Chi kvadrat test. Risikoforhold ble beregnet for hver variabel for å vurdere prediktiv verdi for CTCs. Logistisk regresjonsanalyse ble brukt for å vurdere forholdet mellom CTC teller og klinisk-patologisk data. Alle analyser ble utført ved hjelp av SPSS v19.0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). For alle analyser, en
p
-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
pasientkarakteristika
Ett hundre og seksti-ni pasienter med NSCLC ble rekruttert mellom juli 2012 og januar 2014, og deres egenskaper ble registrert (tabell 1). CTCs ble kvantifisert fra en 7,5 ml blodprøve for hver pasient (fig 1). Median oppfølging varighet var 1,1 år. Dermed vil ikke bli gjennomført overlevelsesanalyse på denne kohort populasjonen. Totalt sett prediksjon av NSCLC etter CTCs var relativt lav i våre kohort prøver. I totalt 169 NSCLC pasienter, bare 40 (23,7%) pasienter viste positive CTC deteksjon ( 1 per 7,5 ml blod), i en tilsvarende avtale med det som er rapportert i vestlige populasjoner [15, 21-22] Hotell.
Positiv immunomagnetisk utvalg med anti-EpCAM Ab ble etterfulgt av morfologiske bekreftelse med farging for cytokeratins (cytoplasma), DAPI (nucleus) og CD45 (negativ).
Forbløffende vår cohort prøvene viste en relativt lav andel kvinnelige pasienter (33,7%) sammenlignet med vestlige land, hvor NSCLC er mer utbredt hos kvinner [1-2]. Det kan være mulig at forskjeller i etnisitet og etiologiske faktorer av NSCLC pasienter kan forklare dette avviket. For eksempel er andelen røykere relativt lav i kinesiske kvinner.
Univariat analyse av CTC teller med klinisk og patologisk data
I sammenheng analyser, fant vi ingen signifikant sammenheng med CTC teller med kjønn, alder, røykestatus og plassering av primærtumor (tabell 2). Men histologiske typen ble positivt assosiert med CTCs (p 0,05 for CTC terskler ≥ 1 og ≥ 2CTC /7,5 ml blod). Ingen pasienter på stadium I NSCLC hadde CTC CTC ≥ 1 /7,5 ml blod, mens 15,8% (6/38) av scene II-IIIA pasienter og 29,1% (34/117) trinn IIIB-IV pasient ble funnet å ha CTC ≥ 1 CTC /7,5 ml blod. Klinisk TNM staging var positivt forbundet med CTCs, da den ble delt inn i stadium I, fase II, stadium III og stadium IV (p 0,05 for CTC terskler ≥ 1 og 2 CTC /7,5 ml blod). Selv når Clinical TNM staging ble delt i stadium I-IIIA og IIIB-IV, forble det forbundet med CTCs (p 0,05 for CTC terskler ≥1, 2 og 5 CTC /7,5 ml blod).
For ytterligere å forstå hvis tumor størrelse, invasivitet, eller lymfesystemet og fjernmetastaser har en innvirkning på CTC telle, forholdet mellom CTCs og TNM stadium ble også vurdert. Vi fant at 28,1% (9/32) av T1, 12,1% (8/66) av T2, 29,4% (5/17) av T3, og 34,9% (15/43) av T4 pasientene hadde CTCs ≥ 1 CTC /7,5 ml blod, som utgjør en signifikant korrelasjon mellom tumorstørrelse og tilstedeværelsen av minst ett CTC /7,5 ml blod. Imidlertid var det ingen korrelasjon mellom andre terskel CTC teller og tumorstørrelsen. Tilsvarende, var det ingen sammenheng mellom enhver terskel CTC telle og lymfeknuter metastasering. Men fjernmetastaser ble korrelert med CTC-tall ved terskler av ≥ 1, 2 og 5 CTCs /7,5 ml (p 0,05).
multivariat analyse viser at CTCs korrelerer med avansert stadium sykdommen
for å forbedre prediksjon verdien av CTCs i NSCLC, utførte vi multivariat analyse inkluderer alder, kjønn, røyking historie, histologi, klinisk-iscenesettelsen og plasseringen av primærtumor. Vi fant at pasienter med stadium IIIB-IV sykdom hadde en høy forekomst av CTCs sammenlignet med de med stadium I-IIIA. (P 0,05, tabell 3).
Association of CTC teller med Ki-67 og tumor karakter i NSCLC pasienter
Patologisk analyse indikerte at dårlig differensierte svulster ble korrelert med høyere CTC teller (CTCs ≥ 2 /7.5 ml blod, p 0,05, tabell 4), sammenlignet med moderat differensierte svulster. Pasienter med Ki-67-positive tumorer så ut til å ha høyere CTC teller, men dette var ikke statistisk signifikans.
CTCs teller korrelerer med CEA
svulst markører CEA, Cyfra21- 1, CA19-9, CA-125, og SCC-Ag ble også analysert i NSCLC pasienter. Hver serum markør ble sammenlignet selvstendig med CTC teller for å identifisere potensielle relasjoner. Den eneste markør funnet å være assosiert med CTCs ble serum CEA. Forhøyet serum CEA var positivt assosiert med CTC-tall ved terskler ≥ 1, 2 og 5 CTCs /7,5 ml blod, sammenlignet med normale CEA nivåer (tabell 5).
ble utført Videre statistisk analyse for å undersøke om det var noen sammenheng mellom tilstedeværelsen av CTCs, TNM staging, og serumkonsentrasjon av CEA. Etter justering for TNM staging (I-IIIA og IIIB- IV), ble serum CEA fortsatt positivt assosiert med tilstedeværelse av CTC (OR 95% CI = 4,263 [1,194 til 15,226], p = 0,026.
Serum CEA øker prediksjon kraft av CTCs i tumor aggressivitet
Påvisning av CTCs i våre NSCLC pasienter var relativt lav, med kun 23,7% av pasientene som viser . 1 CTC per 7,5 ml blod Vi dermed foreslått å undersøke om tilsetning av en billig klinisk variabel ville styrke sin makt for sykdom prediksjon. til dette brukte vi logistisk regresjonsanalyse for å analysere muligheten for CTCs i kombinasjon med serum CEA i å forutsi NSCLC aggressivitet, inkludert TNM staging (i-IIIA og IIIB- IV), Ki-67 nivå, og svulst klasse. som det fremgår av tabell 6, fant vi at prediksjonen evne sent iscenesettelse og Ki-67 ble økt i gruppen med kombinert CTC og CEA-modellen sammenlignet med CTC modell.
Diskusjoner
Sirkulasjonstumorceller (CTCs) har blitt studert som potensielle biomarkører for å forbedre NSCLC diagnose, prognose, behandling og overvåking. Men til vår kunnskap, er den første til å bruke CellSearch system for å vurdere CTCs i en stor kohort av kinesisk NSCLC vår studie.
I univariate analysen, fant vi at CTC teller i NSCLC ble assosiert med sent stadium, adenokarsinomer, dårlig differensiert tumor klasse, og forhøyede CEA nivåer. Ved hjelp av logistisk regresjonsanalyse fant vi at den kombinerte CTCs og CEA-modellen hadde en bedre prognose for aggressivitet NSCLC (slutten av iscenesettelse og Ki-67). Våre data tyder på at klinisk variabler, spesielt serum CEA kan forbedre prediksjon kraft av CTCs i NSCLC
Tidligere studier har rapportert at 30% av pasientene har . 1 CTC per 7,5 ml blod, målt av CellSearch, og at 15% har fem eller flere CTCs [15,21-22]. I vår studie, 23,7, 11,8 og 7,7% av pasientene som vist på minst 1, 2 og 5 CTCs /7,5 ml blod, henholdsvis. Selv om disse nivåene er noe lavere enn i tidligere rapporterte studier, kan ulike pasientgrupper står for disse avvikene. Spesielt har tidligere studier inkludert heterogene populasjoner av metastatisk og betjenes NSCLC.
Vanlige prognostiske faktorer i NSCLC inkluderer Ki-67 positivitet og svulst klasse. [25-28]. Tumor karakter er korrelert med nivåer av apoptose og celleformering i lunge adenokarsinomer, med en raskere omsetning av tumorceller i dårlig differensierte tumorer [29]. I samsvar med dette konseptet, har vi funnet at høye CTC teller var assosiert med dårlig differensierte svulster. Spesielt ble en dårlig differensiert tumor grad signifikant assosiert med CTC tellinger av ≥ 1 eller 2 CTC /7,5 ml blod. Videre har høy Ki-67 farging i den primære svulsten var også assosiert med høy CTC teller ved alle terskler, selv om disse dataene ikke var statistisk signifikant på grunn av den lille gruppestørrelse. Forholdet mellom spredning og CTCs i NSCLC vil kreve videre studier ved hjelp av en større kohort.
Tidligere studier har vurdert forholdet mellom CTCs og tumormarkører i solide tumorer [30-32]. Imidlertid blir data fra lungekreftpasienter fortsatt mangler, spesielt i kinesisk befolkning. Vi undersøkte sammenhengen mellom CTCs og ofte brukte NSCLC tumormarkører, inkludert CEA, CA19-9, CA-125, SCC, og CYFRA21-1. Interessant, våre data viser at serum CEA nivåer er korrelert med CTC teller i NSCLC pasienter. CEA, et glykoprotein som normalt frembringes under fosterutvikling, er til stede ved meget lavt nivå i serum hos friske voksne. Forhøyede serumnivåer av CEA er assosiert med utvikling, kurs, scene og prognose av NSCLC [4-5, 12]. Dataene i vår undersøkelse tyder på at kombinasjonen av CTC tellinger og serum CEA var assosiert med mer aggressiv NSCLC. Det er imidlertid ikke klart hvorfor andre serum biomarkører ikke har tilsvarende assosiasjoner med CTCs i NSCLC pasienter. Videre studier med større utvalgsstørrelsene er nødvendige for å avgjøre om det var nyttig å inkludere disse markørene i prognosemodellen.
Til tross for fremgang i de senere år, har fortsatt CellSearch teknologi mange begrensninger. Påvisning av CTCs av CellSearch systemet er avhengig av celleoverflatemarkører som EpCAM. Således kan det potensielt bomme CTCs som ikke uttrykker målantigenet [33-34]. Tilsvarende aggressive kreftceller mister epiteliale markører på grunn av epitel-mesenchymale overgang (EMT), og vil ikke bli oppdaget av CellSearch. Det bør bemerkes at feltet beveger seg bort fra CTC teller til molekylær og funksjonell karakterisering av CTCs og bruk av CTCs som flytende biopsi for å teste om enkelte pasienter er mer sannsynlig å dra nytte av sentrum biologisk behandling [35-36]. For eksempel, fenotypiske karakteriseringen av CTCs ved å inkludere en «tumor-spesifikke» markørgen, som CEA ved hjelp av RT-PCR, har en fordel av å øke følsomheten.
CellSearch analysen er svært kostbare i Kina. Funnet av vår studie kan tyde på en kostnadseffektiv metode for NSCLC pasienter til å bestemme hvem som skal kjøre for dyrt analysen. Tumor markører alltid brukt som biomarkører for tidligere diagnose, behandlingseffekt og prognose i NSCLC [4-5, 12, 37-38]. Som serum CEA er forbundet med CTCs, kan det være mulig å anbefale CellSearch analysen for de NSCLC er CEA-positive. Alternativt kan vi undersøke om de NSCLC pasienter med både positive CTC og forhøyet CEA er forskjellig fra andre undertyper i terapeutisk respons.
Det bør understrekes at denne studien inkluderte bare 169 NSCLC pasienter i korrelasjonsanalyse. I tillegg, på grunn av grensen for serumprøver, vi kunne ikke fullføre alle biomarkør analyser for hver pasient, som fører til lav statistisk styrke for noen variabler i lagdelte undergrupper. Vi håper at kontinuerlig samling av kreft biopsier fra dette pågående prosjektet vil styrke våre funn.
I sammendraget, en enkel og pålitelig metode for å identifisere NSCLC pasienter med CTCs ville ha stor prognostisk verdi. Vi har funnet at tilstedeværelsen av CTCs er forbundet med sent stadium og dårlig differensierte tumorer, adenokarsinomer, og forhøyede nivåer CEA. Kombinasjonen av CTC teller med serum CEA verdier var assosiert med mer tumor aggressivitet hos NSCLC pasienter. Langsiktig oppfølging vil være nødvendig for å avgjøre den videre betydningen av CTCs i NSCLC.
