Abstract
Bakgrunn
Nakenrotte (NMR) er en langlivet og kreft resistente arter. Identifikasjon av potensielle anti-kreft og aldersrelaterte mekanismer er av stor interesse og gjør denne arten fremragende for å undersøke anti-kreft strategier og forstå aldringsmekanismer. Siden det er kjent at NMR uttrykker høye lever mRNA-nivåer av alfa-2-makroglobulin enn mus, er ingenting kjent om dets struktur, funksjon eller ekspresjon nivå i NMR sammenlignet med den humane A2M.
Resultater
Her viser vi en omfattende analyse av NMR- og humant plasma-A2M, og viser en annen prediksjon i glykosylering av NMR-A2M, noe som resulterer i en høyere molekylvekt sammenlignet med humant A2M. I tillegg fant vi en høyere konsentrasjon av A2M (8,3 ± 0,44 mg /ml
vs
. Og 4,4 ± 0,20 mg /ml) og en lavere total plasmaproteininnhold (38,7 ± 1,79 mg /ml
vs
. 61,7 ± 3,20 mg /ml) i NMR i forhold til menneske. NMR-A2M kan transformeres ved metylamin og trypsin som resulterer i en konformasjonsendring som ligner på human A2M. NMR-A2M er synlig ved en polyklonale antistoff mot humant A2M. Bestemmelse av tryptisk og anti-tryptisk aktivitet av NMR og humant plasma viste en høyere anti-tryptisk aktivitet av NMR-plasma. På den annen side ble mindre proteolytisk aktivitet funnet i NMR plasma sammenlignet med humant plasma.
Konklusjon
Vi fant transformert NMR-A2M binding til dets spesifikke reseptor LRP1. Vi kunne demonstrere lavere protein uttrykk for LRP1 i NMR levervev sammenlignet med humant men høyere uttrykk av A2M. Dette ble fulgt av en høyere EpCAM proteinekspresjon som sentral adhesjonsmolekyl i progresjon av kreft. NMR-plasma var i stand til å øke vedheft i menneskelig fibroblast
in vitro
mest sannsynlig ved å øke CD29 protein uttrykk. Dette er den første rapport som viser likhetene samt tydelige forskjeller mellom A2M i NMR og humant plasma. Dette kan være direkte knyttet til den spennende fenotypen av NMR og antyder at A2M kan sannsynligvis spiller en viktig rolle i anti-kreft og anti-aldringsfenomener i NMR
relasjon:. Thieme R, S Kurz, Kolb M, Debebe T, Holtze S, Morhart M, et al. (2015) Analyse av Alpha-2 makroglobulin fra langlivede og kreft-Resistant Nakenrotte og Human Plasma. PLoS ONE 10 (6): e0130470. doi: 10,1371 /journal.pone.0130470
Academic Redaktør: Klaus Roemer, Universitetet i Saarland Medical School, TYSKLAND
mottatt: 10 mars 2015; Godkjent: 20 mai 2015; Publisert: 23 juni 2015
Copyright: © 2015 Thieme et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Europäischer Sozialfond – ESF www.esf.de (100098250) til GB.. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Leibniz Association (SAW 2012) www.leibniz-gemeinschaft.de/til MP
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Nakenrotte rotte~~POS=HEADCOMP (
Heterocephalus glaber
) (NMR) som bor i Øst-Afrika er en eusocial koloni bygning pattedyr (O’Rianin et al. 2008 Ecology of Social Evolution). Dermed er eusosialitet mest sett med insekter som maur, bier, veps, og andre, er NMR en av de sjeldne kjente eusocial pattedyr-spesielt beskrevet så langt bare i familien
Bathyergidae
. NMR har noen uvanlige egenskaper i forhold til andre pattedyr. NMR er en svært lang levetid gnagerarter, som har en levetid på over 30 år [1]. Dette tyder på spesifikke aldringsmekanismer, som ledsages eller potensielt forårsaket av kreft motstand. Så langt, ingen svulst ble aldri observert i NMR [2]. Det er sterke indikasjoner på at levetiden av NMR er i hovedsak opprettholdes av kreft motstand, fordi neoplasi er den primære årsaken til død i andre pattedyrarter som mus [3]. Det er en voksende interesse for å bringe på linje lang levetid og kreft motstand ved å identifisere underliggende molekylære mekanismer for å forstå de mest fascinerende og ekstraordinære NMR fenotyper.
Tidligere en håndfull artikler hadde blitt publisert, og gir tips og forsøk for å forklare disse mekanismer i NMR [4-8]. Dermed sosiale og biologiske /biokjemiske funksjoner er adduserte. Fra et sosialt synspunkt eusocial levevis med en samarbeidende vare på avkommet og mellom generasjoner forplantning av ferdigheter [2] samt å leve i en gruppe er mye assosiert med et lengre liv [9]. En annen helsestøtteeffekt er forbundet med den underjordiske liv. Disse dyrene er beskyttet mot ekstreme klimaforhold og rovdyr, noe som favoriserer lang levetid og lavere dødelighet [2, 10]. På den cellulære og biokjemiske nivå NMR fremviser flere unike anti-tumor egenskaper som langsom cellevekst, effektiv kontakt hemming, dannelsen av høy molekylmasse hyaluronan og optimalisert proteinsyntese [11].
Alpha-2-makroglobulin ( A2M) er et stort ekstracellulært protein i blodet. Nylig ble A2M transkripsjonsnivåer vist seg å være økt i NMR leveren, sammenlignet med den for mus ved 140 gangers [12]. Så langt er NMR-A2M protein ikke ytterligere karakterisert. Den menneskelige motstykke er en homotetrameric protein på 720 kDa spille en rolle i å opprettholde homeostase av cytokiner og vekstfaktorer [13]. Funksjonen til A2M hos mennesker er delvis forskjellig i forhold til gnagere (f.eks mus, rotter og kaniner), hvor A2M er en stor akuttfaseprotein [14]. Generelt er A2Ms fra forskjellige arter svært godt beskrevet og kort karakterisert ved en gjennomgang av Sottrup-Jensen [15]. Menneskelig A2M er i stand til å binde et meget stort utvalg av cytokiner, vekstfaktorer, spesielt TGF-SS1, TNF-alfa og IL-1SS og hormoner [16-18]. En annen viktig funksjon er evnen til å inaktivere et stort utvalg av proteinaser, som trypsin, chymotrypsin, elastase eller metalloproteinaser. Ved binding av proteinaser, A2M gjennomgår en større konformasjonell forandring, noe som resulterer i ekspresjon av tidligere skjulte reseptor-bindingsseter på overflaten. Dette gjør det såkalte «transformert A2M» (A2M *) til å binde til dets spesifikke reseptor, kalt LRP1 (CD91) [19, 20]. Ligering av LRP1 induserer reseptor-mediert hurtig fjerning av de A2M-proteinase-komplekser fra blod og vev [21]. Andre proteiner som vekstfaktorer og cytokiner er bundet reversibelt til A2M. Derved A2M oppfyller viktige funksjoner med hensyn til vev homeostase av disse molekylene [22, 23].
A2M er foreslått å spille en viktig rolle i kreft og aldring [24, 25]. Det humane A2M blodkonsentrasjonen er negativt korrelert med alder, avtagende fra omtrent 4 mg /ml ved fødselen til 1,5 mg /ml i eldre [26]. Derfor dens funksjon i blod homeostase og aldersrelaterte sykdommer er av stor klinisk og geriatrisk interesse. Viktige faktorer ansvarlig for malignitet involverer også voksn molekyler. Siden det er kjent at NMR er motstandsdyktig kreft, de er av skadelig interesse og en dypere analyse av adhesjonsmolekyl ekspresjon og funksjon i NMR er berettiget. For eksempel, ble transkriptet nivået av epiteliale adhesjonsmolekylet EpCAM funnet å være økt i NMR leveren ved 290fold sammenlignet med mus, som tilveiebringer sterke bevis for at celle koherens og integritet er påvirket av ekspresjon av adhesjonsmolekyler [12].
i denne studien analyserte vi plasma A2M fra NMR i forhold til sin menneskelige homolog. For første gang kan vi vise en forhøyet plasmaproteinnivået av NMR-A2M og likheter samt tydelige forskjeller i molekylstrukturen og funksjonen sammenlignet med humant A2M. Videre har vi overraskende funnet NMR plasma for å øke celle-adhesjon i humane fibroblaster. I tillegg har vi beskrevet og kommentert den NMR-A2M henhold til menneske A2M protein med posttranslasjonelle modifikasjoner og kunne identifisere likheter og forskjeller, som kan spille en rolle i NMR-relaterte særegenheter.
Resultater
i silico sekvens analyserer
Searching for NMR-A2M sekvenser i de relevante databasene resulterte i to tilgjengelige mRNA sekvenser. Den første (Ref.Seq .: NM_001279851.1; Uniprot: E3VX34_HETGA) ble beskrevet av Szafranski et al. (Database inngang) og en andre ble forutsagt av genomisk sekvensering av NMR-genomet (GenBank: JH171302.1; Uniprot: G5BPM1_HETGA) [27]. Bare transkripsjon av NMR-A2M hadde blitt verifisert og beskrevet så langt. Eksistensen av NMR-A2M protein ble bare forutsagt. Sekvensen av NMR-A2M ga 1475 (Uniprot: E3VX34_HETGA) og 1595 [27] aminosyrer, henholdsvis, noe som resulterer i en beregnet molekylmasse på 162,519 og 175,364 kDa kDa, respektivt. Sammenligning av disse resultater med den humane sekvensen A2M, NMR-sekvensen beskrevet av Szafranski et al. (2010) er mer lik enn den til Kim et al. (2011). Derfor er alle følgende analyser ble gjort med den mer lik NMR-A2M sekvens sammenlignet med den humane en (Uniprot: E3VX34). (Tabell 1)
NMR-A2M har en total mRNA identitet på 85% og en likhet på proteinsekvens på 98% for humant A2M. Fylogenetisk analyse ved ClustalW2 resulterte i et nært forhold til NMR-A2M til Ansell mol rotte og marsvin A2M (figur 1).
humane A2M, så vel som NMR-A2M har en signalerings peptidsekvens (aa stilling 1-23) ved N-terminus, som ble kommentert av likhet. Agnet regionen, som er et kjennetegn på A2M i alle arter, ligger i NMR i posisjon 688 til 738. Den inneholder tre trypsin kutteseter på arginin er 703, 711 og 729 (tabell 2). Analysen av N-glykosyleringsseter resulterte i 10 potensielle N-glykosylerte aminosyrene i posisjon 55, 70, 263, 396, 410, 870, 992, 1078, 1367 og 1427. Derved NMR-A2M aksjer 7 N -glycosylation områder med menneske A2M, som har åtte spådd N-glykosyleringsseter. N-glykosyleringssete i posisjon 247 av det humane A2M er ikke til stede i NMR-A2M. Alle disulfidbroer i menneske A2M er identifisert i NMR-A2M av likhet (tabell 2). Potensialet iso-glutamyl-lysin isopeptide tverrbinding i posisjon 693 i det humane A2M kan bli funnet i NMR-A2M ved den respektive posisjon 694 (tabell 2). Den Cys972 og Gln975 ansvarlig for thiolester binding i menneske A2M er plassert i posisjon Cys973 og Gln976 i NMR-A2M
fylogenetisk analyse av A2M proteinsekvenser ble gjort ved hjelp av ClustalW2 onlinetool (https: //www. .ebi.ac.uk /Verktøy /fylogeni /clustalw2phylogeny). De sammenlignet A2M proteinsekvenser var avlesning fra Uniprot database.
Plasma sammensetning
Ulike varianter av polyakrylamid gel electrophorese (PAGE) ble gjort for å undersøke protein fordeling av NMR plasma generelt og tilstedeværelsen av karakteristiske trekk ved NMR-A2M spesielt.
Native polyakrylamid gradient gelelektroforese (native PAGE) viste NMR-A2M å kjøre i en posisjon synes å ha en lavere elektrisk mobilitet enn A2M i humant plasma og renset human A2M, som kan indikere en høyere molekylmasse (figur 2A). Nativt humant A2M er en tetramer med en molekylvekt på 720 kDa. Ved hjelp av SDS-PAGE gradient (4-20%) under ikke-reduserte betingelser NMR-A2M beveger seg som en dimer med en omtrentlig molekylvekt lik human A2M (360 kDa) (figur 2B). Under reduserte betingelser NMR-A2M blir spaltet til monomerer på 180 kDa som ligner på human A2M (figur 2C). Videre ble den totale NMR-plasmaproteinkonsentrasjon funnet å være lavere enn i human (38,7 ± 1,79 mg /mL
vs
61,7 ± 3,20 mg /ml;. N = 5) (figur 2D). Humanplasma ser ut til å inneholde en høyere innhold av immunglobuliner (figur 2A og 2B), og den totale protein mønster synes å være forskjellig, også. NMR i motsetning til humant plasma viser forskjellige proteinbånd (avstand mellom Alb og IgG) i ikke-redusert SDS-PAGE (mellom markør 43 kDa og 212 kDa). I det minste i humant plasma, haptoglobin- og Gc-protein gruppe genetiske varianter bevege seg i denne posisjonen. Ikke desto mindre viste en samlet analyse av de tre forskjellige typer av elektroforese sterkere båndintensitetene av A2M i NMR-plasma sammenlignet med humant plasma, noe som indikerer en høyere A2M innhold i NMR.
NMR, humant plasma (30μg) og renset human A2M (2,5 ug) ble separert ved nativ PAGE (4-20%) (A) og SDS-PAGE (4-20%) under ikke-reduserende (B) og reduserende betingelser (C). Proteinkonsentrasjonen av NMR og humant plasma ble bestemt i henhold til Bradford (** – p 0,01) (D). Proteinekstrakter fra human lever og NMR (20 ug hver) ble separert ved SDS-PAGE (4-20%) (E) og underkastet Western blot-analyse ved anvendelse av et polyklonalt kanin-anti-humant A2M antistoff (5 pg /ml) og en monoklonal mus ß-subenhet spesifikke anti-humant LRP1 antistoff (10 ug /ml) (F). (A2M -alpha-2 makroglobulin, Alb-albumin, IgG-immunoglobulin, TRF-transferrin).
Den mest tallrike protein i NMR plasma er albumin som i humant plasma. Transferrin med en molekylvekt på 80 kDa i mennesker var mindre vandrende i NMR, noe som indikerer forskjellige molare masser eller variasjoner i glykosylering.
Protein og immunoblotanalyse av leverekstrakter fra NMR og mennesker åpenbarte et høyt antall av lav molekylvekt proteiner for begge arter. En bemerkelsesverdig forskjell er forekomsten av en høy molekylmasse proteinarter i NMR lever (figur 2E). Dette proteinbånd ble påvist å reagere med antistoffer mot humant A2M ved western blot (Fig 2F) viser en høyere A2M proteinmengden i NMR leverekstrakt enn i menneske. I kontrast, ble en lavere mengde immunoreactive LRP1 oppdaget i NMR leveren ekstrakt sammenlignet med humant (Fig 2E).
A2M aktivering
A2M er kjent for å forekomme i to forskjellige konforme stater. Binding av proteinaser, resulterer i en konformasjonsendring mot en mer kompakt struktur av proteinet.
In vitro
, for eksempel en konformasjonsendring overgang av A2M kan oppnås også ved behandling av A2M med metylamin, som er kjent for å spalte A2M s tioester-binding og dermed utløser en større konformasjonsendring i likhet med proteinase behandling. Den konformasjonsendring kan visualiseres ved den såkalte sats PAGE (figur 3A). Denne metoden gjør det mulig å skille mellom de to ulike former for A2M, slow (native form) og fast-migrerende (aktivert form med det spaltede tioester bond) form, som sies å være forårsaket på grunn av endringer i globularity [28]. Binding av trypsin, så vel som omsetning med metylamin gav lignende bevegelige mønster, avhengig av fullstendigheten av konformasjonsendring, i begge, NMR og humant plasma. Totalt sett A2M fra NMR ble vist å være reaktiv mot metylamin og trypsin og dermed viser tilsvarende funksjonelle egenskaper som sin menneskelige analoge. Imidlertid synes konformasjonsendring convertibility å være mer komplisert i NMR-A2M indikeres av utseendet på proteinbåndene mellom posisjonene til de langsomme og raske former for menneskelig A2M.
RENTE elektroforese ble gjort ved hjelp av 50 mikrogram innfødte NMR og humanplasma og 50 ug av metylamin og trypsin behandlet plasma, respektivt. Isolert menneskelig A2M fungerte som kontroll. Metylamin samt trypsin skift menneskelige og NMR-A2M fra treg til rask bevegelse form. For å visualisere de respektive proteinbånd ble gelen farget med Commassie (A). Renset LRP1 (100-500 ng) ble observert til en nitrocellulosemembran og inkubert med enten 10 ug /ml humant eller NMR plasma. BSA tjente som negativ kontroll. A2M binding til LRP1 ble påvist ved et polyklonalt kanin-anti-humant A2M antistoff (5 pg /ml) (B). For å blokkere bindingen av A2M til LRP1 den flekket LRP1 ble pre-inkubert med 1,5 pM RAP i 30 minutter før tilsetningen av human eller NMR plasma (C). (☐ – innfødte /langsom form for A2M, ◆ transformerte /fast form av A2M).
Receptor Binding av A2M fra NMR og humant plasma
Menneske A2M (transformert A2M ) er kjent for å binde spesifikt til løselig eller immobilisert LRP1. For at renset human LRP1 ble oppdaget til en nitrocellulosemembran og inkubert med humant eller NMR-plasma, respektivt (figur 3B). Som vist A2M * fra begge arter binde seg til den immobiliserte reseptor indikerer tilstedeværelse av reseptorbindende domener i NMR-A2M. I kontrast, ble ingen binding observert å immobilisert albumin bekreftende spesifisitet for interaksjon. Reseptor knytte protein-RAP er kjent for å blokkere binding av forskjellige ligander til LRP1. Faktisk RAP ble funnet å redusere samspill av NMR-A2M * til LRP1 (Fig 3C). Resultatene indikerer at A2M fra NMR inneholder konservert område ved den C-terminale domene stand til å binde til humant LRP1.
A2M kvantifisering og immunologisk påvisning
A 7% SDS-PAGE ble brukt til å evaluere konsentrasjonen av A2M i plasma av NMR og menneske. Renset human A2M tjente som indre standard. De Coommassie blå fargede geler ble skannet og analysert ved hjelp ImageJ programvare. 30 ug NMR og humant plasmaprotein, henholdsvis, ble lastet inn i gelene. Å generere en standardkurve med renset human A2M, den beregnede A2M konsentrasjonen i NMR og humant plasma var 8,3 ± 0,44 mg /ml og 4,4 ± 0,20 mg /ml, henholdsvis (n = 5). Tilsvarende, representerer A2M 6,9 ± 0,37% av total plasmaproteininnhold hos mennesker og 15,3 ± 0,70% av totalinnholdet plasmaprotein i NMR (figur 4A). I tillegg ble immunreaktiviteten av NMR-A2M kontrolleres ved hjelp av en konformasjon spesifikt monoklonalt mus anti-human A2M antistoff (a-1), som er kjent for å gjenkjenne en romlig C-terminal epitop eksponert bare i transformert A2M (figur 4B) og et polyklonalt kanin anti-humant A2M antistoff (figur 4C). For å teste det monoklonale antistoff, ble prøvene kjørt obligatorisk i native geler gradient før blotting, fordi SDS er kjent for å endre den romlige strukturen av A2M. Som det sees, det monoklonale antistoff detektert av den transformerte humane A2M (A2M *), men ingen reaktivitet ble observert når det gjelder NMR-A2M (figur 4B). På den annen side, det polyklonale kaninantistoff ventelig detektert human så vel NMR-A2M (figur 4C), sistnevnte med tydelig lavere reaktivitet på grunn ca. 3fold mengden av NMR-A2M fra plasma er nødvendig for å få en tilsvarende immunologiske signalintensitet som med menneskelig A2M (fig 4C). Disse resultatene underbygge data innhentet ved densitometrisk analyse av farget proteinbånd (Fig 4A).
Fastsetting av A2M i plasmaprøver ble utført ved elektroforese i 7% SDS-gel ved hjelp av NMR og humant plasma, 30 mikrogram hver og renset human A2M (1-2,5 ug). A2M ble kvantifisert ved farging Commassie hjelp av isolert human A2M for å fremstille en kalibreringskurve (A). Western blot analyser ved anvendelse av en gradient innfødt PAGE (4-20%) ble anvendt for å påvise den transformerte form av A2M ved hjelp av alfa-1-antistoff (B) og en 7% ikke-reduserende SDS-PAGE for å detektere A2M med et polyklonalt antistoff ved å bruke 9 og 3 ug NMR eller 3 ug humant plasma og 250 ng isolert human A2M (C).
anti-proteolytisk og proteolytisk aktivitet av humant plasma og NMR
Plasma fra alle pattedyr og mest sannsynlig NMR inneholder forskjellige proteinaseinhibitorer og proteolytiske enzymer som er involvert i bestemte baner som blodkoagulering /fibrinolyse og komplementsystemet eller tjene generelle funksjoner. Det er kjent at A2M binder og inaktiverer proteinases av alle klasser og særegen. Det var derfor av interesse å analysere den anti-proteolytiske aktivitet av helplasma ved hjelp av trypsin som referanse enzym. Det trypsin-inhiberende kapasitet ble målt ved å beregne mengden av plasma i stand til å inhibere 0,05 ug trypsin. Som vist i figur 5, av den hemmende kapasiteten ved lavere proteininnhold (2,5 til 20 ug) var høyere i humant enn i NMR plasma, representert ved IC
50 av 17,08 ug for human og 25,11 ug for NMR-plasma. Men ved høyere plasmaproteinkonsentrasjoner et høyere samlet inhibitorisk aktivitet ble observert i NMR-plasma sammenlignet med humant plasma. Det var mindre rest tryptisk aktivitet i plasma NMR (8,06%) sammenlignet med humant plasma (17,22%) ved anvendelse av 100 ug plasmaprotein for å hemme 0,05 ug trypsin (figur 5A og 5B).
inaktivering av 0,05 ug trypsin ble titrert med økende mengder av human (A) eller NMR (B) plasma som tilsvarer 1-100 ug protein og målt ved omdanning av BAPNA for p-nitroanilin ved 405 nm. Den indre tryptisk aktivitet av NMR og humant plasma ble bestemt ved å måle omdannelsen av BAPNA til p-nitroanilin som induseres av 1-100 ug plasmaprotein (C). (* -p 0,05)
Den iboende proteolytisk aktivitet av mennesker og NMR plasma ble bestemt ved spalting av BAPNA til p-nitroanilin. NMR plasma har en betydelig lavere endogene proteolytiske aktivitet enn humant plasma (figur 5C). Reflekterer 100 mikrogram NMR plasma mindre proteolytisk aktive (ca. 40%) enn tilsvarende mengde humant plasma. Dette kan forklares med høyere konsentrasjon av hoved proteinase inhibitor A2M.
adhesjonsmolekyler henhold NMR-A2M behandling
Neste generasjons sekvense data allerede indikert høy ekspresjon av adhesjonsmolekyler i NMR leveren [12 ]. Vi kunne underbygge disse resultatene på proteinnivå og fant høyere uttrykk av EpCAM protein i NMR leveren ekstrakt sammenlignet med humant (Fig 6A). Neste vi hypotese at komponentene i NMR-plasma kan modulere ekspresjonen av celleadhesjonsmolekyler, og derved celleadhesjon. Derfor, analyserte vi klebe egenskapen av dyrkede humane fibroblaster i en såkalt trypsination-adhesjonsanalysen. Kulturmedium av humane fibroblaster ble supplert med 0,3 eller 1% NMR plasma. Tilskudd med PBS og 1% humant plasma tjente som kontroller. En betydelig økning i celleadhesjon ble observert ved supplementering med 1% NMR plasma (figur 6B). For å målrette spørsmålet, som adhesjonsmolekyler kan være ansvarlig for den økte vedheft, analyserte vi CD29, CD44 og EpCAM av western blot analyse hos kontrollgruppen og i 0,3 og 1% NMR plasma behandlet humane fibroblaster. Det ble observert en økning i CD29 protein mengde når fibroblaster ble behandlet med 0,3 og 1% NMR plasma. På den annen side, CD44 endret seg ikke under den samme behandling. EpCAM ble uttrykt på en meget lav mengde i fibroblaster, men avtok videre under NMR plasma behandling (Fig 6C).
Bestemmelsen av EpCAM protein i NMR og humane leverprøver ble analysert ved elektroforese i 10% SDS- under anvendelse av 20 ug protein i forbindelse med immunblotting ved bruk av et monoklonalt muse anti-humant EpCAM-antistoff (A). Humane fibroblaster ble dyrket i medium supplert med 0,3 eller 1% NMR plasma for 24 timer, og kontroller ble supplert med PBS (CTR) eller 1% menneske (hu) plasma), henholdsvis. Celler ble behandlet med trypsin /EDTA-løsning for nøyaktig 1 minutt, vasket og de gjenværende adherente celler ble farget med Gentiana oppløsning. Absorbansen av frigitt fargestoff er direkte proporsjonal med antallet adherente celler (B) (** – p 0,01; * – 0,05). Western blot-analyse for CD29, CD44, EpCAM og GAPDH ble utført ved elektroforese i 8% SDS-gel ved bruk av 10-25 ug protein etter 0,3 eller 1% NMR plasma tilskudd i 24 timer. CD29, CD44, EpCAM og GAPDH ble påvist med respektive monoklonale antistoffer (C).
Diskusjoner
I denne studien vi utført en komparativ analyse av plasmakomponenter fra det langlivede gnager NMR med den fra mennesker. På grunn av flere særegenheter i NMR, som kreft motstand og lang levetid disse undersøkelsene er av høy vitenskapelig interesse. Fra våre resultater foreslår vi at noen særtrekk kunne i det minste delvis forklare de uvanlige egenskapene til NMR.
Nylig genekspresjonsanalyser i leveren av NMR og mus viser 660 gener betydelig 5fold overuttrykt [12]. Mest fremtredende uttrykk var relatert til plasma-inhibitor A2M og proteiner involvert i celle-celle interaksjon og ROS forsvarsmekanisme. For å belyse kreft resistente mekanismer vi sammenlignet med to langlivede art, NMR og mennesker, for å illustrere potensielle anti-kreft mekanismer for menneskelig velvære.
I en tidligere studie har vi vist at aldring er sammen med en betydelig nedgang på A2M nivå i blodet [26]. I dag, en rekke studier beskrive fremragende funksjon av A2M i regulering av celler og vev homeostase. Dette proteinet er unik fordi den hemmer proteinaser av alle klasser er involvert i metabolismen av sykdomsrelaterte vekstfaktorer og cytokiner, og i patogenesen av forskjellige sykdommer så som kreft, Alzheimers sykdom, infeksjon og inflammasjon [24, 29-31] .
Disse funnene bedt oss å fokusere på analyse av strukturelle og funksjonelle egenskaper av A2M fra begge arter basert på hypotesen om at NMR data kan gi betydelige bidrag til å identifisere anti-kreft strategier hos mennesker.
Ulike funksjoner av A2M er mediert gjennom binding til sin reseptor, LRP1. Denne enorme transmembranprotein (600 kDa) er involvert i patogenesen av aterosklerose, kreftcelle migrering og invasjon, lipid metabolisme, så vel som clearance av Alzheimer-peptid amyloide ß [32-35]. LRP1 binder mer enn 30 forskjellige ligander og viser den raskeste og mest effektive clearance system av protein ligander fra blod og vev. Nylig ble det vist at leptin danner komplekser med A2M og fjernes fra blodet ved reseptor-mediert endocytose gjennom LRP1. Datamaskin-simulering av dette ternære interaksjonen viste at den stasjonære konsentrasjonen av plasma leptin er sterkt påvirket av nivået av A2M [36]. Dette er av betydning fordi andre vekstfaktorer som TGF-SS1 og VEGF årsaksmessig involvert i tumorprogresjon også bindes til A2M og blir fjernet ved den samme mekanisme. Videre LRP1 fungere som co-reseptor for mange signal reseptorer som involverer i Wnt /ß-catenin vei, UPA /uPAR-systemet og andre [37]. Som et viktig hemmer av tumor-assosierte metalloproteinaser og regulator i urokinase-type plasminogen aktivator (uPA) system i kreft, styrer A2M tumorcelle-migrering og invasjon [38]. Disse få eksemplene kan vise betydningen av A2M-LRP1 akse i regulering av vev og blod homeostase.
For første gang vi identifisert A2M i NMR ved direkte sammenligning med menneskelig A2M og ved immunologiske metoder. Vi har funnet at NMR plasma inneholder omtrent to til tre ganger høyere nivå av A2M sammenlignet med humant plasma. Testing kryssreaktivitet av NMR-A2M med et panel av anti-human A2M monoklonale antistoffer vi ikke klarte å se noen reaktivitet. Selv den reseptor-bindende domener (RBD) spesifikt antistoff, alfa-1, som er kjent for å reagere bare med transformert A2M, viste ingen binding. Vi har nylig funnet ut at dette antistoffet gjenkjenner konsensus peptidsekvenser, S1349-R-S1351 … D1330-E-P-K1333, to adskilte epitoper som består av en konformasjonsendring epitop i RBD av menneskelig A2M [39]. Fravær av binding til NMR-A2M var mest sannsynlig på grunn av aminosyre-utvekslingen i splitten epitop til N1350-R-P1352 … D1331-GP-K1334 i NMR, ved å erstatte 3 av 7 aminosyrer i posisjonene 1, 3 og 5 i epitop. I motsetning til binding av NMR-A2M til dets spesifikke reseptor (LRP1) som eksperimentelt bevist kunne forventes, fordi de to essensielle lysinrestene ved posisjon 1395 og 1402 (NMR: Lys1393 og Lys1400) og lupen stabiliserende Cys1355 og Cys1471 av humant A2M (NMR: Cys1353 og Cys1368) er til stede i NMR-A2M [40]. Den forutsagte åtte beta-ark og en alfa-heliks kan finnes ved likhet i NMR-A2M [20]. De fleste strukturer som finnes i det menneskelige A2M var også til stede i NMR (disulfidbroer, N-glykosyleringsseter, agn-region, trypsin-bindingsseter). Men prediksjon av N-glykosyleringsseter i NMR-A2M avdekket ytterligere to numre (tabell 2). Mens den menneskelige A2M har 8 N-glykosyleringsseter, har NMR protein 10. Dette kan være en forklaring på den høyere molekylvekt av NMR-A2M sett på mors PAGE (figur 1A), siden dette ikke kan forklares utelukkende av NMR-A2M aminosyresammensetning. Imidlertid kan også andre modifikasjoner, som O-glykosylering kan bidra til dette fenomenet, ettersom O-glycosylations er de for det meste forekommer og mest kompliserte endringer i eukaryoter med en artsspesifikk måte.
En mulig mekanisme som er ansvarlig for ekstreme kreft motstand i NMR var tidligere vist [5]. En høy molekylmasse hyaluronan (HA) ble identifisert, som utskilles fra NMR-fibroblaster, men ikke av fibroblaster fra menneske eller mus. Så lenge disse celler produserte HA de ble hindret fra malignitet. Banket ned av HA syntetisere enzym (has2) eller overekspresjon av nedverdigende enzym (HYAL2) resulterte i økt malignitet av NMR fibroblaster. Teksturen, sammensetning og stabilitet av den ekstracellulære matriks er å bestemme kjennetegnene på malignitet. Den store reseptor for HA i mennesker og mus er CD44. Blokkering CD44 forårsaket dyrkede NMR celler til å vokse raskere [5]. Nylig ble det vist at LRP1 binder til CD44 og dermed regulerer de klebende egenskapene til tumorceller [41]. Våre funn at NMR-A2M binder seg til LRP1 og at denne bindingen ble forstyrret av RAP kan kaste lys over den mulige rollen A2M i dette samspillet. Dyrkning av humane fibroblaster med 1% NMR plasma viste en økning i adhesjon av disse cellene i forhold til tilsetningen av humant plasma. Et Western blot-analyse viste CD29 økes i henhold til NMR plasma tilskudd (figur 6C). Vi kunne ikke observere endringer i CD44 uttrykk i humane fibroblaster ved NMR-plasma behandling som ville forklare den observerte økningen i celle adhesjon. En grunn kan være at andre celleadhesjonsmolekyler som integrin CD29. Den primære funksjon av integrin familiemedlemmer er å formidle celle-celle og celle-matrise-adhesjon. NMR-plasma økte ekspresjon av CD29, som kan derfor stabilisere disse interaksjonene gjengivelses fibroblast mindre følsom for trypsination. EpCAM (CD326) uttrykkes ved epitel av friske individer, men overexpressed i de fleste karsinomer. I de fleste tumorer høy EpCAM ekspresjon var assosiert med metastase og dårlig prognose. Men for forskjellige tumortyper motstridende resultater har blitt rapportert [42]. Ikke desto mindre er det blitt rapportert at P-catenin aktivering indusert EpCAM transkripsjon via binding av TCF /Lef transkripsjonsfaktor til den EpCAM-promoteren [43]. Dette er av interesse som vi kunne nylig vise at A2M hemmer Wnt /ß-catenin sti i tumorceller [24]. Dette kan forklare den hemmende effekten av A2M på EpCAM uttrykk (Fig 6C).
Derfor vi trukket som en viktig faktor ansvarlig for den økte celle adhesjon ved NMR plasmaeksponeringen av humane fibroblaster kan være A2M.
