Abstract
Septins er en familie av GTP-bindende cytoskjelett proteiner uttrykt i mange solide svulster. Septin 9 (
SEPT9
) spesielt ble funnet overexpressed i diverse karsinomer. Heri studerte vi ekspresjon av SEPT9 isoform ett protein (SEPT9_i1) i humane prostata cancer prøver. Vi benyttet immunhistokjemisk farging for å studere ekspresjonen av SEPT9_i1 protein. Farging nivå ble analysert i forbindelse med kliniske egenskaper og patologisk Gleason grad og scorer. Femti menneskelige prostata kreft prøver (42 primærsvulster og 8 metastaselesjoner) ble farget av SEPT9_i1 antistoff og analysert. SEPT9_i1 protein ble uttrykt i prostatakreftceller, men fraværende i normale epitelceller. Intensiteten av farging ble korrelert proporsjonalt til for-behandlingsprostataspesifikt antigen (PSA) i blodet og Gleason score (
P
0,05). SEPT9_i1 ble sterkt uttrykt i alle metastatiske lesjoner. En betydelig ASSOCATION mellom SEPT9_i1 uttrykk og høy Gleason score på multivariat lineær regresjonsanalyse ble funnet. Vi konkluderer med at SEPT9_i1 er uttrykt i prostatakreft høyverdig som tyder på det har en betydelig rolle i prostata tumorigenesis og at det kan tjene som en molekylær markør for prostata tumorprogresjon
Citation. Gilad R, Meir K, Stein jeg, tysk L, Pikarsky E, Mabjeesh NJ (2015) High SEPT9_i1 Protein Expression er assosiert med High-Grade prostatakreft. PLoS ONE 10 (4): e0124251. doi: 10,1371 /journal.pone.0124251
Academic Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 07.11.2014; Godkjent: 11 mars 2015; Publisert: 21 april 2015
Copyright: © 2015 Gilad et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Dr. Miriam og Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (AMRF). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er andre til lungekreft i forekomst over hele verden og er den nest vanligste kreftformen, og en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall blant vestlige menn [1]. Den primære risikofaktorer for prostatakreft er alder og familiens historie. Prostatakreft blir mer vanlig med økende alder påvirker menn i alderen 50 eller mer [2]. Prostata adenokarsinom metastasizes hovedsakelig til bein og mindre vanlig til lymfeknuter, og kan lokalt forhånd for å invadere naboorganer. Aktuelle behandlinger inkluderer hormonbehandling, immunterapi og kjemoterapi, men det er ingen kurativ behandling for metastatisk prostatakreft [3, 4]. Derfor er nye strategier for behandling av prostatakreft og identifikasjon og karakterisering av nye molekylære mål som for eksempel interleukin-6 er essensielle [5].
Septins er en familie av GTP-bindende og filamentdannende proteiner, først beskrevet i
Saccharomyces cerevisiae
i en skjerm for gener som regulerer spirende prosessen [6]. Siden da, har septins blitt identifisert i mange andre eukaryoter, som strekker seg fra sopp til mennesker [7-9] med et bemerkelsesverdig fravær i planter [10]. Mange septin isoformer er unormalt uttrykt i karsinom [11], og endrede nivåer av septin uttrykk sterkt korrelert med tumorigen fenotyper som økt cellevekst, bevegelighet, invasivitet, og motstand mot mikrotubulidynamikk forstyrrende reagenser [12, 13].
Vi hadde tidligere identifisert SEPT9_i1, et produkt av transkripsjon SEPT9_v1 som koder isoform en med den største N-terminal forlengelse, som en positiv regulator i hypoksisk vei [14]. SEPT9_i1 samhandler med hypoksi-induserbar faktor 1α (HIF-1α), den oksygen regulerte subenhet av HIF-1, som er en viktig regulator av hypoksisk responsen veien [15]. Interaksjonen er spesifikk for HIF-1α, men ikke til HIF-2α, og det øker HIF-1α proteinstabilitet samt HIF-1 transkripsjonen aktivitet, noe som fører til økt proliferasjon, tumorvekst og angiogenese. HIF-1 er en transkripsjonsfaktor som regulerer reaksjoner og cellulære tilpasning til hypoksi kjøre transkripsjon av mange gener som er viktige for tilpasning og overlevelse etter hypoksi [14]. Blant disse er genene glykolytiske enzymer, den glukosetransportører Glut-1 og Glut-3, endotelin-1, vaskulær endotelial vekstfaktor, karbonsyreanhydrase IX, erytropoietin og [16]. Immunhistokjemiske analyser avslørte at HIF-1α er overuttrykt i mange humane cancere [17]. Videre økte HIF-1 aktivitet er ofte forbundet med økt tumor aggressivitet, terapi motstand, og dødelighet [18].
Vårt tidligere studier i ulike prostata cellelinjer og xenotransplantater viste at SEPT9_v1 mRNA uttrykkes sterkt i human prostata kreftprøver sammenlignet med normal prostata vev [15]. I denne studien, bestemt vi uttrykk for SEPT9_i1 protein i grunnskolen menneskelige prostata kreft vev ved hjelp av immunhistokjemi og korrelert sitt uttrykk med clinicopathologic egenskaper.
Materialer og Metoder
Vevsprøver
The Institutional Review board av det hebraiske universitetet-Hadassah Medical Center godkjent denne studien (IRB-protokollen 0500-12-HMO). Arkivmateriale før år 2000 ble godkjent for bruk av Institutional Review Board av det hebraiske universitetet-Hadassah Medical Center, med en fraskrivelse av informert samtykke, i samsvar med staten Israel Law av genetisk informasjon, 2002. Alle arkiv prøvene brukes i denne studien ble innhentet fra institusjonelle biorepository ved Hadassah Medical Center. Alle studie prøver var før år 2000, og alle ble avidentifisert. Dette var en retrospektiv studie på en serie av 50 parafininnstøpte prostatakreft prøver: 38 fra radikal prostatektomi, 6 fra radikale cystoprostatectomy og 6 fra transuretral reseksjon av prostata (TUR-P). Av denne samlingen ble åtte prøvene ekskludert fra studien på grunn av tekniske problemer i vev behandling forlater 42 primære svulster på forskjellige stadier for sluttvurdering (tabell 1). Åtte ekstra metastaselesjoner fra 8 forskjellige pasienter, benmarg (3), lymfeknuter (2) og bein (3) ble analysert separat. En prøve fra hver pasient ble analysert, og ingen av pasientene fikk neoadjuvant terapi.
Immunhistokjemi
A kanin polyklonalt antistoff rettet mot den N-terminale ende av SEPT9_i1 ble tidligere produsert [15] og videre karakterisert (figur 1A og 1B). Immunhistokjemisk farging ble utført ved hjelp av samme protokoll for alle vev. Kort beskrevet ble 4 um formalinfikserte parafininnstøpte seksjoner deparaffinized, rehydrert og gjenfinning antigen ble utført i 25 mM citratbuffer pH 6 ved oppvarming til 125 ° C i 3 minutter i decloaking kammer (Biocare Medical). Seksjoner ble inkubert med anti-antistoff ved SEPT9_i1. 1: 2000 fortynning over natten ved 4 ° C
HEK-293T embryonale nyre humane celler ble transient transfektert med flagg-SEPT9_i1 konstruere eller tom vektor (EV). (A) Hele celleekstrakter ble fremstilt og analysert ved 4-20% SDS-PAGE og immunoblotting (IB) med antistoffer mot Flag (1: 2000), SEPT9_i1 (1: 3000), preimmunt serum (1: 3000) eller SEPT9_i1 antistoffet (1: 3000) pre-inkubert med 10 pM av immunogene peptidet i 4 timer. (B) De samme cellulære ekstrakter ble underkastet immunoutfelling (IP) ved anvendelse av anti-Flag-antistoff og de immuneprecipitates ble underkastet 4-15% SDS-PAGE og deretter immunoblottet med anti-Flag eller anti-SEPT9_i1 antistoffer. (C) Representant SEPT9_i1 flekker i menneskelige prostata kreft prøver. Resultat 0: ingen SEPT9_i1 flekker, 1: lav SEPT9_i1 beising 2: medium SEPT9_i1 farging og 3: høy SEPT9_i1 farging. Forstørrelse x200, skala bar 50 mikrometer.
Anti-kanin HRP-konjugert antistoff (Vector Labs) ble brukt til å oppdage det primære antistoff. Lysbilder ble utviklet med diaminobenzidine (DAB) og kontra med hematoksylin.
Kvantitativ evaluering av farging og scoret
Alle lysbildene ble vurdert av to uavhengige etterforskere (RG og EP) som var blindet for all klinisk og patologiske data. Intensitet av farging ble scoret som 0 (ingen uttrykk), en (svak), 2 (moderat) og 3 (sterk). Vi utførte også datastyrt bildeanalyse ved hjelp av en ARIOL-SL50 automatisk scanning mikroskop og bildeanalysesystem (Applied Imaging) for å evaluere intensiteten av prøven flekker, hovedsakelig som beskrevet [19]. Lysbilder ble skannet og alle kreft områder ble merket. Fra hver svulst 10 separate felt, tilfeldig valgte, ble analysert og normalisert i henhold til produsentene innstillingen (Hersight modul). Resultatene av analysen er presentert som normalisert gjennomsnittlig intensitet som beregnes av ARIOL-SL50 programvare.
Transient transfeksjon, protein utvinning, immunoutfellingsstudier analyser, og immunoblot analyse
humane embryonale nyre (HEK 293T ) celler ble sådd ut ved 70% konfluens i 6 cm plater og ble transfektert med 3 ug av et plasmid som uttrykker Flag-SEPT9_i1 protein eller tom vektor (EV), ved hjelp av GenePorter transfeksjon reagens (Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, CA) som tidligere beskrevet [15]. Hele celleekstrakter ble fremstilt og proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av en syre bicinchoninic proteinanalysesett (Pierce, Rockford, IL) som tidligere beskrevet [15]. Immunpresipitasjon ble utført med Ezview Red ANTI-FLAG Affinity gel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), og ved å følge produsentens instruksjoner. Proteinene ble deretter analysert ved SDS-PAGE og immunblotting med antistoffer som vises i fig. i hovedsak som tidligere beskrevet [15]. Primære antistoffer ble kanin polyklonalt antistoff til SEPT9_i1, som tidligere var fremstilt [15] og dens tilsvarende pre-immunserum eller i Flag (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Sekundært antistoff ble pepperrot-peroksidase konjugert geit anti-mus eller kanin (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA).
Statistiske analyser
Beskrivende statistikk fra studien prøven ble anvendt for å sammenfatte deltaker egenskaper. Bivariate Spearmans korrelasjonsanalyse ble brukt for å vurdere forholdet mellom «pasientenes kjennetegn» og mener. I en multivariat lineær regresjonsanalyse, utfallet var gjennomsnittlig SEPT9_i1 fargeintensitet. De uavhengige variablene inkludert alder og Gleason score. Justert β og SE ble beregnet. Den beste modellen ble bestemt vurderer justerte R
2. Alle testene var tosidige og statistisk signifikans ble definert som
P
verdi 0,05. Analysene ble utført ved hjelp av PASW Statistikk 17,0 for Windows.
Resultater
De viktigste kjennetegn ved deltakerne som prøver ble brukt i studien er beskrevet i Tabell 1. Median alder var 65 år med median PSA på 5,9 ng /ml, og de fleste hadde Gleason score ≥ 7. Vi farget alle pasienters prøver ved hjelp av en SEPT9_i1-spesifikt antistoff [15]. Vi først preget spesifisitet SEPT9_i1 antistoff. Flag-tagged SEPT9_i1 konstruksjonen ble forbigående uttrykt i HEK-293T-celler og underkastes immunblotting med antistoffer mot flagg, SEPT9_i1 og SEPT9_i1 i nærvær av immunogenet peptidet [15], så vel som med preimmunserum (figur 1A). Flagg og SEPT9_i1 antistoffer omsatt med en 70 kDa bånd tilsvarende flagg-SEPT9_i1 protein, mens den preimmunserum ikke viste noen reaktivitet (figur 1A). Videre immunoreaktiviteten av SEPT9_i1antibody ble nesten fullstendig opphevet når immunogenet peptidet ble det tilsatt (figur 1A). I tillegg ble de immunoutfelt arter av Flag antistoff også anerkjent av anti-SEPT9_i1antibodies (fig 1B). Disse resultatene er i samsvar ytterligere spesifisiteten av den produserte anti-SEPT9_i1antibodies.
I den ikke-neoplastisk prostata vi observerte fremtredende SEPT9_i1 cytoplasmisk farging i de fleste basalceller mens luminal-celler var negative (figur 1C). Stromale celler flekker i begge neoplastiske og ikke-neoplastiske regioner var variabel. Tumorceller viste variabel fargeintensitet, som hadde tendens til å være cytoplasmisk imidlertid i noen tilfeller var atom. Fargeintensitet av tumorceller var i noen tilfeller variabel. I disse tilfellene Poengsummen ble tildelt basert på den mest tallrike fargeintensitet. Hver prøve ble deretter mottok fra 0 til 3 for ekspresjon nivå av SEPT9_i1 (figur 1C). Vi deretter korrelert SEPT9_i1 fargeintensitet med kliniske karakteristika og fant sterk og signifikant korrelasjon mellom SEPT9_i1 uttrykk nivåer og Gleason score (
P
= 0,01, tabell 2). På multivariat lineær regresjonsanalyse for sammenhengen mellom pasientenes egenskaper og mener SEPT9_i1 fargeintensitet, Gleason score var den eneste uavhengige prediktiv faktor (RR 2,0, 95% KI 0,15 til 3,85,
P
= 0,035). Vi stratifisert SEPT9_i1 fargeintensitet, enten ved hjelp av visuell scoring (figur 2A) eller med datastyrt bildeanalyse med en automatisert bildeanalysesystem (ARIOL-SL50) (figur 2B) i henhold til Gleason score. Det var signifikant høyere nivå av SEPT9_i1 flekker som Gleason score var høyere (figur 2)
Mean SEPT9_i1 fargeintensitet ± SE av hver Gleason score gruppe (skår 5:. 3 pasienter, scorer 6: 8 pasienter, poengsum 7: 19 pasienter, scorer 8: 3 pasienter, scorer 9: 6 pasienter og score 10: 2 pasienter) ble beregnet ved hjelp av enten visuelle scoring (A) eller automatisert bildeanalyse med ARIOL-SL50 system (B)
Vi neste analysert metastatisk prostatakreft prøver fra forskjellige områder, inkludert bein (3 prøver), benmarg (3 prøver) og lymfeknuter (2 prøver). Alle metastatiske lesjoner var sterkt positiv for SEPT9_i1 farging (fig 3). Til sammen høy uttrykk for SEPT9_i1 i høyverdig prostatakreft og prostatakreft metastaser tilsier at SEPT9_i1 er en kandidat markør for tumorprogresjon.
prostatakreft lesjoner fra benmarg, lymfeknuter og bein ble immunostained med SEPT9_i1 . Venstre paneler er lav (x100) forstørrelse (LM) (skala bar 100 mikrometer) og panel høyre er høy (x200) forstørrelse (HM) (skala bar 50 mikrometer). Merk høyt nivå av SEPT9_i1 flekker i alle metastaser.
ble observert diskusjon
Høye nivåer av SEPT9_i1 uttrykk i flere maligniteter inkludert leukemi [20] og brystkreft [11]. I denne studien viste vi at SEPT9_i1 protein uttrykk er signifikant assosiert med Gleason score (figur 1 og 2 og tabell 2). Inntil disse dager, Gleason gradering og scoring system er fortsatt en av de mest kraftfulle prognostiske faktorer for prostatakreft [21]. Viktigst, ble en betydelig intens SEPT9_i1 farging sett i metastaser av prostata adenokarsinom til ulike områder (fig 3). Disse resultatene tyder på at SEPT9_i1 protein uttrykk sterkt korrelert med tumor aggressivitet og progresjon. Tilsvarende Stanbery et al. viste at høy SEPT9_i1 protein uttrykk i hode og nakke plateepitelkreft karsinomer var assosiert med dårlige kliniske utfall [22]. Videre fant de at høy uttrykk for SEPT9_i1 korrelert med både avansert T og N scenen [22]. Sammen er disse kliniske data understøtter tidligere studier som viser rollen til SEPT9_i1 i onkogenesen [15, 23-25].
Aktiv overvåkning er en av de aksepterte metoder som benyttes for å redusere behandlingen av pasienter med lav risiko prostatakreft . Slike pasienter overvåkes med digital rektal fysisk undersøkelse, periodiske blod PSA vurderinger og gjenta prostatabiopsier, og i noen nyere protokoller selektiv avbildning ved hjelp multiparametric endorectal MR [26]. Behandlingen deretter tilbudt til de som har tegn på progresjon. Dessverre, flere rapporter viser at en betydelig andel (ca. 30%) av menn med lav-risiko prostatakreft er feilklassifisert, og trenger å få umiddelbar definitive behandling [27]. Men foreløpig er det ingen nøyaktig modell for å forutsi hvilke av disse pasienter med lav-risiko sykdom bør behandles umiddelbart før de går under overvåking [28]. Siden SEPT9_i1 protein uttrykk er sterkt korrelert med tumorprogresjon og metastase, foreslår SEPT9_i1 som en roman markør som kan skille mellom lav-risiko versus høyere risiko prostatakreft for bedre pasientenes valg i aktive overvåkingsprogrammer. Selvfølgelig er videre studier garantert til å teste denne hypotesen.
En av begrensningene i vår studie er mangelen på langsiktig klinisk utfall for sammenligning med patologisk fargeintensitet av SEPT9_i1. En annen begrensning er relativt lite antall pasienter i vår kohort selv om det var tilstrekkelig for å oppnå statistisk signifikans.
Konklusjoner
Til sammen våre data viser tydelig at SEPT9_i1 uttrykk i prostata kreft er sterkt assosiert med den mektigste patologisk prediktiv faktor, Gleason score. Videre ble høye SEPT9_i1 ekspresjonsnivåer påvist i alle prostata adenokarsinom metastaser som tyder på at SEPT9_i1 har en rolle i tumor invasivitet og progresjon. Videre studier er nødvendig for å avgjøre om de SEPT9_i1 farging i klinisk setting.
Takk
Dette arbeidet ble støttet av Dr. Miriam og Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (AMRF).
