Abstract
Det er kjent at kreft utvikler seg ved vertikal genoverføring, men dette paradigmet ignorerer at DNA sirkulerer i høyere organismer, og at det er biologisk aktiv ved dens opptak i mottakercellene. Her bekrefter vi tidligere observasjoner på evnen av celle-fri DNA for å indusere
in vitro
celle transformasjon og tumorigenesis ved å behandle NIH3T3 mottaker museceller med serum for tykktarmskreftpasienter og supernatant av SW480 menneskelige kreftceller. Celletransformasjon og tumorigenesis av mottakercellene ikke forekomme hvis serum og supernatantene ble tømt for DNA. Det er også påvist at horisontale kreft progresjon mediert ved sirkulering av DNA skjer via dens opptak i mottakercellene i en
in vivo
modell hvor immunkompetente rotter underkastet colon carcinogenesis med 1,2-dimetylhydrazin hadde økt hastighet på colonic tumorer når injisert i fotens rygg med humane SW480 kolon carcinoma-celler som en kilde for sirkulerende onkogen DNA, som kan bli motvirket ved å behandle disse dyr med DNAse i og proteaser. Selv om bidraget fra andre enn DNA for dette fenomenet til å forekomme biologisk aktive molekyler som ikke kan utelukkes, våre resultater støtter det faktum at kreftceller avgir til sirkulasjonen biologisk aktive DNA for å fremme tumorprogresjon. Videre utforskning av den horisontale tumorprogresjon fenomen formidlet av sirkulerende DNA er åpenbart nødvendig for å fastslå om det er manipulasjon kan ha en rolle i kreftbehandling
Citation. Trejo-Becerril C, Pérez-Cárdenas E, Taja-Chayeb L Anker P, Herrera-Goepfert R, Medina-Velázquez LA, et al. (2012) Kreft Progresjon formidlet av horisontal genoverføring i en
In Vivo
Model. PLoS ONE 7 (12): e52754. doi: 10,1371 /journal.pone.0052754
Redaktør: Brian Lichty, McMaster University, Canada
mottatt: 23 juli 2012; Godkjent: 20 november 2012; Publisert: 28.12.2012
Copyright: © 2012 Trejo-Becerril et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av CONACyT bevilger 34 649-M, 50 699 og fra PAPIIT UNAM IN214902. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesse. Medforfatter Phillipe Anker er tilknyttet OncoXL. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Den nåværende paradigme i kreft progresjon er at det skjer via vertikal genoverføring; Dette betyr at avkommet initiere tumorcelle arve genetiske og epigenetiske forandringer som fører til tumorprogresjon. Denne modellen er imidlertid ignorerer den horisontale eller sideveis overføring av DNA forbinder og former nesten alle levende ting [1], og at det innenfor en organisme, sirkulerende DNA, slik som exosomes som inneholder transkripsjonelt aktive mRNA og mikroRNA, kan potensielt virke som en endokrin eller parakrint messenger, i stand til å påvirke funksjonaliteten til mottakernes celler [2]. Følgelig har det blitt foreslått at celle-frie DNA (sirkulerende DNA) kan delta i utviklingen av metastaser via «passive» transfeksjon lignende opptak av slike nukleinsyrer ved mottakelige celler [3]. I 1994 Anker et al., Første gang påvist at supernatant fra dyrkede koloncancer-cellelinjen SW480 var i stand til å transformere mottaker udødelig murine NIH3T3-celler som gir mutert human
K-ras
[4]. Transformasjon av disse mottakercellene med plasma av kolon kreftpasienter har blitt rapportert i tillegg [5].
Muligheten av genetisk materiale til å sirkulere i eukaryoter har vært kjent siden 1948 [6], og at dette DNA kan være utgitt av bakterier og høyere organismer og inngå mottakercellene ble demonstrert av Anker og Stroun [7] – [9]. Disse funnene førte til konseptet at DNA kan fungere som en budbringer [10] – [16]. Dette synet har vært støttet av den enkle som administreres bakteriell og eukaryote DNA kan sirkulere fritt i hele dyre- og plante organer og i sin evne til å angi individuelle celler naturlig, der den kan finne i vertscellekjerner [12], [17] – [18]. Opptaket av sirkulerende DNA ved eukaryoter viser at biologien til mottaker celler /organismer kan bli endret uavhengig av om den er integrert eller ikke, [19] – [27]
Det er bemerkelsesverdig at et slikt DNA administrering gjør. ikke krever noen spesielle kjøretøy, for eksempel, liposomer, elektroporering og genet våpen, for å lette adgang til cellene i for at den skal være biologisk aktive. Hvordan genetisk materiale sirkulerer og overføringer til somatiske celler av høyere organismer er fortsatt kontroversielt. Selv om dette er ikke gjensidig utelukkende, har enkelte forfattere vist at dette skjer via opptak av apoptotiske legemer [28], mens andre har karakterisert sirkulerende DNA som et kompleks av DNA /RNA-lipoprotein kalles «virtosome», som spontant utgitt av levende celler [29]. Her viser vi at sirkulerende DNA er i stand til å kjøre horisontal tumorprogresjon i en immunkompetente colon-kreftrottemodellen.
Materialer og metoder
Cellelinjer
SW480 (human tykktarmskreft cellelinje som har punktmutasjonen Gly Val i kodon 12 av ekson en av de
K-ras-onkogenet
), HeLa (human cervikal cancer cellelinje positive for HPV-18), og NIH3T3 (mus-fibroblaster udødelig ) ble kjøpt fra American Type Culture Collection. Primær kultur av forhuden fibroblaster (BB1) ble avledet fra omskjæring forhud nyfødt gutt under skriftlig samtykke fra sin far og brukes i andre passasje.
Overstående Forberedelse
Når cellekulturer hadde en sammenfletting av 80%, supernatantene ble oppsamlet ved pipettering og ryddet av eventuelle gjenværende celler og celleavfall ved et sentrifugeringstrinn ved 400 x
g
i 20 min (Biofuge primo R, Heraeus) og ført gjennom en 0,45-um filter ( Sartorius, 16 555) for å fjerne potensielt forurensende celler. Aliquoter av hver supernatantprøver ble sådd i en kultur kolbe og inkubert ved 37 ° C i 120 timer for å bekrefte fraværet av levende celler. For DNA-analyse ble 50 ml av supernatanten ble konsentrert, først med en ultrafiltreringssystem med en 40 kDa membran pore (Amicon, omrørt Ultrafiltration Cell, modell 8010), og deretter med en hastighet vakuuminnretning (Vacufuge Plus, Eppendorf) opp til 10 ml. Den konsentrerte supernatant ble umiddelbart oppbevart ved -80 ° C.
Enzymatisk spalting av det bearbeidede Supernatantene
Femti ml av de behandlede supernatanter fra SW480 (SW) og NIH3T3 (NH) ble oppdelt i 12,5 ml aliquoter og inkubert med proteinase K og /eller DNAse I som følger: 1) SW + DNAse I; 2) SW + proteinase K; 3) SW + DNAse I + proteinase K, og 4) uten enzym. Kontroll digestions var DMEM + 2% FBS + laksesperm-DNA, og b) DMEM + 2% FBS + laksesperma-DNA + DNAse I. fordøyelse ble utført med 1,5 enheter (50 ug) av proteinase K pr mg totalt protein som inneholdes i supernatanten i 60 minutter ved 37 ° C etterfulgt av inaktivering ved 80 ° C i 20 min. For DNAse I, enzymkonsentrasjon var 12 enheter (3,6 Kunitz) per 12 mikrogram av DNA-innhold i supernatanten i 60 minutter ved 37 ° C og deretter inaktivering ved 65 ° C i 15 min. Spaltning med begge enzymene ble utført med den samme konsentrasjon og tider, men bearbeider først med proteinase K og deretter DNAse I. Etter enzymatisk fordøyelse, ble supernatanten anvendt for «passiv» transfeksjon som angitt ovenfor. Nedbryting av proteiner og /eller DNA ble bekreftet ved gel elektroforese.
Serum Innsamling og klargjøring
Sera ble ekstrahert fra blod av tre pasienter med fremskreden kreft i tykktarmen og friske personer. Blod ble erholdt fra perifer vene i to vakuumrør (Becton Dickinson, 368162) inneholdende koagel-aktivering additiv og en barriere gel for å isolere serum. Blodet ble holdt ved 4 ° C, og behandlet i løpet av 2 timer, og sentrifugert ved 1000
x g i 20 min
(Biofuge primo R, Heraeus) ved romtemperatur; serum ble samlet opp og ført gjennom et 0,45 mikrometer filter (Sartorius, 16 555) for å fjerne cellene. Blodprøver ble innhentet skriftlig samtykke fra kilde pasienter.
Passiv Transfeksjon av Muse NIH3T3 celler
NIH3T3 celler esemidler mottaker for transformasjon assays- ble sådd i 24-brønners plater og utsatt for menneskelig serum eller supernatanter SW480 (spaltet eller ikke) i et 01:01 forhold (DMEM med 2% FBS /serum eller supernatant) i 14 dager, forfriskende media hver 24 timer [4]. Etter 14 dagers eksponering (bare syv dager i plater utsatt for serum), ble cellene dispergert og spredte under standardbetingelser. Da de eksponerte celler ble analysert for tilstedeværelse av mutert human
K-ras
sekvenser ved PCR, RT-PCR og sekvensering. Eksperimenter ble utført av triplikater.
Aktiv Transfeksjon (Lipofectamine)
En dag før transfeksjon, NIH3T3-celler ble sådd ut ved en tetthet på 1 x 10
5 celler per brønn (seks-brønns plater) i 500 ul vekstmedium uten antibiotika (DMEM). Transfections ble gjort ved hjelp av 5 ug DNA (enten genomisk DNA eller supernatant DNA fra SW480 celler pluss 0,5 pg plasmid (pEGFP-CMV) Lipofectamine transfections ble gjort følgende produsentens instruksjoner (Invitrogen ™, LTX .. Pluss Reagens) Cellene ble inkubert ved 37 ° C i 24 timer, middels var uthvilt og G418-seleksjon ble startet for å get stabile transfektanter
Transformation analyser
NIH3T3 som ble passivt transfektert var ansatt for å utføre transformasjon analyser som kontroll.. vi brukte NIH3T3 celler eksponert for serum fra en frisk donor og til sin egen supernatanten. egenskapene som anvendes som indikatorer for malign transformasjon ble morfologiske endringer (fokusdannelse), forankrings-uavhengig vekst (vekst i myk agar), og tumorgenisitet [30] .
morfologisk analyse
transfekterte NIH3T3 celler ble undersøkt for foci dannelse og telles under fase-kontrast mikroskopi.
vekst av celler i Soft Agar
foci ble isolert fra plastkulturplater og ekspandert for myk agar analyse. Etter trypsinitation Cellene ble suspendert i DMEM-medium inneholdende 0,3% edel agar og 15% FBS. Et lag av denne suspensjon ble sådd ut på toppen av et lag av medium inneholdende 0,7% agar uten serum. Celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
5 celler per 10-cm plate. Kolonier ble scoret etter 14 dager med kultur (en koloni ble definert som om inneholdt minst 50 celler).
I
in vivo
Eksperimenter
tumorigenesis analyser ble utført i seks -week gamle atymiske BALB /c (nu /nu) hunnmus (Harlan Laboratories). I alle eksperimenter ble grupper på seks mus injisert subkutant med 2 millioner celler suspendert i 100 ul av FBS-fritt DMEM. Tumorvekst ble overvåket og registrert ukentlig. Tumorstørrelse ble målt med en elektronisk skyvelære og størrelse-volum estimeres ved hjelp av formlene et x b
2 x (π /6) = V (mm
3) (a = større diameter, b = mindre diameter og V = volum). Ved eksperimenter for å vurdere evnen til tumorgenese supernatanten av HeLa-celler i umanipulerte dyr, ble seks uker gamle atymiske BALB /c (nu /nu) hunnmus også anvendes. Dyr ble injisert daglig intraperitonealt med 500 ul av supernatanten av HeLa-celler i 30 dager. På dag 31 ble dyrene avlivet. Atymiske Hsd: Rh-
Foxn1
rnu
hunnrotter og immunocompetent Hsd: Wistar hunnrotter i tillegg (Harlan Laboratories) ble injisert med apoptotiske legemer fra HeLa-celler, som ble hentet etter høydose eksponering for 24 timer til cisplatin på 75 mikrometer. Frittliggende cellene ble høstet og sentrifugert skritt på 400 ×
g
i 10 min (Biofuge primo R, Heraeus) i PBS tre ganger for å fjerne eventuelle gjenværende cisplatin. Injeksjoner av apoptotiske legemer ble gjort hver annen dag ved intravenøs injeksjon i halen i et totalvolum på 100 pl av normalt saltvann. Behandling varte i 60 dager. På dag 61 ble rottene avlivet og nekropsi utført for å evaluere makroskopisk tumordannelse. Store organer (lever, milt, nyre, lunge og livmor) ble behandlet for H E patologisk undersøkelse
For å vurdere horisontal tumorprogresjon, HSD: Wistar seks uker gamle hunnrotter (Harlan Laboratories) ble behandlet. med enten: i) ingen behandling; ii) subkutan injeksjon av 1 x 10
6 SW480-celler (fortynnet i 100 pl av normalt saltvann) i den flanke på dager 28 og 49 av DMH behandling; iii) kolon kreftfremkallende DMH intraperitonealt i 20 uker som rapportert [31]; iv) diett av DMH pluss SW480 celler; og v) som gruppe iv pluss DNAse I /protease behandling som besto av DNAse I i en dose på 2,3 mg /kg ved intramuskulær injeksjon, og en blanding av proteaser (trypsin, chymotrypsin og papain) ved intraperitoneal injeksjon i doser på 10 mg /kg, 10 mg /kg og 25 mg /kg henholdsvis, som rapportert i [32]. Både DNAse I og proteaser blanding ble fortynnet i 100 pl av normalt saltvann. Injeksjoner ble administrert daglig unntatt helgene fra uke 4 til 12. gruppe vi fikk DMH + DNase /proteaser. Etter evaluering med micro PET-CT (som beskrevet nedenfor) ble dyrene avlivet og obdusert 6 måneder etter avsluttet de 20 ukene av kreftfremkallende (DMH)
For å vurdere skjebnen til menneske SW480 celler injisert inn i immunkompetente dyr Hsd.: Wistar 6 uker gamle hunnrotter (Harlan Laboratories) ble injisert subkutant med 10 millioner SW480 celler i flanke og avlivet på dagene 1, 2, 3, 7 og 14 etter injeksjon for å fjerne injeksjonsstedet og behandlet for rutine H E histologisk analyse. Etiske godkjenninger ble hentet fra Institutional forskningsetikk styret og Animal Care komiteen.
Micro PET-CT
Svulstdannelse i dyrene ble overvåket ved hjelp av molekylære bildeteknikker med en mikro PET-CT (Albira ARS, Oncovision) og
18F-FDG. Tumor overvåkning ble utført ved uke 15 og 24 etter starten av behandlingen (DMH). For å kvantifisere tumoraktivitet, ble standard opptak (SUV) beregnet utnytte Albira system programvareverktøy (Carestream Molecular Imaging, CT, USA). SUV er en kvantitativ verktøy for PET-CT undersøkelser som gjør det mulig for fastsettelse av
18F-FDG konsentrasjon i en bestemt region-of-interesse (dvs. tumor aktivitet). Tumor nærvær ble definert da SUV (tumor /lever) forholdet var ≥1.5.
Tissue Forberedelse og mikrodisseksjon
De formalinfikserte, parafininnstøpte colonic svulster (ett i hver gruppe) fra hver gruppe av DMH-behandlede rotter ble kuttet i 5-mikrometer tykke seksjoner på en mikrotom med engangsblad. For mikrodisseksjon ble snittene deparaffinized i to med xylen i 10 minutter, rehydrert i 100% etanol, 90% etanol og 70% etanol i 5 minutter hver, farget med hematoksylin og eosin (H
E6 product: (5 «gggggatccatggcgcgctttgaagatccaaca-3′, og 3»-ggggaattcttatacttgtgtttctctgcgtcg-5 «), 450 bp fragment;
E7 plakater (5′-cccgacgagccgaaccacaac-3 «, og 3′-gggatgcacaccacggacacac-5»), 300 bp fragment; human
DHFR plakater (5′-agaaccaccacgaggagc-3 «, og 3′-acagaactgcctccgactatc-5»), 120 bp fragment; human
ACTIN plakater (5′-ggagtcctgtggcatccacg-3 «, og 3′-ctagaagcatttgcggtgga-5»), 320 bp fragment. Humant
RAB30 plakater (5′-gtccattacccagagttactaccg-3 «, og 3′-gaccttgttgctggcatattgttc-5»), 130 bp fragment;
Alu Yd6 plakater (5′-gagatcgagaccacggtgaaa-3 «, og 3′-ttgctctgaggcagagttt-5»), 200 bp amplikon [33].
En innledende denaturering ved 94 ° C i 5 min ble etterfulgt av 40 sykluser av forsterkning og en avsluttende utvidelse trinn 5 min ved 72 ° C, (
E6
,
E7 Hotell og
Alu Yd6
hadde forlengelse tid for 30 sek ). Syklusene inkluderte denaturering ved 94 ° C i 30 sek, 30 sek av gløding (60 ° C for
K-ras
og
RAB30
, 59 ° C for
ACTIN
og
DHFR
, 57 ° C for
E6 Hotell og
E7 Hotell og 61 ° C for
Alu Yd6
), PCR reaksjoner ble utført i en 2400 Thermalcycler (Applied Biosystems). Amplifiseringsproduktene ble verifisert ved agarosegelelektroforese. For rotte spesifikk
LINE 1
sekvenser forsterkningen ble gjennomført i 20 ul reaksjoner inneholdende 100 ng templat-DNA, 10 mmol /liter Tris-HCl (pH 8,3), 40 mmol /L KCI, 1 mmol /l MgCl 2, 200 umol /l
av hver dNTP, 0,25 U Taq-polymerase (Applied Biosystems) og en umol /L av hver primer spesifikk for rotte-
LINJE 1 plakater (5′-aaatcagggactagacaaggctgc-3 «, og 3»-cccagccactttgctgaagttgt-5 «) [34]. Innledende denaturering ved 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med amplifikasjon og en avsluttende forlengelsestrinn (5 minutter ved 72 ° C). Amplifiseringscykluser besto av denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 59 ° C i 30 sekunder, og forlengelse ved 72 ° C i 30 sekunder. PCR-reaksjonen ble utført på en 2400 Thermalcycler (Applied Biosystems). Amplifiseringsproduktene ble verifisert ved agarosegelelektroforese.
RT-PCR
For første-tråd cDNA-syntese på 1-5 ug total RNA ble revers-transkribert i en 20 pl reaksjonsvolum innehold 2 ul av 10 x PCR-buffer, 50 ng av tilfeldige heksamerer, 50 mM MgCl
2, 200 ng nM dNTP, 0,1 M DTT, og 200U revers transkriptase, (GeneAmp, Applied Biosystems) i 50 minutter ved 42 ° C. PCR-amplifisering av cDNA ble utført i en 20 ul reaksjonsvolum inneholdende 100 ng cDNA, 10 mmol /liter Tris-HCl (pH 8,3), 40 mmol /L KCI, 1 mmol /l MgCl
2 (for
K -ras
v12 og
RAB30
), og 200 pmol /L av hver dNTP, 0,25 U Taq-polymerase (Applied Biosystems), og 1 pmol /l av hver primer spesifikk for human
K-ras
v12 (5′-actgaatataaacttgtggtagttggacct-3 «, og 3′-caaatcacatttatttcctaccaggacct-5»), og for
RAB30 plakater (5′- gtccattacccagagttactaccg-3 «, og tre «-gaccttgttgctggcatattgttc-5»). Innledende denaturering ved 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med amplifikasjon og en endelig forlengelse trinn (5 min ved 72 ° C). Syklusene inkluderte denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 58 ° C (
K-ras
V12), og ved 56 ° C (
RAB30
) i 30 sek og forlengelse ved 72 ° C i 30 sek. Størrelsen av amplikonene og sekvensen av primerne anvendt for PCR for
K-ras
V12 er 357 bp, og for
RAB30
, 130 bp. PCR-reaksjonen ble utført på en 2400 Thermalcycler (Applied Biosystems). Amplifiseringsproduktene ble utsatt for elektroforese på en 3% agarosegel.
DNA Sekvense
For å bekrefte opprinnelsen til den forsterkede sekvens (human eller muse), ble PCR produktene sekvensert. PCR amplikonene ble renset ved hjelp av isopropanol nedbør og deretter sekvensert i både forover og bakover fra minst to uavhengige amplifiseringsprodukter. Renset DNA ble fortynnet og sykle-sekvensert ved hjelp av ABI BigDye Terminator kit v3.1 (ABI, Foster City, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Sekvenseringsreaksjoner ble elektroforert i en ABI3100 genetisk analysator. Electropherograms ble analysert i både fornuft og antisense retninger. De oppnådde sekvenser ble sammenlignet med referanse
Kras
sekvens (GenBank DQ893829) og
RAB30
sekvens (GenBank NM_014488).
Southern Blot
Merket SW480 genomisk DNA ble hybridisert til de følgende cellelinjer: SW480 (positiv kontroll); NIH3T3 (negativ kontroll), og en pool av
K-ras
positive cellekloner avledet fra NIH3T3 utsatt for humant serum fra en pasient med kreft i tykktarmen. Ti ug av høy molekylvekt genomisk DNA fra hver DNA-prøve ble spaltet med
Hind III plakater (New England Biolabs). DNA-fragmentene ble separert ved elektroforese i en 0,8% agarosegel, denaturert og overført på nylonmembran (Amersham). Hybridiseringen ble utført i en oppløsning av BM Chemiluminiscence Blotting-sett (Roche Applied Science) inneholdende DNA-probe (100 ng /ml) i 20 timer ved 42 ° C. Blottene ble vasket i henhold til høy-stringensbetingelser i 0,1 x SSC, 0,1% SDS i 90 min ved 65 ° C, inkubert i streptavidin i 30 minutter ved romtemperatur, plassert på Hyperfilm ECL (GE Healthcare Life Sciences) og eksponert for 60 sek.
SNP Array Hybridisering og DNA Kopier nummer analyse
DNA fra foreldre SW480 celler, DNA isolert fra supernatanten av SW480 celler, og genomisk DNA fra SB1 celler (NIH3T3 passivt forvandlet av SW480 supernatant) ble hybridisert på 500 K Affymetrix genotypingen matrise innstilt for DNA-kopi nummeranalyse, etter produsenter protokollen. Analysene ble utført ved hjelp av DNA-kopi nummer rørledning i Partek Genomics Suite-programvaren. Alle prøvene ble sammenlignet mot en felles normal menneskelig DNA kopiantall henvisning baseline.
FISH
Fase kjerner og metafase kromosomer av de transfekterte NIH3T3 celler (SB1) ble analysert i standard cytogenetiske preparater, som tidligere beskrevet [35], med en konsensus-sekvens av human utblandet gjentas. Den menneskelige Cot DNA-probe (som er placenta DNA som er overveiende 50-300 bp i størrelse og beriket for repeterende DNA-sekvenser som
Alu Hotell og
KPN
familiemedlemmer) ble merket ved nick oversettelse med digoksigenin-11-dUTP (Roche) ved hjelp av DIG-nick-translasjon Mix (Roche) og detektert ved bruk av en fluorkrom-konjugerte antidigoxigenin antistoff. Ett hundre kjerner ble mikroskopisk analysert
FISH analyse av histologiske snitt av colontumorer av rotter ble gjort som følger:. Snittene ble deparaffinized i xylen og rehydrert i graderte etanol serien. Objektglassene ble forbehandlet med 0,2 M HCl, 8% natriumtiocyanat, og 0.5% pepsin. Etterpå red-fluorescein-merket
ALU
menneske (FISHBright, Kreatech Bioteknologi) og grønn-fluorescein-merket
LINE en
rotte (FISHBright, Kreatech Bioteknologi) prober ble tilsatt samtidig; lysbildene dekket med Dekk og forseglet med gummi sement. Snittene ble denaturert og hybridisert i en hybridizer (Life Technologies) ved 37 ° C over natten. Gummisementen og objektglassene ble fjernet og delene ble vasket stringent ved hjelp av SSC: 2 x SSC i 30 minutter ved romtemperatur, 0,4 x SSC /0,3% NP40 i 5 minutter ved 75 ° C, og 2 x SSC /0,1% NP40 i 4 min ved romtemperatur. Cellekjernene ble kontra ved anvendelse av 4 «, 6»-diamino-2-fenylindol (DAPI) ved en konsentrasjon på 0,1 ug /ml i Antifade (Vector Laboratories). Analysene ble utført ved hjelp av en Zeiss Axioplan fluorescens mikroskop (Zeiss) tilkobles med CytoVision system (Applied Imaging).
Resultater
ekstracellulære DNA Transudødelig Murine cellene som er forbundet med DNA Transfer
Cell-kultur-supernatanter av human malign cellelinjer SW480 og HeLa (dyrket i DMEM med 2% FBS), så vel som i serum av de tre avanserte ubehandlet tykktarmskreftpasienter og to friske kontroller ble tømt av levedyktige celler og celleavfall ved sentrifugering og filtrering (0,45-mikrometer filter). DNA hentet fra disse kildene, (SW480 og HeLa supernatantene) var PCR-positive for mutant human
K-ras
ved kodon 12 og
E6 Kjøpe og
E7
onkogener henholdsvis. De tre serumprøver for kreft kolon pasienter næret
K-ras
mutasjon ved kodon 12, som også ble påvist i DNA ekstrahert fra sine parafininnstøpte primære svulster. Disse materiale (supernatanter og serum av tykktarmskreftpasienter og friske kontroller ble PCR positive for konstituerende menneskelig
DHFR Hotell og
ACTIN
gener (ikke vist). Konsentrasjoner Serum DNA i serum var 2,04, 0,66 og 0,93 ug /ml for pasienter og 0,28 og 0,178 ug /ml for friske individer. Supernatanter fra fem uavhengige cellekulturer fra SW480 som ble tatt ved 80% celle konfluens, hadde en gjennomsnittlig konsentrasjon på 0,1875 ± 0,007 pg /ml. «pasive» trans med supernatanter eller sera ble utført som følger: 0,5 ml (serum eller supernatant inneholdende 1,815 ug eller 0,09 ug henholdsvis) ble tilsatt til 0,5 ml medium (01:01 forhold) av dyrkede murine mottakerudødelige celler NIH3T3 (som ble påvist ved murin cytogenetisk analyse og ved fravær av repeterende human
Alu Yd6
av PCR, ikke vist) i 24-brønners mikrotiterplater. Medium pluss serum eller supernatant ble endret daglig i 7 eller 14 dager (kortere tid for serum på grunn av begrenset mengde), og således ble cellene eksponert daglig til 1,815 ug av DNA inneholdt i serum eller til 0,09 ug av DNA inneholdt i supernatanten DNA. På dag 8 eller 15, antallet transformasjonen foci av mottaker NIH3T3 celler i plast og kolonidannelse i agar var overveldende overlegen for både serum og supernatant (sammenlignet med kontrollgruppen (NIH3T3-celler utsatt for sin egen supernatant og til normalt serum). blant etablerte transformerte kloner, 11 av 27 utsatt for SW480 og 5/9 (eksponert for serum fra pasient med cancer) hadde
K-ras-mutasjon
som påvist ved hjelp av PCR anvendelse av primere spesifikke for amplifisering av humant
K-ras
. Likeledes 8/24 kloner utsatt for HeLa var PCR-positive for
E6 Hotell og
E7
HPV onkogener. tumorigenesis analyser i
nu /nu
hunnmus viste større og raskere voksende svulster fra en pool av kloner «passivt» transfektert med supernatant av SW480 (SB1 basseng) og tykktarmskreft serum (CCPS) sammenlignet med foreldre SW480 celler (+ Ctr), med murine NIH3T3 utsatt til normalt serum (NS), så vel som med foreldre NIH3T3 (-Ctr) (fig. 1 A, B). Disse resultatene bekrefter tidligere observasjoner på den transformerende evne supernatanten av SW480-celler, så vel som de av plasma fra pasienter med kreft [4], [5]. Southern hybridisering av disse NIH3T3-transform dammer av kloner (SB1 basseng) mot genomisk DNA fra SW480 celler viste klare hybridisering signaler, bekrefter horisontal overføring av humant DNA til mottaker museceller (Fig. 1 C). Videre, FISH-analyse av passivt transformerte museceller (SB1) som utsendes positive signaler for humane repetitive sekvenser (fig. 1 D), noe som bekrefter at celletransformasjon ble assosiert med DNA-overføring.
tumorvekst i nakne mus fra » passivt «transformert celler. Raskere og høyere tumorvekst ble observert i SB1 basseng og CCPS basseng (NIH3T3 utsettes for supernatant av SW480-celler og til serum av en pasient med kreft i tykktarmen, henholdsvis). SW480-celler ble anvendt som positiv kontroll, mens NIH3T3 og NIH3T3 eksponert for normalt serum viste i det vesentlige ingen vekst. B. Representative bilder av svulster hos mus fra hver gruppe. C. Southern blot hybridisering av SB1 og CCPS- bassenger av celler mot genomisk DNA fra SW480 celler. Lane SW480 celler er den positive kontrollen og NIH3T3, den negative. En klar hybridisering signal er kun observert i SB1 og CCPS- baner. D. FISH analyse av repetitive menneske sekvenser. Positiv kontroll er humane lymfocytter og murine celler som negativ kontroll. SB1 celler viser sterkt signal. E. Tumorvekst er lik i NIH3T3 aktivt transfektert med genomisk DNA fra SW480 celler (Neo-Geno) og aktivt transfektert DNA ekstrahert fra supernatanten av SW480 celler sammenlignet med ingen vekst i NIH3T3 (-Crt) og transfektert med den tomme vektoren-bare . Positiv kontroll, SW480-celler.
For å demonstrere at den transformerende evne av supernatanten ligger i DNA, 5 ug av renset DNA fra SW480 supernatanten ble ko-transfektert med et eukaryot vektor pNeo anvendelse av lipofektamin (aktiv transfeksjon). Flere genetecin-resistente kloner ble etablert. En pool av disse klonene var i stand til å danne svulster i
nu /nu
hunnmus (Fig. 1 E). Omvendt, «passiv» transfeksjon ved anvendelse av 5 ug av renset DNA (ekstrahert fra cellekulturoverstående) og tilsatt daglig i 14 dager til NIH3T3-celler) var ikke i stand til å transformere NIH3T3-celler og heller ikke for å overføre DNA-sekvenser inn i mottakercellene (som vurdert av PCR av mutant human
K-ras
og
Alu Yd6
, ikke vist).
DNA-utarmet Overstående ikke Transform udødelig Murine Cells
Det det er vist at celle-frie DNA sirkulerer som et kompleks av DNA /RNA-lipoprotein (virtosome) som spontant utgitt av levende celler [29] og dette komplekset kan beskytte DNA mot å bli forringet av sirkulerende nukleaser. For å undersøke dette ble friske supernatanten av SW480-celler eksponert for DNAse I, til proteinase K, og til begge, og deretter ble DNA ekstrahert og elektroforese. Resultatene viste at DNAse jeg ikke klarte å fordøye DNA fullt. På samme måte eksponering av supernatanten til proteinase K bare mildt fordøyd DNA.
