Abstract
Bakgrunn
Utbredelsen av skjoldbrusk knuter øker med alderen, gjennomsnittlig 4-7% for USA voksne befolkningen, men det er mye høyere (19-67%) når sub Clinical knuter blir vurdert. Rundt 90% av disse lesjonene er godartede og en pålitelig tilnærming til preoperativ karakterisering er nødvendig. Dessverre konvensjonell thyroid scintigrafi ikke tillater skille mellom godartede og ondartede skjoldbrusk proliferations men det gir bare funksjonell informasjon (
kalde eller varme knuter
).
uttrykk for anti-apoptotiske molekyl galectin- 3 er begrenset til kreftceller, og denne funksjonen har potensielle diagnostiske og terapeutiske implikasjoner. Vi viser her muligheten til å få skjoldbruskkjertelkreft bildebehandling
in vivo
ved å målrette galectin-3.
Metoder
galectin-3 baserte thyroid immuno-scintigrafi bruker som radiotracer en spesifikk
99mTc-radiomerket mAb. En posisjon-sensitive høy oppløsning mini-gammakamera ble brukt som bildeopptaksenhet. Menneske galectin-3 positive skjoldbrusk kreft xenografter (ARO) og galectin-3 knockout svulster ble brukt som mål i forskjellige eksperimenter
in vivo
. 38 mus med tumormasse på omtrent 1 g ble injisert i halevenen med 100 uCi
99mTc-merket mAb til galectin-3 (30 ug protein /i 100 ul saltoppløsning). Tumor bildene ble kjøpt til en time, 3 timer, 6 timer, 9 timer og 24 timer etter injeksjon ved hjelp av mini-gammakamera.
Funn
Resultatene fra ulike påfølgende forsøk viser en optimal visualisering av skjoldbruskkjertelkreft xenografter mellom 6 og 9 timer fra injeksjon av radiotracer. Galectin-3-negative tumorer ble ikke påvist i det hele tatt. 6 timer etter injeksjon galectin-3 uttrykker svulster ble riktig visualisert, mens hele kroppen aktivitet hadde egentlig ryddet.
Konklusjoner
Disse resultatene viser muligheten for å skille preoperativt benign fra ondartet thyroid knuter ved å bruke en bestemt galectin-tre radio-immunotargeting.
In vivo
avbildning av skjoldbruskkjertelkreft kan tillate et bedre utvalg av pasienter henvist til kirurgi. Muligheten til å bruke denne metoden for avbildning og behandling av andre galectin-3 uttrykker svulster er også diskutert
Citation. Bartolazzi A, D’Alessandria C, Parisella MG, Signore A, Del Prete F, Lavra L, et al. (2008) skjoldbrusk kreft Imaging
In Vivo
av Målrette antiapoptotisk Molecule Galectin-3. PLoS ONE 3 (11): e3768. doi: 10,1371 /journal.pone.0003768
Redaktør: Andrew Boswell, Genentech, USA
mottatt: 23 juni 2008; Godkjent: 02.11.2008; Publisert: 20.11.2008
Copyright: © 2008 Bartolazzi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet av AIRC (italiensk Association for Cancer Research). Ingen andre sponsorer spilt en rolle i dette papiret
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den høye forekomsten av godartede skjoldbrusk knuter i voksne befolkningen gjør preoperativ påvisning av skjoldbruskkjertelkreft sammenlignes med «lete etter en nål i en høystakk». Forekomsten av skjoldbrusk nodules øker med alderen, gjennomsnittlig 4-7% for U.S.A. voksne befolkningen [1], men det er mye høyere (19-67%) når subklinisk knuter regnes også [2]. Heldigvis ca 90% av disse lesjonene er godartet og derfor en pålitelig og systematisk tilnærming til preoperativ karakterisering er nødvendig [1], [3].
uttrykk for Sodium jodid Symporter (NIS) på membran av skjoldbruskkjertelen cellene gjør at skjoldbruskkjertelen for å konsentrere jodid fra serumet. NIS-mediert iodide opptak kreves for de påfølgende organification og oksidasjonstrinn, som er viktige hendelser for produksjon av thyreoideahormoner. Dette særegne egenskap av kjertelen støtter vanlig thyroid scintigrafi, som bruker radiojod i å definere skjoldbruskkjertelen i både fysiologiske og patologiske tilstander [4]. Men dette mye brukt teknikk ikke tillater skille mellom godartede og ondartede skjoldbrusk proliferations. Faktisk selv om kreft er uvanlig i skjoldbrusk nodules med effektiv jodid opptak (formulert
varme knuter
), det store flertallet av skjoldbrusk proliferations som ikke klarer å konsentrere seg jodid (
kalde knuter
) er biologisk godartet [ ,,,0],4].
Normalt skjoldbrusk celler uttrykker ikke galectin-3. En tvungen uttrykk for galectin-3
via
spesifikk cDNA transfeksjon genererer en transformert fenotype, blokkerer apoptotisk program, en funksjon som favoriserer utvikling av kreft [5] – [9]. Interessant, som tidligere rapportert i en stor multi retrospektiv studie på histologisk materiale, godt differensiert skjoldbruskkjertelen karsinom nesten alltid uttrykke galectin-3 ( 94% av alle skjoldbruskkjertelen krefttyper, med unntak av benmargskreft), mens godartede skjoldbrusk proliferations gjøre ikke (bare 2% av godartede knuter, hovedsakelig representert ved adenomer, var galectin-tre positive) [10]. Dette funn ble bekreftet ved rapportert i litteraturen [11] en rekke studier – [14] og galectin-3-immunfarging allerede er brukt i klinisk praksis, ved immuno-cytologisk nivå, for et bedre utvalg av pasienter henvist til thyroidectomy [10], [15] – [17]. I denne studien, ved hjelp av
in vivo Hotell og
ex vivo
eksperimentelle modeller av skjoldbruskkjertelkreft viser vi muligheten til å få en pålitelig tyreoideakreft bildebehandling
in vivo
ved å målrette den galectin-3 lektin molekyl. Dette diagnostiske tilnærmingen kan også brukes til å avbilde ulike galectin-3 uttrykker svulster
in vivo
.
Materialer og metoder
Cellelinjer og galectin-3 mRNA forstyrrelser
Thyroid karsinom cellelinjer ARO, vennlig levert av Dr. Silvia Soddu (National Cancer Institute Regina Elena Roma, Italia) ble tidligere beskrevet [18] – [19]. Selv om skjoldbrusk opprinnelsen til ARO celler er nylig blitt avhørt [20], vokser dette galectin-tre positive cellelinje svært effektivt
in vivo Hotell og gir en nyttig modell for å sette eksperimenter galectin-3 immunotargeting med og uten galectin -3 mRNA forstyrrelser. Celler ble dyrket i standardbetingelser ved 37 ° C og 5% CO
2 atmosfære i RPMI-1640 medium supplert med 2 mM glutamin, 10% FCS, penicillin og streptomycin (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD).
For galectin-3 mRNA forstyrrelser tre forskjellige sekvenser ble identifisert og testet som rapportert tidligere [21]. De to påfølgende sekvenser, som sterkt og likeledes ned regulerte galectin-3 ekspresjon i ARO celler ble sub-klonet inn i pSUPER vektor og anvendt om hverandre (konserverte motiver er understreket): 5′-GATCCCCCAACAGGAGAGTCATTGTTTTCAAGAGAAACAATGACTCTCCTGTTGTTTTTGGAAA-3 «(Gal3-551, forstand); 5»-AGCTTTTCCAAAAA CAACAGGAGAGT-CATTGTTTCTCTTGAAAACAATGACTCTCCTGTTGGGG-3 «(Gal3-551, antisens); GATCCCCACCTTACATGTGTAAAGGTTTCAAGAGAACCTTTACACATGTAA-GGTTTTTTGGAAA-3 «(Gal3-845, forstand); og 5»-AGCTTTTCCAAAAAACCTTAC-ATGTG TAAAGGTTCTCTTGAAACCTTTACACATGTAAGGTGGG-3 «(gal3-845, antisens).
I forsøket vist i figur 1 (panel B) ARO-celler ble stabilt transfektert med pSUPER-Gal3-551 (-aromatisk gal-3i) vektor og mock transfektert med pSUPER vektor som kontroll (ARO-CTR). Valg av stabilt transfekterte celler ble utført ved behandling med puromycin 2 mikrogram /ml (Sigma) 72 timer etter transfeksjon.
A) Bilde kjøpt med en høy oppløsning mini gammakamera i en mus som bærer ARO (Gal3 +) xenograft etter 6 timer fra iv injeksjon av 100 uCi
99mTc-merket mAb til Galectin-3. Pilen viser tumormassen åpenbart i venstre ben. En konsekvent akkumulering av radio tracer er observert i leveren i henhold til klaring av eksogene mAb (panel 1A); Morfologisk og immunhistokjemisk evaluering av de skåret tumor xenograft viser en dårlig differensiert skjoldbruskkjertelkreft med en variabel uttrykk for galectin-3, som avslørt av en galectin-tre spesifikke mAb og en direkte immunoperoksidasefarging metode (panel 2A); Tabellen viser den kinetiske av tumor /normal muskel-forhold på radio tracer ved forskjellige tidspunkter (panel 3A). B) Bilde kjøpt med en høy oppløsning mini gammakamera i en mus som bærer Galectin-tre forstyrret ARO xenograft (Gal3-) etter 6 timer fra intravenøst injeksjon av 100 uCi
99mTc-merket mAb til Galectin-3 (panel 1B); Immunhistokjemisk evaluering av utskåret tumor viser et konsistent nedregulering av galectin-3-ekspresjon (panel 2B); Effektiviteten av stabile galectin-3 RNA-interferens i nedregulere galectin-3 ekspresjon er vist i immunblotting. ARO celler mock-transfektert med pSUPER vektor ble brukt som kontroll (Ctr); galectin-tre forstyrret ARO celler ble stabilt transfektert med pSUPER-Gal3-551 vektor (Gal3i); α-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. Den densitometri analyse av molekylarter visualisert i gelen er også vist (panel 3B). Resultater er uttrykt som relative densitometri enheter (RDU), målt normaliserende Gal-3 signalet med det tilsvarende α-tubulin bånd intensitet.
Nedregulering av Galectin-3 ekspresjon ble kontrollert ved western blot analyse ulike tidspunkter (12-72 timer etter transfeksjon og kreftceller injeksjon i mus).
monoklonale antistoffer og immunhistokjemi
En renset pepperrot-konjugert (HRP-konjugert) rotte monoklonalt antistoff mot galectin -3 (SPACE srl, Milan, Italia) ble brukt i immunohisto-cytochemistry i henhold til produsentens instruksjoner som tidligere rapportert [13]. I korthet, antigen-gjenfinning mikrobølgebehandling av vev lysbilder i 0,01 mol /l citratbuffer pH 6,0 ble anvendt for tre sykluser på 3 minutter hver ved 750 W. Renset rotte mAb rettet til galectin-3 ble anvendt i et konsentrasjonsområde på 5-10 ug /ml. Den enzymatiske aktivitet ble visualisert med 3, 3′-diamino-benzidin (Dako, Glostrup, Danmark).
Western Blot analyse
Totalt celleekstrakter (TCE) ble oppnådd ved hjelp av en lysebuffer bestående av: Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 1%, PMSF 1 mM og en tablett av komplette protein inhibitor cocktail (Roche). En porsjon av TCE (30-70 ug) ble separert på 10% SDS-PAGE, og deretter blottet på nitrocellulosemembran (Bio-Rad). De følgende antistoffer ble anvendt i immunblotting: en renset rotte mAb til galectin-3 (Mabtech AB, Nacka Strand, Sverige), et mus mAb mot α-tubulin (TU-02, Santa Cruz Biotechnology) og HRP-konjugert anti-mus IgG og anti-rotte-IgG-spesifikke antisera (Sigma). Immunreaktiviteten ble påvist ved hjelp av chemo-luminescens analyse (ECL Kit, Amersham Corporation). Den molekylære arter løses i western blotting ble endelig analysert ved densitometri ved anvendelse av en vie programvare (NIH ImageJ, versjon 1.32j).
Resultatene er uttrykt som relativ Tetthetsmåling enhet (RDU) etter normalisering med densitometri verdier av båndet innhentet for α-tubulin.
Murine modeller av skjoldbruskkreft xenografter
Patogen-fri 4-5 uker gamle naken
(nu /nu)
mus (Charles River , USA) ble brukt for å etablere skjoldbrusk kreft xenografter
in vivo
. Musene ble holdt i bur av 4 dyr hver med vann og mat
ad libitum
. Galectin-3 uttrykker og svært tumorigent dårlig differensiert follikulært thyroideakarsinom cellelinje (ARO) og avledet galectin-tre knockout ARO celler (ARO-Gal3 negative) ble vurdert for disse eksperimentene.
Wild-type og forstyrret ARO cellene ble holdt i standard dyrkningsbetingelser som tidligere nevnte, løsrevet fra vevskulturplater med trypsin 0,05% EDTA 0,02% (Gibco), vasket i steril PBS og injisert subkutant i nakne mus i en konsentrasjon i området fra 7 x 10
6 til 10
7-celler /0.2 ml saltvannsoppløsning, avhengig av forsøket. Injeksjon av cellene ble utført ved anvendelse av en standard nål insulin.
Ingen narkose var nødvendig. Femti dyr ble brukt i tre forskjellige sett av eksperimenter for å etablere tumor xenografs. Mus ble undersøkt tre ganger i uken for tegn på målbar tumorvekst.
Mus ble valgt for
in vivo
bildebehandling eksperimenter når tumorvekt var rundt 0,5-1 g. For å bestemme
in vivo
ekspresjon av galectin-3 i tumorxenografter, noen av tumorer ble kirurgisk skåret ut og brukt til galectin-3 ekspresjon analyse som angitt ovenfor. Dette arbeidet ble utført i henhold til de spesifikke retningslinjer gitt av den italienske Ministry of Public Health for dyreforsøk. Denne studien er godkjent av Institutional Etisk Komité for dyreforsøk ved National Cancer Institute Regina Elena av Roma. Dyret anlegget på NCI av Roma er sertifisert av det italienske Ministry of Public Health.
Radio merking av monoklonalt antistoff mot Galectin-3
Affinity renset og svært konsentrert (5 mg /ml) monoklonalt antistoff mot humant Galectin-3 (Mabtech, Nacka, Sverige) ble radioaktivt merket ved hjelp av den fremgangsmåte som tidligere er rapportert [22]. Kort sagt ble antistoff disulfidbroer reduseres ved bruk av et molart overskudd av 2-merkaptoetanol (Sigma-Aldrich) i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av rensing med en Sephadex G-25 kolonne (Amersham Biosciences GmbH, UK) og nitrogen-spylt kald fosfatbuffer pH 7,4 som elueringsmiddel. Den reduserte antistoff ble lagret ved -80 ° C inntil bruk. Aktivert galectin-tre mAb (400 mikrogram /200 mikroliter volum) ble merket ved å tilsette 7 ul av en methylen-diposphonate (MDP) bein skanning kit (Medrotec®, Amersham Health, UK) som tidligere rapportert [22] og 10 mCi (370 MBq) på
99mTcO
4
– fersk elueres fra (
99Mo /
99mTc) generator (GE-Healthcare, UK). Merking effektivitet (LE) ble vurdert ved hjelp av Instant Tynnsjiktkromatografi (ITLC-SG, VWR, Italia) med 0,9% NaCl som mobil fase.
Strimlene ble analysert ved hjelp av en datastyrt mini-radioskanner (Bioscan System , Italia). LE, var . 95% med en endelig spesifikk aktivitet på 70 uCi /ug (Fig. S1 online)
For å optimalisere effektiviteten av antistoff-merking av flere eksperimenter ble utført for å variere det molare forhold mellom 2-merkaptoetanol /mAb (område: 1.000:1 til 4.000:1) og forholdet mAb /
99mTc for merking (range 250.000:1 til 4.500.000:1)
reduksjon av disulfidbroer på en. molforhold på 2145:1 (2-merkaptoetanol /mAb) og et molart forhold mellom 1,500,000:1 for mage /
99mTc ga den høyeste LE av
99mTc-anti-Galectin-3 og ble anvendt til alle videre eksperimenter (fig. S1 på nettet).
Spesifikke stabilitetsstudier ble utført inkubering av frisk radio-merket antistoff i saltvann eller i humant plasma ved 37 ° C i 24 timer og evaluering av det radioaktive farmasøytiske renhet ved ITLC-SG ved forskjellige tidspunkter (1 hr, 3 timer, 6 timer og 24 timer). Stabiliteten i saltvann og plasma var høy i løpet av de første 6 timene ( 90% og 80% for saltvann og plasma, respektivt) med en liten nedgang på 24 timer (Fig. S1 online)
. High Resolution gammakamera
The High Resolution gamma-kamera (HRC) (Li-tech Srl, Italia), vist i figur S2 online består av en krystall kollimator struktur koblet til en Hamamatsu H8500 (Hamamatsu, Japan) posisjon Sensitive Photo Multiplier Tube (PSPMT), lade avlesning elektronikk og en datainnsamling system
Den patenterte parallelle hull collimator, som allerede er beskrevet [24] -. [25] er laget av ren Tungsten med 200 mikrometer tykk septa. Den består av en 24 mm kollimator anordnet over en tilleggs 6 mm kollimator struktur, i hvilken krystallene er integrert inn i hullene. Den scintillation Strukturen består av 20 × 20 KTI (Tl) krystaller array (Spectra Physics-Hilger, UK) med et synsfelt (FOV) på 49,0 × 49,0 mm
2. Det krystall dimensjoner er 2,05 x 2,05 x 5,0 mm
3 og hver krystall er dekket by100 mikrometer hvit reflekterende epoxy på sine fem blinde overflater. Krystallen-kollimator struktur er koplet til PSPMT via optiske fett.
H8500 PSPMT har en ytre størrelse på 52,0 x 52,0 x 18,0 mm
3 med et aktivt areal på 49,0 x 49,0 mm
2. Den photocathode er bi-alkali og multiplikasjon system, som består av 12 metall kanal dynodes, gir en gevinst på 3 × 10
6 @ -1000 V.
multiplisert avgift kreves av en rekke 8 × 8 anoder.
read-out er en miniatyrisert (52,0 × 52,0 × 5,0 mm
3) front-end elektronikk, og signalene er samplet med en dedikert kompakt USB ADC bord. Oppkjøpet system gir 4 kanaler 20 M Samples /sek. Datainnsamling og bearbeiding er utført på en Linux Embedded System er utstyrt med ARM CPU PXA255 med 10 «touch-skjerm. Systemet kontroll- og dataprosesseringsprogramvaren er proprietære programmer som er utviklet i C ++ språk. Systemet gjør det mulig å utføre en real-time oppkjøpet med en refresh time på 0,5 sek. Systemet er tenkt å være en batteridrevet bærbar enhet; som en konsekvens detektorhodet vekter ca 2 kg, mens den totale vekten er ca 4,5 kg.
HRC energi oppløsning er ca 20% FWHM @ 140 keV (
99mTc) over hele FOV. Følsomheten er 210 sek /MBq og ensartethet er ± 5%, mens det gir 2,2 mm indre romlig oppløsning egnet for våre bildebehandling eksperimenter
in vivo
med tumor xenopodet mus, og
ex-vivo
med kirurgiske prøver som stammer fra menneskelige pasienter.
ex-vivo avbildning av menneskelig skjoldbruskkjertelkreft
Som et bevis på konseptet for bildebehandling differensiert skjoldbruskkjertelkreft i menneskelig, vi utførte
ex-vivo
bindingsstudier ved bruk som målrette en fersk metastatisk livmorhals lymfeknute fjernet fra en pasient som bærer en papillær thyroideakarsinom. Umiddelbart etter kirurgisk fjerning lymfeknuten ble kuttet i to på langs gjennom kreft lesjonen og de to vevssnittene ble inkubert ved 37 ° C i 3 timer i en 50 ml oppløsning inneholdende 2 uCi
99mTc-anti-Gal-3 ( 0,1 ug protein) i saltoppløsning med 1% HSA i nærvær eller fravær av 100 ug umerket anti-Gal-3-antistoff
Resultatene
for å evaluere bindingen spesifisiteten til en
99mTc-merket mAb til galectin-3
in vivo
, seks dyr peiling galectin-3 positive karsinom xenografter (ARO-Gal-3
+) ble vurdert i et innledende forsøk.
Mus med tumormasse på omtrent 1 g ble injisert i halevenen (iv) med 100 uCi
99mTc-merket mAb til galectin-3 (30 ug protein /i 100 ul saltoppløsning). Bilder ble kjøpt til en time, 3 timer, 6 timer, 9 timer og 24 timer etter injeksjon ved hjelp av mini-gammakamera. Galectin-3 immunotargeting av ARO svulster var svært effektiv i xenopodet mus. Et sentralt område av tumor nekrose (histologisk bekreftet) med nedsatt binding av radiotracer ble riktig avbildet i en av tilfellene (fig. S2 online). Preliminære eksperimenter med forskjellige galectin-3-positive tumorer, inkludert melanomer, lymfomer og brystkarsinomer ble også vurdert for dette formål med overlappende resultater (data ikke vist). Som ventet ble de fleste av galectin-3 radio merket antistoff konsentrert i leveren etter clearance av eksogene mAbs fra blodet [26] (fig. S2 online). For å optimalisere bildefangst og å demonstrere binding spesifisiteten av galectin-tre mAb større
in vivo
eksperiment (gjentatt i tre eksemplarer) ble vurdert.
Forsøket inkluderte 12 xenopodet mus , to grupper av seks dyr i hver. Den første gruppen ble transplantert med galectin-3 positive ARO-celler i en konsentrasjon på 5-8 x 10
6 celler /0,2 ml saltløsning /mus; den andre gruppe mus ble transplantert med galectin-tre knockout ARO celler (ARO-Gal3 negative), fremstilt ved hjelp av en bestemt galectin-3 RNA interferens (IRNA) [20].
ARO-Gal3 negative cellene injisert subkutant i en konsentrasjon på 10
7cells /0,2 ml saltoppløsning /mus, for å fremme en hurtig tumorvekst
in vivo
i ca 4 dager.
Dette var nødvendig for å opprettholde en effektiv nedregulering av galectin-tre uttrykk i stabilt forstyrret ARO celler, vokser
in vivo
i fravær av puromycine som selektive antibiotika. Galectin-3 nedregulering i stabil forstyrret ARO celler ble sjekket inn western blot på ulike tidspunkter (12-72 timer). Etter 4 dager fra celleinjeksjon alle musene utviklet en synlig subkutan tumor med en median-diameter størrelse på 0,5 cm. Dyrene ble deretter injisert i halevenen med 100 uCi
99mTc-merket mAb til hele kroppen bilder galectin-3 (30 ug protein) og ble ervervet ved 1 time, 3 timer, 6 timer, 9 timer og 24 timer ved hjelp av høyoppløselig gammakamera.
Bilder ble analysert tegning regionene av interesse (ROI) over den implanterte svulsten og over disk laterale muskel tatt som bakgrunn. Som forventet optimal visualisering av ARO-Gal-3
+ xenotransplantater ble oppnådd mellom 6 og 9 timer etter injeksjon av det radiomerkings, mens galectin-3 negative tumorer ble ikke påvist i det hele tatt (fig. 1 panelene A og B) . Tumorer ble endelig eksplantert for histologisk evaluering og immuno-fenotypisk analyse som vist i figur 1.
I et annet sett av eksperimenter ble 20 ARO xenopodet mus injisert med 100 uCi
99mTc-merket mAb til galectin -3 (30 mikrogram protein) og 5 grupper på 4 dyr hver ble avlivet på 3 timer, 6 timer, 9 timer, 12 timer og 24 timer etter injeksjon, henholdsvis.
Vevsprøver fra blod, lever, milt, nyre, tynntarm, tykktarm, muskel og ARO tumorxenografter ble fjernet, veiet og tellet med hensyn til nærvær av radioaktivitet. Alle dyrene ble avbildet før fellingen med reproduserbare resultater (data ikke vist).
in vivo
bio-fordeling av radio-merket galectin-3-mAb uttrykt som prosent av injisert dose pr gram vev (% ID /g), viste en rask blodklaring av den radio-farmasøytiske forbindelse i løpet av 3 timer fra injeksjon. Det meste av radioaktiviteten ble påvist i lever og nyrer som indikerer en rask avklaring av spor
via
lever og urinveiene (tabell 1).
Som forventet svulsten opptaket av den galectin-tre spesifikke
99mTc-merket mAb økt fra 3 til 9 timer etter injeksjonen. 6 timer etter injeksjon målet svulstene var godt synlig, mens hele kroppen aktiviteten hadde egentlig ryddet (tabell 1 og fig. S2 online).
Selv om oversettelsen av disse funnene i klinisk setting vil kreve bruk av humanisert mAbs knyttet til forskjellige radionuklider og mer omfattende prekliniske studier, forsøkte vi å simulere en galectin-3-basert avbildning av menneskelig skjoldbruskkjertelkreft
ex-vivo
. Til dette tar sikte på en ny cervical lymfeknute kirurgisk utskåret fra en pasient som bærer en papillær thyroideakarsinom metastase (histologisk bekreftet), ble benyttet som mål for å studere bindingen effektiviteten av Gal-3 spesifikk radiotracer.
Umiddelbart etter kirurgisk fjerning lymfeknuten ble halvert gjennom kreft lesjonen, og ble inkubert ved 37 ° C i 3 timer i 50 ml saltoppløsning inneholdende 2 uCi
99mTc-mAb til Galectin-3 (0,1 ug protein) og 1% humant serumalbumin, i nærvær eller fravær av 100 ug umerket (kald) anti-galectin-3-mAb (forskyvning analyse).
Etter grundig vasking i saltløsning en sammenlignende avbildning av de to vevspreparater ble utført. Resultatene av dette forsøket er vist i figur 2.
Figuren viser lymfeknute prøven halvert på langs og fotografert ved hjelp av mini gammakamera etter en time og 2 timer inkubasjon med 2 uCi
99mTc-merket mAb til galectin-3 (0,1 ug protein) i saltoppløsning, i nærvær (felt B) eller ikke (panel A) av et overskudd (100 ug) av umerket galectin-3 spesifikk mAb. Panel A viser svulst deteksjon av radiotracer etter 1 time og 2 timer inkubasjon. Panel B viser en konsekvent lavere opptak av radiotracer i nærvær av et overskudd av umerket anti-gal3- mAb, på grunn av den spesifikke fortrengningseffekten.
mini-gamma-kamera straks oppdages thyroid kreft metastase (panel A), mens en sparsom tumoropptak av radiotracer var synlig i kontroll, på grunn av forskyvningen virkningen av kulden mAb i overskudd (panel B).
diskusjon
Helt disse resultatene tyder på muligheten til å oppdage i skjoldbruskkjertelen og andre galectin-3 uttrykker svulster
in vivo
ved hjelp av en galectin-tre spesifikke radio-immunoscintigraphy. Bruken av galectin-3 radiotracer for påvisning av kreft i skjoldbruskkjertelen
in vivo
er støttet av et fast molekyl rasjonale [5], [7] – [10]. Videre har vi nylig demonstrert at galectin-3 immunotargeting representerer et nyttig diagnostisk verktøy for å identifisere preoperativt ondartet thyroid proliferations på immuno-cytologisk baser, selv om noen skjoldbrusk karsinom (ca 10-15% avhengig av studiene) ikke gir uttrykk galectin-3 [10] – [14], [17]. Den galectin-3 baserte radio-immunoscintigraphy foreslått her, gir biologisk informasjon om skjoldbrusk nodules og representerer en nyttig guide for å korrekt identifisere de skjoldbrusk proliferations som bør cytologisk vurdert og /eller raskt skåret ut.
Kombinere galectin-3 bildebehandling med thyroid FNA-cytologi, faktisk kan tillate å skille preoperativt benign fra maligne tyroid proliferations med høy virkningsgrad. Som en konsekvens mange unødvendige thyroidectomies kunne unngås, og den kliniske anvendelse av konvensjonelle thyroid scintigrafi med radio-jodid, som bare gir funksjonell informasjon om bestemte skjoldbrusk forhold, kan være begrenset til flere utvalgte kliniske spørsmål. Videre studier som bruker humaniserte galectin-3 spesifikke mAbs konjugert til forskjellige radionuklider vil være nødvendig for å bekrefte og validere disse funnene. Hvis den foreslåtte diagnostiske tilnærmingen vil vise seg vellykket en målrettet radio-ablasjon av galectin-3 uttrykker svulster kan også bli undersøkt ved hjelp galectin-3 spesifikke mAbs konjugert til forskjellige radioforbindelser (dvs.
186Re,
177Lu eller
90Y,
64Cu,
67Cu). En galectin-3 «stråling målrettet terapi «leverer stråledosen spesielt til galectin-tre positive svulst med begrenset eksponering av normalt vev. Gjennomtrengning av beta-stråler i levende vev er på flere millimeter og den terapeutiske effekt kan oppnås også i kreftceller som ikke tar opp direkte radio-farmasøytiske forbindelse (kryssild effekt). Denne tilnærmingen kan være nyttig for både deteksjon og behandling av mikro papillær skjoldbrusk karsinom (lesjoner mindre enn 1 cm, ofte formulert «
okkult PTC
«), som for tiden er umulig å oppdage preoperativt.
Videre muligheten til å behandle primære og metastatiske skjoldbrusk maligniteter som er galectin-3 positive, men ikke-jod ivrig og av denne grunn er de ikke responderer på konvensjonell radio-metabolsk terapi med
131Iodine, representerer en viktig prestasjon i onkologi som vil være nærmere undersøkt.
Foreløpige data fra
in vivo
avbildning av galectin-3 positive melanomer, lymfomer og brystcarsinomer har også fått åpne interessante muligheter for fremtiden å bruke radiomerkede mAbs til galectin- 3 for
in vivo
avbildning og behandling av ulike typer av humant maligniteter [27] – [31]
Hjelpemiddel informasjon
Figur S1..
Stabilitet og merking effektivitet galectin-3 radiotracer. Stabiliteten av radiomerkings ble evaluert ved inkubering av en prøve av den radioaktivt merket mAb i saltvann og serum i 24 timer ved 37 ° C. Prosentandelen av teknetium bundet til mAb ble vurdert ved Instant Thin Layer Chromatography- Silica Gel basert (ITLC-SG) strimler ved forskjellige tidspunkter. Grafen viser oppbevaring av technetium varierer mellom 100% og 85% i løpet av de første seks timer (rundt 360 minutter) med en liten nedgang fra 6 til 24 timer (øvre panel). Aktiviteten for radiomerket mAb anti galectin-3 har blitt vurdert i en titrering eksperiment. Den beste mAb /TC-forholdet er blitt beregnet ved å variere aktiviteten av 99mTc tilsatt til en stabil volum av redusert antistoff. Merkingen effektivitet (LE) ble evaluert ved ITLC-SG. Den optimale mAb /TC-forholdet funnet var 1.200.000 /1 som tilsvarer 30-40 mCi-aktivitet og en merking virkningsgrad på opptil 95%. En aktivitet som overstiger denne verdien økte ikke LE (nedre panel B)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0003768.s001 plakater (8,52 MB DOC)
Figur S2.
Tumor bildebehandling in vivo ved hjelp av 99mTc-merket mAb til Galectin-3 og en høy oppløsning bærbar mini gammakamera. A) med høy oppløsning portabel mini gammakamera anvendt i denne studien. B) Bilde tatt av høyoppløselig gammakamera i en mus som bærer galectin-tre positive thyroideakarsinom xenograft ARO, etter 6 timer fra intravenøst injeksjon av 100 uCi 99mTc-merket mAb til Galectin-3. Svulsten bekreftet ved histologi var 1,2 cm i diameter og viste en stor sentral nekrotisk område som tilsvarer den Lacuna som ikke klarte å fikse radiotracer (pil)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0003768.s002 plakater (10.39 MB DOC)
takk
Vi takker Marco Paolo Martegani for teknisk assistanse i manuskriptet forberedelse.
