Abstract
Prostatakreft er et stort helseproblem for menn i vestlige samfunn. Her rapporterer vi en prostatakreft-Specific Targeting Gene-Viro-terapi (CTGVT-PCA), der PTEN ble satt inn i en DD3 styrt onkolytiske viral vektor (OV) for å danne Ad.DD3.E1A.E1B (Δ55) – ( PTEN) eller, kort, Ad.DD3.D55-PTEN. Woodchuck post-transkripsjonell element (WPRE) ble også innført ved nedstrøms for E1A kodende sekvens, noe som resulterer i mye høyere ekspresjon av E1A genet. DD3 er en av de mest prostata kreftspesifikke gener og har vært brukt som et klinisk bio-diagnostisk markør. PTEN ofte inaktivert i primær prostatakreft, som er avgjørende for prostatakreft progresjon. Derfor har den Ad.DD3.D55-PTEN prostatakreft spesifikke og potente antitumoreffekt. Den tumorvekstraten var nesten fullstendig inhibert med det endelige tumorvolum etter Ad.DD3.D55-PTEN behandling som er mindre enn den opprinnelige volumet ved begynnelsen av Ad.DD3.D55-PTEN behandling, som viser den kraftige antitumoreffekt av Ad.DD3 .D55-PTEN på prostatakreft tumorvekst. Den CTGVT-PCA konstruere rapportert her drepte alle prostatakreft cellelinjene som ble testet, slik som DU145, 22RV1 og CL1, men hadde en redusert eller ingen drap effekt på alle de ikke-prostata kreft cellelinjer som ble testet. Virkningsmekanismen av Ad.DD3.D55-PTEN var på grunn av induksjon av apoptose, som detektert ved TUNEL-analyser og flowcytometri. Den apoptose ble formidlet av mitokondrier-avhengige og-Uavhengig trasé, som bestemmes av caspase analyser og mitokondriemembranen potensial
Citation. Ding M, Cao X, Xu Hn, Vifte Jk, Huang Hl, Yang dq, et al. (2012) Prostate Cancer-Specific og Potent antitumor effekt av en
DD3
-kontrollerte Onkolytiske Virus husing
PTEN
Gene. PLoS ONE 7 (4): e35153. doi: 10,1371 /journal.pone.0035153
Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA
mottatt: 13 september 2011; Godkjent: 09.03.2012; Publisert: 11 april 2012
Copyright: © 2012 Ding et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Basic Research Program of China (973 Pro_ram) (nr 2010CB529901) (X. Liu), Viktig National Science Teknologi konkret prosjekt for hepatitt og hepatoma Relaterte Program (2008ZX10002-023) (X. Liu), New Innovation Program (2009-ZX-09102-246) (X. Liu), Zhejiang Sci-Tech University stipend (1016834-Y) , National Basic Research Program of China (2009CB941704) (R. Li), Shanghai Municipal Committee of Science and Technology (09140903200, 09DJ1400400, 08140901700 og 06ZR14072) (R. Li). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er et stort helseproblem for menn i vestlige samfunn. Hvert år blir om lag 230.000 amerikanske menn diagnostisert med prostatakreft og nesten 30.000 dør av denne sykdommen [1], [2]. Den beste tilgjengelige behandling for pasienter med avansert sykdom er androgen ablasjon terapi, basert på observasjoner av Huggins og Hodges [3] at klinisk prostatakreft er under trofisk påvirkning av mannlige hormoner. Tumor regresjon og forbedring av kliniske symptomer er midlertidige og sykdommen uunngåelig utvikler seg til en androgen-uavhengig stat. Foreløpig er ingen kurativ terapi tilgjengelig for androgen-uavhengig prostatakreft.
Bio-terapi gir en attraktiv mulighet til å målrette androgen-uavhengig prostatakreft. I motsetning til tradisjonell kjemoterapi, kan den være utformet og tilpasset for å spesifikt målrette kreft i henhold til vår forståelse av sykdommen på et molekylært nivå. Den adenoviral vektor har vært brukt som en overføring kjøretøy for å innføre gener i kreftceller fordi det er mer effektivt enn ikke-virale gen-overføringsmetoder, [4], [5]. Den adenovirusvektor er stabil
in vivo
leverer effektivt gener til både dele og ikke-dele celler og sjelden fører til noen vesentlig sykdommen selv [6], [7]. Imidlertid, tradisjonelle adenovirus benyttes for genterapi er en replikasjonsmangelfull ett med lavt nivå ekspresjon av det terapeutiske gen. Cancer-spesifikk replikasjon av vektoren onkolytisk derfor er absolutt nødvendig for å forhindre disse problemene. To store strategier har blitt brukt til å konstruere en replikativ og cancer-spesifikk onkolytisk adenovirus. Den første er å slette den virale element som er nødvendig for virusreplikasjon i normale celler, som ikke er nødvendig i tumorceller. For eksempel, den E1B-55K-genet, som ble slettet i onkolytiske virus Onyx-015 og ZD55 [8], [9], [10], er nødvendig for virusreplikasjon i normale celler, men er unnværlig i kreftceller på grunn av kompensatorisk mekanismer. Den andre strategi er å erstatte promoteren av et nøkkel-genet i adenovirus replikasjon, slik som E1A eller E1B genet, med et tumor-spesifikke promoter [11], [12]. Dermed onkolytiske viruset er svært replikeres når arrangøren er aktivert.
For å overvinne begrensninger av tradisjonell genterapi med en replikering mangel adenovirusvektor, en kreft-Targeting Gene-Viro-terapi (CTGVT) ble konstruert av innsetting av et anti-tumor-genet inn i en dobbeltrettet onkolytisk viral (OV) vektor. Det er faktisk et OV-genet, og har mye bedre antitumor-effekt enn på enten genterapi alene eller virotherapy alene. Den onkolytisk viruset i seg selv har anti-tumor effekt og selektivt replikerer flere hundre ganger i tumorceller og derfor bør de terapeutiske gener også være selektivt replikert flere hundre ganger i tumorceller [11]. Ved å integrere innovatively genterapi og viro-terapi, anti-tumoreffekten til det CTGVT er vanligvis mye høyere enn noen av metodene alene. 27. januar 2011 Amgen brukt 1 milliard dollar for å kjøpe OncoHSV-GM-CSF (en onkolytiske virus fra Herpes simplex virus-1), som er i fase III for avansert melanom [13], [14], noe som understreker viktigheten og potensialet av CTGVT strategien.
i denne studien vi først generert en dobbel-regulert adenovirus, Ad.DD3.D55, hvori E1A-genet er under kontroll av
DD3
promoter og den E1B-55K-genet ble slettet.
DD3
er en av de mest prostata kreftspesifikke gener og har vært brukt som et klinisk biomarkør for prostatakreft [15]. Interessant, en 214 bp-fragment av DD3 kjerne-promoteren har en høy aktivitet promoter [16], og derfor ble den brukt til å styre E1A ekspresjon i onkolytisk adenovirus. Fordi DD3 uttrykket er sterkt begrenset i prostatakreft, vi tidligere brukte minimal DD3 arrangøren å kjøre uttrykk for E1A for å generere en onkolytiske virus [17]. Nivået av DD3 promoter-drevet E1A ekspresjon var utilstrekkelig, og derfor WPRE ble introdusert for å forbedre ekspresjonen av E1A genet i denne studien. WPRE fremmer genekspresjon i en promoter og celle-linje-avhengig måte [18]. WPRE har blitt utnyttet som en forsterker av transgene uttrykk ved å styrke kjernefysiske eksport av et abnormt beholdt messenger RNA fra kjernen til cytoplasma [19]. I tillegg
PTEN
er et velkjent tumorsuppressorgen som koder for et protein fosfatase [20]. Dens sletting er observert i høyverdig prostatakreft og er svært viktig for prostatakreft progresjon [21]. I denne studien
PTEN
med en CMV-promotor ble innsatt i Ad.DD3.D55 å danne Ad.DD3.D55-PTEN, som har en prostatakreft-replikasjon spesifisitet og antitumor-genet spesifisitet. Ad.DD3.D55-PTEN efficaciously induserer apoptose i prostatakreftceller, eliminerer prostatakreft xenografter med høyere antitumor effektivitet.
Resultater
Prostate Cancer-Specific transkripsjonen aktivitet av DD3 arrangøren og cytopatisk effekt av Ad.DD3.D55
den minimale DD3 promoter aktivitet i fravær av WPRE ble målt ved luciferase-reporter uttrykk, som viste minimal DD3 arrangøren vanligvis utstilt mye mer aktivitet i prostatakreft cellelinjer enn i andre cellelinjer. Den pGL3-kontroll, som inneholder SV40-promoter og enhancer, ble anvendt som en positiv kontroll (aktivitet = 1000). Som vist i figur 1A, uttrykk drevet av
DD3
arrangøren med WPRE var mye høyere i LNCaP og 22RV1 enn i andre celler, inkludert prostata kreft cellelinjer DU-145, PC3 og CL1. Selv om det var forskjeller i nivåene av ekspresjon i disse prostata cellelinjer, indikerer disse resultatene at WPRE kunne mediere forbedring av genekspresjon og å opprettholde den relativt begrensede aktiviteten til DD3-promoteren i prostata cellelinjer.
A. Luciferaseaktiviteten av DD3 promoter i nærvær av WPRE er uttrykt i forhold til pGL3-kontroll (aktivitet = 1000). Celler ble sådd ut i 24-brønners plater. Førtiåtte timer etter infeksjon med rapportør plasmider pGL3-kontroll eller pGL3-DD3-WPRE, ble cellene høstet og luciferase-aktiviteten ble målt. Aktiviteten til pGL3-DD3-WPRE forhold til pGL3-kontrollen er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD) av de tre transfeksjoner. B. Ekspresjon av E1A ved Ad.DD3.D55 (uten WPRE) og Ad.DD3.D55 i forskjellige cellelinjer ble evaluert. a-Tubulin ble evaluert som en lasting kontroll. C. Krystallfiolett analysen. Celler på 24-brønners plater ble infisert med forskjellige virus på den angitte MOIS. Cytotoksisitet ble observert av krystallfiolett farging på fem dager etter smitte.
Vi bygget en ny onkolytiske virus, Ad.DD3-E1A.E1B (Δ55), kort Ad.DD3.D55 (Fig. 2A ), som er en dobbel-regulert adenovirus hvor innfødte formidler av E1A har blitt erstattet av den minimale
DD3
promotoren og E1B-55K-genet har blitt slettet. Den cytopatiske effekten av Ad.DD3.D55 ble vurdert i normale og tumorceller ved krystallfiolett farging (fig. 1B). I prostata kreft cellelinjer 22RV1 og DU145, den cytotoksisitet av Ad.DD3.D55 var sammenlignbar med single-regulert adenovirus Ad.DD3 og Ad.D55. I motsetning til dette, i det ikke prostatakreft celle BEL-7404 og T24, den cytopatiske effekt av Ad.DD3.D55 og Ad.DD3 var mye lavere, noe som indikerer at prostatakreft-spesifisiteten av cytotoksisitet som utøves av Ad.DD3.D55 var mye mer forbedret.
A. Prinsippskisse av Ad.DD3.D55-PTEN. Den endogene pådriver for E1A ble erstattet av DD3 promoter, og E1B-55K-genet ble slettet.
PTEN
ekspresjonskassetten ble satt inn Ad.DD3.D55 å konstruere Ad.DD3.D55-PTEN. ITR, invertert terminal gjenta. B. Karakterisering av Ad-PTEN, Ad.DD3.D55 og Ad.DD3.D55-PTEN uttrykk ved Western blot analyse. Uttrykket av PTEN, E1A og E1B-55K av Ad-PTEN, Ad.DD3.D55 eller Ad.DD3.D55-PTEN i CL1 celler ble evaluert. Ad.WT ble anvendt som en positiv kontroll. a-Tubulin ble evaluert som en lasting kontroll. C. Relativ mRNA nivåer av
PTEN Hotell og E1A i 22RV1 celler infisert med Ad-PTEN, Ad.DD3.D55 og Ad.DD3.D55-PTEN. GAPDH ble evaluert som en intern referanse. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter. D. Western blot analyse av de totale og fosforylerte Akt proteinnivåer i CL1 celler infisert med Ad.DD3.D55 og Ad.DD3.D55-PTEN. E. Analyse av tumorsnitt som stammer fra tumorer behandlet med PBS eller en av forskjellige adenoviruser av hematoxylin og eosin-farging og hekson og PTEN immunfarging. Scale bar, 100 mikrometer.
Da vi målte uttrykk nivåer av E1A i de ulike celler infisert med Ad.DD3.D55 (med WPRE) eller Ad.DD3.D55 (uten WPRE) (Fig. 1C), respektivt. Uttrykk for E1A var sterkest i 22RV1 cellene blant alle cellelinjene som ble testet, og ikke endres vesentlig i nærvær av WPRE. Men innføring av WPRE faktisk hevet uttrykket nivåer av E1A i flere prostatakreft cellelinje inkludert CL1, LNCaP, PC3 og DU-145. Dessuten er det, dataene viste at innføringen av WPRE ikke påvirke begrenset uttrykk for E1A drevet av DD3 promoter i prostatakreftceller, noe som gir en sterk del av bevis som støtter at WPRE er en lovende kandidat for å konstruere en onkolytisk adenovirus å målrette prostatakreft celler.
Anleggs og karakterisering av Ad.DD3.D55-PTEN
PTEN
uttrykk kassett ble introdusert i DD3 kontrollerende dobbel regulert-adenovirus Ad.DD3.D55 å generere Ad.DD3.D55-PTEN (fig. 2. En). Uttrykket nivåer av PTEN og E1A i ulike CTGVT virus-infiserte celler ble bestemt ved Western blotting etter å infisere den humane prostatacancercellelinje CL1 (Fig. 2B). Replikering-mangel adenovirus Ad-PTEN med E1 region sletting og dobbel-regulert adenovirus Ad.DD3.D55 ble brukt som kontroller. Som forventet, de doble regulert virus Ad.DD3.D55 og Ad.DD3.D55-PTEN uttrykte E1A protein på omtrent samme nivå som gjorde Ad.WT og ikke klarte å uttrykke E1B-55K protein. Lignende resultater ble oppnådd når protein-ekspresjon ble målt ved mRNA-nivå ved sanntids-PCR (fig. 2C). For å karakterisere funksjonen av PTEN i Ad.DD3.D55-PTEN, ble effekten av dets ekspresjon på fosforyleringen status for Akt undersøkt ved Western blotting. Som vist på fig. 2D, infeksjon av onkolytiske viruset ført til en økning i fosfo-Akt ekspresjon som var påvisbar så tidlig som 24 timer etter infeksjon. I tillegg PTEN uttrykk hemmet fosforylering av Akt på sitt aktiverest (Ser473) uten å redusere de totale Akt protein nivåer i forhold til vektoren Ad.DD3.D55. Disse resultatene er i samsvar med PTEN lipid fosfatase aktivitet. For ytterligere å karakterisere virus
in vivo
, er nivåene av det virale protein hekson og det terapeutiske genet
PTEN
ble målt i tumorprøver 7 dager etter injeksjon av virusene. Som vist i figur 2E, ble det observert høye nivåer av hekson i Ad.DD3.D55 og Ad.DD3.D55-PTEN-grupper. Den ekspresjon av det terapeutiske gen
PTEN
ble også målt i disse tumorprøver. Prøvene infisert med Ad-PTEN og Ad.DD3.D55-PTEN vises høy PTEN uttrykk nivåer, men
PTEN
uttrykk ble ikke observert i Ad.DD3.D55-behandlede gruppen.
prostatakreft-Specific cytotoksisitet av Ad.DD3.D55-PTEN
in vitro
Den cytotoksisitet av Ad.DD3.D55-PTEN ble evaluert av MTT-analyse i tre prostatakreft cellelinjer CL1, LNCaP, DU145, 22RV1, PC3 og to ikke-prostata kreft cellelinjer T24 (human urinblæren carcinom cellelinje) og BEL-7404 (human leverkreft cellelinje). Resultatene viste at veksten av infiserte prostatakreftceller var mye hemmet med forskjellig grad, mens den høyeste effektivitet for hemming av Ad.DD3.D55-PTEN ble observert i LNCaP-celler og CL1-celler (fig. 3A). Disse data viste også at cytotoksisiteten til Ad.DD3.D55-PTEN er betydelig høyere enn for Ad.DD3.D55. Imidlertid ble begge virus vist seg å være ute av stand til å hemme veksten av ikke-cancerceller prostata signifikant (fig. 3A).
A. MTT-analyse. De seks cellelinjer som er angitt ovenfor ble sådd på 96-brønners plater og infisert med forskjellige virus ved en MOI på 10. Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyser på 0, 24, 48, 72, 96 og 120 timer etter infeksjonen. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av fem separate forsøk, og er uttrykt som prosent relativt til mock-behandlede kontrollceller. B. Krystallfiolett analysen. Celler på 24-brønners plater ble infisert med forskjellige virus på den angitte MOIS. Cytotoksisitet ble observert ved krystallfiolett farging på fem dager etter infeksjon.
Cytotoksisiteten av Ad.DD3.D55-PTEN ble også analysert ved farging med krystallfiolett som vist i figur 3B. Ad.DD3.D55-PTEN hadde en sterk cytotoksisk effekt på prostatakreftceller. LNCaP-celler og CL1 celler var mer følsomme for cytotoksisitet som utøves av Ad.DD3.D55-PTEN enn det som var DU-145 og 22RV1 celler. Det er imidlertid lite eller ingen cytotoksisitet ble observert i ikke-prostatacancercellelinjer, så som T-24, BEL-7404, og normale cellelinjer, HFL-I og BEAS-2B. Disse resultater indikerer at cytotoksisiteten til Ad.DD3.D55-PTEN var ikke bare mye sterkere enn for Ad.DD3.D55 på grunn av ekspresjon av
PTEN
, men ble også sterkt begrenset til prostata kreftceller.
Ad.DD3.D55-PTEN induserer apoptose i prostata kreft celler
in vitro
Vi beiset celler med Hoechst33258 å ytterligere analysere apoptose-induserende kapasitet på Ad.DD3 .D55-PTEN
in vitro
. Som vist i figur 4A, Ad.DD3.D55-PTEN indusert betydelig apoptose i CL1 og 22RV1 celler. Men replikering-inkompetent Ad-PTEN og dobbelt regulert Ad.DD3.D55 viste en marginal evne til å indusere apoptose. Flowcytometri ble utført som døde celler ble representert ved den fraksjon av cellene i sub-G1 fase. Infeksjon med Ad.DD3.D55-PTEN øket antall celler i sub-G1 fase i de testede prostata cellelinjer (CL1, DU145, 22RV1, PC3) ble og en høyere apoptotisk indeks finnes i 22RV1 celler (43,135%) enn i DU145, PC3 eller CL1 celler, i samsvar med den høyeste ekspresjon av E1A i 22RV1 cellelinje (fig. 4B).
A. CL1 og 22RV1 celler ble farget med Hoechst 33258 på 48 timer etter virusinfeksjon. Pilene angir de apoptotiske celler. Scale bar, 10 mikrometer. B. Strømningscytometrisk analyse av propidiumjodid-fargede celler ble utført ved 48 timer etter infeksjon. Prosentandelene av sub-G1-celler er vist. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter (** indikerer
P
0,01; * angir
P
0.05, N /S indikerer
P
. 0,05)
Ad.DD3.D55-PTEN induserer apoptose gjennom indre og ytre signalveier
mekanismen Ad.DD3.D55-PTEN-indusert apoptose ble studert. Som vist i figur 5B, pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK inhiberte celledød indusert av Ad.DD3.D55-PTEN i CL1 celler. Dette resultatet indikerer at celledød indusert av Ad.DD3.D55-PTEN er caspase-avhengig. I tillegg ble en serie av kaspase-avhengig apoptose signaleringskaskader analysert ved Western blotting (fig. 5A). Forbedret PARP spalting og aktivering av procaspase-3, procaspase-8 ble påvist i Ad.DD3.D55-PTEN-infiserte celler (Fig. 5A). Vi oppdaget også en tidsavhengig reduksjon i nivået av precaspase-9 i Ad.DD3.D55-PTEN-infiserte celler (fig. 5a), i samsvar med aktiveringen av mitokondriene-mediert apoptose signalveien. Integriteten av celle-mitochondria ble evaluert med den potensiometriske fluorescerende fargestoff JC-1 (Fig. 5B). Strømningscytometri viste at infeksjon med Ad.DD3.D55-PTEN resulterte i en signifikant reduksjon i mitokondriell transmembrane elektrisk potensial (fig. 5C). Samlet utgjør disse observasjonene tyder på at PTEN effektivt forbedret Ad.DD3.D55-indusert apoptose av indre og ytre trasé.
A. Western blot-analyse av apoptose-relaterte proteiner i CL1 celler infisert med Ad.DD3.D55 eller Ad.DD3.D55-PTEN. B. CL1-celler ble behandlet med de angitte midler og cellenes levedyktighet ble analysert ved MTT-assay etter 120 timer. For Z-VAD-FMK-inhiberingsanalysen ble cellene forbehandlet med Z-VAD-FMK (20 uM) 2 timer før virusinfeksjon. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter (** indikerer
P
0,01; * angir
P
0.05, N /S indikerer
P
0,05). C. Analyse av mitokondriemembranpotensialet av CL1-celler ved hjelp av FACS etter JC-1-farging. Prosentandelen av celler i Trapes regionen som vises.
Undertrykkelse av tumorvekst ved Ad.DD3.D55-PTEN induserer apoptose
in vivo
Resultatene presentert ovenfor viser at anti-tumoreffekten til det CTGVT midlet Ad.DD3.D55-PTEN er mye bedre enn både den onkolytisk virus Ad.DD3.D55 eller Ad.PTEN alene. Av prostata kreft cellelinjer som ble testet, drept Ad.DD3.D55-PTEN LNCaP og CL-1 celler med høyest effektivitet. Vi valgte cellelinje CL1, en androgen-uavhengig subklon av LNCaP, for å evaluere potensialet til onkolytisk Ad.DD3.D55-PTEN fordi LNCaP-celler har dårlig svulst-dannende evne
in vivo
. Som vist i figur 6A, tumorvekst etter injeksjon av var nesten completedly inhibert med det endelige tumorvolum etter Ad.DD3.D55-PTEN behandling som er mindre enn den opprinnelige volumet ved begynnelsen av Ad.DD3.D55-PTEN behandling. En annen måte å si, ikke bare gjorde Ad.DD3.D55-PTEN-infisert svulster ikke vokse, men volumene faktisk krympet med 41,3% målt 20 dager etter injeksjonen. Dette viser den kraftige effekten av Ad.DD3.D55-PTEN på tumorvekst. Men både Ad.DD3.D55 og Ad.PTEN inhiberte tumorvekst med en mye lavere effektivitet, sammenlignet med den Ad.DD3.D55-PTEN.
A. Antitumoreffekt av smitte av CL1 xenografttumorer med ulike adenovirus. Tumorvolumet ble målt og er presentert som gjennomsnitt ± SD. B. Ad.DD3.D55-PTEN hemmer veksten av CL1 xenografttumorer. Analyse av viruskinetikk Ad-PTEN eller Ad.DD3.D55-PTEN-behandlet 22RV1 svulster ved real-time PCR. Adenovirus E3 region ble amplifisert for å evaluere den virale DNA-innhold. p-aktin-DNA ble anvendt som en intern kontroll. (NS hjelp
P
0,05, ingen statistisk signifikans). C. Analyse av tumorsnitt som stammer fra tumorer behandlet med PBS eller en av forskjellige adenoviruser ved TUNEL-farging. Scale bar, 100 mikrometer.
viral kinetikk studien
in vivo
ytterligere illustrere overlegenhet Ad.DD3.D55-PTEN med viral DNA mengde opp til 100 ganger større enn at av Ad-PTEN innen 72 timer og varer i 2 uker (fig. 6B). TUNEL analyse viste at injeksjon av Ad.DD3.D55-PTEN forårsaket betydelig mengde av apoptose i svulstene, mens ingen apoptose ble observert i PBS-behandlede tumorer, og lite i Ad-PTEN-behandlede tumorer (Fig. 6C).
Diskusjoner
i denne studien viste Ad.DD3.D55-PTEN en utmerket antitumor effekt
in vitro Hotell og
in vivo
. To viktige faktorer bidrar til cytotoksisitet utøves av Ad.DD3.D55-PTEN. Den første er at det replikerer selektivt i prostatakreftceller. Vi har tidligere rapportert at minimal DD3 promoter-kontrollerte onkolytiske virus replikeres selektivt i prostatakreftceller [17], selv om arrangøren aktiviteten var ikke veldig tilfredsstillende. PSA er et velkjent biomarkør av prostatakreft og dets promoter er blitt mye brukt for å studere biotherapies for prostatakreft, inkludert genterapi med forskjellige vektorer [22], [23], [24], [25]. Forskjellige rekombinante promotorer er blitt generert basert på den prostatakreft-spesifikk aktivitet av en promoter eller enhancer for å øke den prostatakreft-spesifikk aktivitet av promoteren som styrer replikasjonen av onkolytiske virus [26], [27], [28], [ ,,,0],29]. Celledrepende effekt kan forbedres ved mange metoder, som for eksempel å kombinere onkolytisk adenovirus med radioterapi eller kjemoterapi. Kliniske studier har vist at kombinasjonen av ONYX-15 virus og kjemoterapi utløser en sterkere anti-tumorrespons mot hode og nakke kreft enn ONYX-15 eller kjemoterapi alene [30]. Pasienter med prostatakreft har blitt behandlet oftest med androgen ablasjon. Fordi aktiviteten av PSA-promoter /enhancer er svært avhengig av endogen androgen [31],
in vivo
cytotoksisitet av en PSA-promoter /enhancer-baserte onkolytisk virus kan bli redusert betraktelig hvis den ble brukt i pasienter som har blitt behandlet med androgen ablasjon. I denne studien, introduserte vi WPRE i DD3-kontrollerte E1A uttrykk kassett. Interessant, tilstedeværelse av WPRE hevet nivået av reporter uttrykk betraktelig, men ikke påvirke begrenset uttrykk i prostatakreftceller. Så vidt vi vet, er dette det første rapporterte bruken av WPRE i generering av en onkolytiske virus. I tillegg viser våre data viser at Ad.DD3.D55-PTEN, hvori E1A ekspresjon er under kontroll av promotoren og DD3 WPRE, utøves en sterk hemmende virkning på veksten av androgen-avhengig samt androgen-uavhengig cellelinjer , inkludert CL1, DU145 og 22RV1 i cellekultur og CL1 tumorvekst i en xenograft naken mus. Ad.DD3.D55-PTEN har en kraftig cytotoksisk effekt i androgen-uavhengig cellelinjer. Derfor kan E1A ekspresjon under kontroll av promotoren og DD3 WPRE være klinisk signifikant for onkolytisk viral behandling av pasienter med prostatakreft.
Våre resultater viste at ekspresjon av PTEN Dato den andre nøkkelrolle i cytotoksisiteten Ad.DD3.D55-PTEN. PTEN fungerer som et fosfatidylinositol fosfatase med en mulig rolle i fosfatidylinositol-3′-kinase (PI3’K) -mediert signaltransduksjon, undertrykke PI3K /AKT-reaksjonsveien ved å redusere nivået av PI3’K i cellen [32], [33] . Den onkolytisk virus Ad.DD3.D55 og Ad.DD3.D55-PTEN førte til en økning i fosfo-Akt ekspresjon ved 24 timer etter infeksjon (fig 2.D.); aktivering av PI3K-Akt signalering er den veien som anvendes ved virus for virusreplikasjon endocytose og [34], [35], [36], [37]. Ad.DD3.D55-PTEN hemmet fosforylering av Akt ved sin aktiverende rest (Ser473) som et resultat av PTEN uttrykk, mens aktivering av Akt ble opprettholdt med infeksjon av Ad.DD3.D55 (fig. 2.D). Forskjellen er tydelig angitt den mektige rollen PTEN. I tillegg har PTEN blitt identifisert som den inaktiverende endring i mange humane krefttyper, slik som gliom, bryst, lunge, prostata, blære, nyre og melanom tumorer, astrocytom, og leukemi [38]. I prostatakreft, er tapet av PTEN protein korrelert med svulster av høy klasse og scene, noe som tyder på at endringer i
PTEN
genet kan være assosiert med prostatakreft progresjon [21], [39]. Wu et al. etablert en musemodell med prostata-spesifikt sletting av PTEN [40]. Denne musemodell rekapitulerer prostatakreft progresjon hos mennesker: initiering av prostatakreft med prostata intraepitelial neoplasi, etterfulgt av progresjon til invasiv adenokarsinom og påfølgende metastasering. Derfor er PTEN en optimal kandidat for kreft genterapi på grunn av sine unike egenskaper. Innføring av PTEN av adenovirus eller retrovirus har blitt studert for bio-terapi av ulike typer kreft, inkludert eggstokkreft, livmor, blære, mage, tykktarms, og esophageal kreft og glioblastom [41], [42], [43], [44 ], [45], [46], [47]. For eksempel Gallick et al. rapporterte at adenovirus-mediert uttrykk for PTEN hemmet spredning og metastasering av menneskelige prostata kreft celler
in vitro Hotell og i
vivo product: [48]. Adenovirus-mediert PTEN transgen ekspresjon i kombinasjon med radioterapi, kjemoterapi og andre kreft-gener har blitt brukt for å behandle prostata kreftceller for å øke antitumoreffekt [49], [50], [51], [52]. I denne studien ble høye nivåer av PTEN ekspresjon drevet av CMV-promoteren mediert av et onkolytisk virus som replikeres selektivt i prostatakreftceller ved hjelp av DD3 promoter for å drive E1A uttrykk. Den antitumor effekt av PTEN i onkolytisk viruset ble mye forbedret sammenlignet med adenovirus-mediert PTEN som tidligere er rapportert for anvendelse i prostatakreft [48], [52], det kan være et resultat av at Ad.DD3.D55-PTEN indusert en massiv apoptose i prostatakreftceller av indre og ytre trasé.
Vi har observert varierende følsomhet for de ulike prostatakreft cellelinjer til cytotoksisitet av Ad.DD3.D55-PTEN. Nivået av rapportør ekspresjon drevet av DD3-promoteren og WPRE i LNCaP-celler ble bare 21,79% av det i 22RV1 celler (fig. 1), noe som tyder på en lavere replikasjon av Ad.DD3.D55-PTEN i LNCaP-celler, noe som ville virke inkonsekvent med den høyere avlivingseffektiviteten av Ad.DD3.D55-PTEN i LNCaP-celler enn i 22RV1 celler (Fig. 3). Imidlertid 22RV1 cellene uttrykker en funksjonell PTEN, mens LNCaP-celler ikke [53]. Gitt de ovennevnte data, Ad.DD3.D55-PTEN utøver antagelig en sterkere cytotoksisk effekt i PTEN-negative PCA-celler enn i PTEN-positiv PCA-celler.
Volumene av tumor av CL1 celler ble redued med 41,3% 20 dager etter infisert med Ad.DD3.D55-PTEN i naken mus (fig. 6A) tyder på at Ad.DD3.D55-PTEN har terapeutisk potensiale for behandling av androgen-uavhengig kreft. Denne studien viste at adenovirus replikering redusert etter ca. 12 dager med aktiv replikering (Fig. 6B). Interessant, selv frekvensen av onkolytiske virus holdt svært lav
in vivo
etter perioden (Fig. 6B), den infiserte svulsten fortsatt ikke signifikant vokse (Fig. 6A). Mekanismen for dette fenomenet er fortsatt ukjent. Én mulig forklaring er at et stort flertall av kreftceller ble drept på de første dagene etter injeksjon av Ad.DD3.D55-PTEN, mens veksten av de gjenværende cancerceller blir effektivt hemmet selv i nærvær av en minimal mengde av onkolytiske virus. Fenomenet er trolig oppmuntrende siden de fleste av viruset vil bli ryddet opp
in vivo
når onkolytiske virus brukes klinisk.
I konklusjonen, vi utviklet en ny prostata-spesifikt CTGVT (CTGVT-PCA ), Ad.DD3.D55-PTEN, ved regulering av ekspresjon av genet E1A med en minimal promoter og DD3 WPRE. Ad.DD3.D55-PTEN hadde utmerket anti-tumor effekt i begge androgen-avhengige og-uavhengig prostata kreft cellelinjer. Denne rapporten gir også en ny strategi for å konstruere en CTGVT-PCA med tumortyper spesifisitet som har få kreftspesifikke arrangører tilgjengelig.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen og dyreforsøk
Mann BALB /c naken mus (4 uker gamle) ble opprettholdt og brukt i en lys og temperaturkontrollert rom i en AAALAC akkreditert studio og gitt vann og lab chow
ad libitum product: [17] . Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Shanghai Institute of Biochemistry og cellebiologi henhold protokollen IBCB-SPF0029. Å etablere xenografttumorer, 5 × 10
6 22RV1 eller CL1 celler i 150 ul DMEM ble subkutant injisert i høyre flanke av hver mus. Når tumorer nådde 70-150 mm
3 i størrelse, mus ble randomisert til en av fire grupper (seks mus per gruppe). Adenovirus (2 x 10
9 PFUs per mus) eller PBS ble injisert inn i tumorene hver annen dag, med totalt tre injeksjoner. Tumorvolumet (mm
3) ble målt med en verniercaliper hver fjerde dag, og beregnet som (lengde x bredde
2) /2. Å studere viruskinetikk
in vivo
, svulster injisert med Ad-PTEN eller Ad.DD3.D55-PTEN var samlet på 3, 6, 9, 12 og 15 dager etter siste injeksjon og raskt frosset i flytende nitrogen . Den totale svulst DNA ble ekstrahert ved hjelp av genomisk DNA MiniPreps Kit (Generay Biotech, Shanghai, Kina). Viralt DNA ble målt ved hjelp av sanntids-PCR ved anvendelse av primere som annealing til adenovirus E3 området. Seksjonene ble kontra med hematoksylin.
