Abstract
Bakgrunn
Hensikten med denne studien var å undersøke samspilleffekter av pri-la-7a-1 rs10739971 med
pepsinogen C product: (
PGC
) og
excision reparasjon kryss utfyller gruppe 6 product: (
ERCC6
) genet polymorfismer og sin tilknytning til risikoen for magekreft og atrofisk gastritt. Vi håpet å identifisere miRNA polymorfisme eller en kombinasjon av flere polymorfismer som kan tjene som biomarkører for å forutsi risikoen for magekreft og dens forstadier til sykdommer.
Metoder
Sequenom MassARRAY plattform metoden ble brukt til å oppdage polymorfismer av pri-la-7a-en rs10739971 G → A,
PGC
rs4711690 C → G,
PGC
rs6458238 G → A,
PGC
rs9471643 G → C, og
ERCC6
rs1917799 i 471 mage kreftpasienter, 645 atrofisk gastritt pasienter og 717 kontroller.
Resultater
En interaksjonseffekten av pri-la-7a-en rs10739971 polymorfisme med
ERCC6
rs1917799 polymorfisme ble observert for risikoen for magekreft (
P
interaksjon = 0,026); og samspilleffekter av pri-la-7a-en rs10739971 polymorfisme med
PGC
rs6458238 polymorfisme (
P
interaksjon = 0,012) og
PGC
rs9471643 polymorfisme (
P
interaksjon = 0,039) ble observert for risikoen for atrofisk gastritt.
Konklusjon
kombinasjonen av pri-la-7a-en rs10739971 polymorfisme og
ERCC6
og
PGC
polymorfismer kan gi en større forutsigelse potensial enn en enkelt polymorfisme på egen hånd. Store studier og molekylære mekanismen forskning er nødvendig for å bekrefte våre funn
Citation. Xu Q, Liu J-w, han C-y, Sun L-p, Gong Y-h, Jing J-j, et al. (2014) Samspillet Effekter av pri-la-7A-1 rs10739971 med
PGC Hotell og
ERCC6
Gene Polymorfisme i magekreft og atrofisk gastritt. PLoS ONE 9 (2): e89203. doi: 10,1371 /journal.pone.0089203
Redaktør: Xiaoping Miao, MOE Key Laboratory for miljø og helse, School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Kina
mottatt: 20 november 2013; Godkjent: 16 januar 2014; Publisert: 25 februar 2014
Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Key Basic Research Program of China (973 Program Ref. 2010CB529304), Natural Science Foundation National of China (Ref nr 31200968), og Science Technology Project i Liaoning-provinsen (Ref nr 2011225002) . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
personer med tilsvarende levevaner og bor i lignende miljøer har ulik risiko for kreft. Identifisering og forutsi individer som har høy risiko for å utvikle kreft kan indikere behovet for å endre levevaner. Enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) spiller en sentral rolle i å forutsi personer med økt kreftrisiko. I de senere årene, ble polymorfismer av pri-miRNA rapportert å være biomarkører for å forutsi risikoen for kreft, for eksempel pri-MIR-34b /c rs4938723 polymorphism [1], pri-MIR-218 rs11134527 polymorphism [2] og pri-MIR-938 rs2505901 polymorphism [3]. Studier har funnet at antall enkelt gen polymorfismer var assosiert med risiko for magekreft [4]. Imidlertid er magekreft en sammensatt flertrinns sykdom med mange gener som er involvert, og enkelt SNP’er ha begrenset evne til å forutsi magekreft [5] – [7]. Flere studier har rapportert at gen-gen-interaksjoner er viktigere enn den viktigste effekten av et enkelt gen i komplekse sykdommer, så som kreft [7] – [9]. Den grunnleggende forskning tilnærming for gen-gen-interaksjoner er å undersøke kombinasjonen av to eller flere polymorfismer med mindre eller ingen effekter fra tidligere enkelt SNP studier [10], [11]. Imidlertid har de fleste tidligere studier fokusert på prediktiv rollen som en enkelt gen SNP og oversett potensialet anvendelse av gene-genet interaksjoner.
Foreløpig etterforskere i hovedsak fokusere på genet SNP-SNP interaksjoner, noe som kan føre til protein- protein interaksjoner, og få studier har undersøkt samspillet mellom miRNA polymorfismer og gen polymorfismer, noe som kan føre til protein-RNA interaksjoner. miRNA har blitt rapportert til å ta del i den multi-genet nettverk av mave karsinogenese [12]. Den samme miRNA ble rapportert å regulere flere mål-proteinene, og de samme proteinene kan bli modulert ved hjelp av flere miRNA [13]. Som et resultat av effektene av miRNA og gener dannet et nettverk.
Vår forrige kandidat genet forening studien undersøkte sammenslutning av
pepsinogen C product: (
PGC
) og
excision reparasjon kryss utfyller gruppe 6 product: (
ERCC6
) med risiko for magekreft, og funnet ut at
PGC
genet rs4711690 C → G, rs6458238 G → A, og rs9471643 G → C polymorfismer hadde beskyttende effekt mot atrofisk gastritt [4]. PGC hadde beskyttende effekt på normale magesekken og viste lav ekspresjon i magekreft, og tapet av beskyttelse var forbundet med forekomst av magekreft [14]. ERCC6 er medlem av DNA-reparasjon familie som deltar i å reparere DNA-skader i kreftutvikling [15].
ERCC6
rs1917799 T G polymorfisme i promoter regionen var assosiert med økt magekreft risiko i en kinesisk befolkning [16]. La-7a er et tumor suppressor, og nylige studier funnet at funksjonen av modne la-7a er nært knyttet til forekomst og utvikling av magekreft, og redusert ekspresjon av la-7a er forbundet med ondartet biologisk oppførsel [17], [ ,,,0],18]. Men la-7a genetiske varianter ble ikke undersøkt for sine foreninger og mage kreft risiko. Rs10739971 er en SNP som ligger -559 bp oppstrøms for la-7a-1, som kan være en promoter region av la-7a-1. I Hapmap database, minimum allel frekvensen av rs10739971 er ≥5% i begge europeere og asiater. Men om det er en sammenheng mellom rs10739971 og sykdomsrisiko, og interaksjoner mellom rs10739971 og andre polymorfismer, er fortsatt ukjent. Vi antok at de ovennevnte varianter kan være optimale kandidater til å undersøke potensielle SNP-SNP interaksjoner ved to eller flere loci som bidrar til magekreft etiologi.
I denne case-control studie ved hjelp av en kinesisk befolkning, vi undersøkt sammenslutning av pri-la-7a-1 rs10739971 med magekreft risiko, og samspilleffekter av miRNA-la-7a-en rs10739971 polymorfisme og
PGC Hotell og
ERCC6
polymorfismer i prøver av samme gruppe, og diskutere dets anvendelse prospekter i magekreft og dens forstadier til sykdommer. Så vidt vi vet, er dette den første studien forsøker å vurdere potensielle SNP-SNP interaksjoner av miRNA SNPs og gen SNPs på to eller flere loci innblandet i magekreft mottakelighet. Vi håpet å finne kombinasjoner av gen-gen polymorfismer som kunne forutsi risikoen for magekreft og dens forstadier til sykdommer, og for å gi eksperimentelle bevis for tidlig diagnose av magekreft.
Metoder
Pasienter
i denne studien, totalt 1834 personer, som inkluderte 471 mage kreftpasienter, 646 atrofisk gastritt pasienter og 717 kontroller, ble retrospektivt rekruttert fra pasienter som gjennomgår gastroskopi undersøkelse screening i Zhuanghe regionen og pasienter som gjennomgikk gastroskopi undersøkelse eller gastrisk kirurgi på First Affiliated Hospital of China Medical University, Liaoning-provinsen, Kina mellom 2002 og 2011. Fasting venøs blod ble samlet og alle registrerte deltakere ble diagnostisert basert på deres gastroscopic og histopatologiske undersøkelser. Magekreft ble diagnostisert basert på WHOs kriterier, og atrofisk gastritt og overfladiske gastritt ble klassifisert av Sydneys klassifisering. Kvalifiserte kontroller var de deltakere med en normal mage eller bare gastritt ifølge gastroscopic og patologiske undersøkelser og hadde ingen andre sykdommer.
Utformingen av studien ble godkjent av Human Etisk komité i Kina Medical University (Shenyang, Kina ). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne. Medisinsk historie (inkludert alder, kjønn, røyking og alkoholforbruk) ble innhentet av spørreskjema og postene ble datastyrt. Hver enkelt involvert i studien forutsatt skriftlig informert samtykke for epidemiologisk undersøkelse. Detaljerte deltager egenskaper er oppsummert i tabell 1.
Genomisk DNA ble ekstrahert
Genomisk DNA ble ekstrahert ved anvendelse av en tidligere beskrevet metode med ubetydelig modifikasjon [19]. I korte trekk, ble et frosset blodpropp (500 ul) tilsettes til 800 pl TE-buffer (triethanolamide), blandet godt og sentrifugert ved 10.000 x
g
i 5 minutter for å dispergere koagulere. Etter clot avbrudd, 400 ul TE, 25 ul 10% SDS og 5 ul av 20 mg /ml proteinase K ble tilsatt og inkubert ved 37 ° C over natten. Supernatanten ble ekstrahert, og et likt volum fenol ble tilsatt. Røret ble plassert på en rotator i 15 minutter og deretter sentrifugert ved 10.000 x
g
i 15 min. Supernatanten ble fjernet og en andre ekstraksjon ble utført med tilsetning av et likt volum av en blanding av fenol og kloroform (1:01). Etter sentrifugering ble supernatanten fjernet og en tredje ekstraksjon ble gjennomført med tilsetning av et likt volum kloroform. Etter sentrifugering ble supernatanten absorbert og to volumer av proteinutfelling oppløsning (to volumer absolutt etanol inneholdende 10% 3 mol /l natriumacetat) ble tilsatt og inkubert i 2 timer ved -20 ° C. Hver prøve ble sentrifugert ved 10000 x
g
i 10 min. Etter sentrifugering ble det resulterende DNA pelleten ble skylt med 75% etanol og sentrifugert ved 10.000 x
g
i 10 min. Den 75% etanol ble dekantert, og røret snus på ren absorberende papir i 30 minutter. Det resulterende DNA ble rekonstituert i TE-buffer og lagret ved -20 ° C inntil bruk.
SNP genotyping
DNA-prøver ble fortynnet til arbeids konsentrasjoner på 50 ng /ul før genotyping. Analysene, grunning design, og genotyping av 29 polymorfi områder som er valgt for en kandidat genet assosiert studien ble alle utført av CapitalBio (Beijing, Kina) med Sequenom MassARRAY plattform (Sequenom, San Diego, CA, USA) mellom mai 2011 og desember 2011 basert på produsentens anvisninger [4], [20]. Fem av 29 polymorfismer ble videre valgt for samhandling analyse i denne studien. For å vurdere kvaliteten på genotyping, ble 5% gjentatte prøver genotypet, og resultatene var 100% konsekvent.
Påvisning av H. pylori i serum
serologiske tester for
H. pylori
ble utført for å sjekke status på
H. pylori
infeksjon ved bruk av ELISA (
H. pylori
-IgG ELISA kit, Biohit Plc, Helsinki, Finland), som beskrevet tidligere [21]. Positive ble bedømt som en titer på
H. pylori
-IgG høyere enn 34EIU (cut-off-verdi som er gitt av protokollen). Kort sagt ble serumprøver fortynnet 1:200 (5 pl + 995 pl) med fortynningsmiddel-buffer og blandet godt. Deretter 100 mL av blank løsning, kalibratorer, kontroller og fortynnede prøver ble tilsatt brønnene. Platen ble dekket med dekk og inkubert i 30 minutter ved 37 ° C. Etter inkubering ble brønnene vasket fem ganger med 350 ul av fortynnet (1:100) vaskebuffer og platen forsiktig banket flere ganger på filterpapir. Deretter ble 100 ul av blandede konjugatløsning ble tilsatt til brønnene og inkubert i 30 minutter ved 37 ° C. Etter inkubering ble brønnene vasket igjen, og 100 ul av blandede substratløsning ble tilsatt til brønnene før inkubering i 30 minutter ved romtemperatur (20-25 ° C) i et mørkt miljø. Til slutt ble 100 ul av blandede stoppløsning tilsatt, og absorbansen ble avlest ved 450 nm i løpet av 30 min.
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført ved anvendelse av SPSS 16,0 programvare (SPSS, Chicago , IL, USA). Pearsons χ
2 tester ble brukt for å evaluere forskjeller mellom kjønnene i saken og kontrollgrupper. ANOVA ble utført for å vurdere eventuelle forskjeller mellom aldersgrupper i de ulike gruppene. Likelihood ratio tester ble utført for å vurdere interaksjons effekter på risikoen for magekreft ved å sammenligne den modellen som kun involverte hovedeffektene og full modell som også inneholdt samspillet sikt. En
P
-verdi. 0,05 for alle tosidige tester ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Hoved effekt analyser av enkelt polymorfismer
i vår forrige undersøkelse fant vi at pri-la-7a-en rs10739971 polymorfisme var signifikant assosiert med økt risiko for atrofisk gastritt (OR = 2,59,
P
= 0,018) i det minste studiepopulasjonen, men ingen signifikant sammenheng ble funnet i ytterligere bekreftelse studiet av en større populasjon (upubliserte data); PG
C
rs4711690, rs6458238 og rs9471643 polymorfismer var signifikant assosiert med økt risiko for atrofisk gastritt (
P
= 0,093, OR = 0,75;
P
= 0,015, OR = 0,73;
P
= 0,033, OR = 0,69, henholdsvis) [4];
ERCC6
rs1917799 polymorfisme var signifikant assosiert med økt risiko for magekreft (OR = 1,38,
P
= 0,035) [20].
Den to-veis interaksjon av pri -La-7a-en rs10739971 og PGC, ERCC6 polymorfismer i risikoen for magekreft /atrofisk gastritt
for å undersøke om genet polymorfismer og miRNA polymorfisme hadde en interaksjonseffekt, analyserte vi samspillet mellom miRNA polymorfisme og hvert gen polymorfisme . Vi fant ut at miRNA polymorfisme og
PGC Hotell og
ERCC6
polymorfismer viste sterk statistisk sammenheng med magekreft eller atrofisk gastritt. Derfor analyserte vi samspillet effekten av pri-la-7a-en rs10739971 polymorfisme og
PGC Hotell og
ERCC6
polymorfismer, og dets assosiasjoner, med risikoen for magekreft og atrofisk gastritt. Resultatene indikerte at pri-la-7a-en rs10739971 polymorfisme og
ERCC6
rs1917799 polymorfisme hadde interaksjonseffekter for magekreft (
P
interaksjon = 0,026, Tabell 2). Denne SNP paret viste økt risiko for magekreft (OR = 2,59, 95% CI = 1,12 til 5,97). Pri-la-7a-en rs10739971 polymorfisme og
PGC
rs65458238 og rs9471643 polymorfismer hadde samspilleffekter for risikoen for atrofisk gastritt (
P
interaksjon = 0,012 og 0,039, henholdsvis tabell 3). For rs65458238 polymorfisme, viste SNP paret økt risiko for atrofisk gastritt (OR = 2,77, 95% CI = 01.25 til 06.13); mens den andre SNP paret viste redusert risiko for atrofisk gastritt (OR = 0,52, 95% CI = 0,28 til 0,97) for rs9471643 (tabell 3).
SNP-SNP interaksjoner som involverer flere SNPs ved hjelp av logistisk regresjon
Vi undersøkte SNP-SNP samhandling som involverer tre positive SNPs videre (pri-la-7a-1 rs10739971-
PGC
rs6458238-
PGC
rs9471643) og resultatet var statistisk signifikant (
P
interaksjon = 0,001, Tabell 4). SNP kombinasjonen viste økt risiko for atrofisk gastritt (OR = 23,55, 95% CI = 3,73 til 148,71).
Diskusjoner
Polymorfisme av gener eller miRNA kan tjene som potensielle biomarkører for forutsi sykdomsrisiko. Tidligere studier har i hovedsak fokusert på foreningen av et enkelt gen polymorfisme med sykdomsrisiko, og risikoen var ofte for svak effekt (OR 1,5). Når det gjelder en kombinasjon av to eller flere av SNP-SNP interaksjoner, risikoen var ofte av moderat (OR≥1.5) eller sterk virkning (OR≥2) [4], [10], [22] – [24]. Denne studien, for første gang, undersøkt samspilleffekter av miRNA polymorfisme og
PGC Hotell og
ERCC6
polymorfismer i Nord-kinesiske befolkningen. Studien som mål å gi eksperimentelle bevis for tidlig diagnose og mekanismer for magekreft ved å finne kombinasjoner av gen-gen polymorfismer som kunne forutsi risikoen for magekreft og dens forstadier til sykdommer.
Blant SNPs fra vår gruppe undersøkt under vår kandidat genet forening studie,
ERCC6
single-locus viste en svak effekt for magekreft risiko (OR = 1,46) [16]; de tre
PGC
single-locus viste en svak beskyttende effekt for atrofisk gastritt risiko (OR for rs4711690 = 0,75, ELLER for rs6458238 = 0,73, ELLER for rs9471643 = 0,69) [4]. Vi har derfor en hypotese om at disse polymorfismer kan være optimale kandidater til å undersøke potensielle SNP-SNP interaksjoner ved to eller flere loci som bidrar til magekreft etiologi. Vi utførte samspillet effektanalyse av miRNA polymorfi og genet polymorfismer og funnet tre SNP-SNP par forbundet med sykdommer, hvorav samspillet av ett par (pri-la-7a-1 rs10739971-
ERCC6
rs1917799) var forbundet med magekreft risiko, og interaksjoner av de to andre parene (pri-la-7a-1 rs10739971-
PGC
rs65458238, og pri-la-7a-1 rs10739971-
PGC
rs9471643) var assosiert med atrofisk gastritt risiko.
ERCC6
rs1917799 polymorfisme og
PGC
rs6458238 og rs9471643 polymorfismer har vært rapportert tidligere. I denne studien har vi i tillegg analysert pri-la-7a-en rs10739971 polymorfisme i samme gruppe. Paret av pri-la-7a-en rs10739971 polymorfisme og
ERCC6
rs1917799 polymorfisme hadde en OR av deres interaksjon med 2,59 for magekreft risiko, som var større enn deres individuelle single-locus effekter av 0,92 og 1,07, henholdsvis. Tilsvarende par pri-la-7a-en rs10739971 polymorfisme og
PGC
rs6458238 polymorfisme hadde en OR av deres interaksjon på 2,77 for atrofisk gastritt risiko, som var større enn deres individuelle single-locus effekter av 0,74 og 1,23, respektivt. Paret av pri-la-7a-en rs10739971 polymorfisme og
PGC
rs9471643 polymorfisme hadde en OR av deres interaksjon på 0,52 for atrofisk gastritt risiko. Interessant, deres individuelle enkelt-locus effekter var i strid med de ovennevnte funn, med OR på 1,65 og 1,06, henholdsvis, som fortjener videre selvstendig replikering av våre funn.
Fordi pri-la-7a-en rs10739971 polymorfisme demonstrert interaksjonseffekter med både
PGC
SNPs på atrofisk gastritt risiko, vi videre utført interaksjonsanalyse av de tre positive polymorfismer. Resultatene viste at OR for risikoen for atrofisk gastritt var 23,55 (
P
= 0,001). Vanligvis har en enkelt-locus en svak virkning (OR 1,5) på sykdomsrisiko, og kombinasjonen av to eller flere av SNP-SNP interaksjoner viser ofte en moderat (OR≥1.5) eller en sterk virkning (OR≥2). I den foreliggende studien, OR av pri-la-7a-en enkelt locus var 1,61; OR for interaksjonseffekter med
ERCC6 Hotell og
PGC
var begge mer enn 2; kombinasjonen av de tre positive loci påvist en enda høyere OR av 23,55. Disse resultatene indikerte applikasjons utsiktene til en kombinasjon av to eller flere SNPs som potensielle biomarkører for å forutsi sykdomsrisiko.
Gransker interaksjons effektene av miRNA polymorfismer og gen polymorfismer vil bidra til helhetlig forståelse av genet nettverket og rollen miRNA i patogene prosessen. Funn av SNP-SNP interaksjoner har ofte underliggende mekanismer snarere enn å være bare statistiske resultater [9]. De tre parene av SNPs indikerte at miRNA kan samhandle med gener i magekreftutvikling. PGC protein har en beskyttende effekt i epitelet av den normale magesekken, og dens ekspresjon ble redusert i en atrofisk gastritt gruppe sammenlignet med en normal gruppe [14], [25]. Den eksakte rolle PGC i atrofisk gastritt er fortsatt ikke klart. ERCC6 er involvert i DNA-reparasjon vei, og gjentatte DNA-skade og reparasjon kan føre til celle karsinogenese [15]. På bakgrunn av funnene i denne studien, er det rimelig å foreslå at la-7a kan delta i prosesser av PGC indusere atrofisk gastritt og ERCC6 indusere magekreft. Ifølge resultatene fra miRNA mål prediksjon programvare, det var mulige bindingssteder av la-7a med 3′-UTR for både
PGC Hotell og
ERCC6
. Hvorvidt SNP-SNP samspilleffekter observert i denne studien var på grunn av binding av miRNA og dens målgener fortsatt krever ytterligere funksjonelle eksperimenter.
Denne studien hadde noen begrensninger. Først, selv om vi hadde en relativ stor utvalgsstørrelse på 471 mage kreftpasienter, 645 atrofisk gastritt pasienter og 717 kontroller, dette utvalgsstørrelsen kan fortsatt være utilstrekkelig for å avdekke interaksjonseffekter, spesielt for sjeldne alleler. For det andre mekanismene for de tilhørende SNP-SNP interaksjoner må avklares, og påfølgende funksjonelle eksperimenter er påkrevd. Tredje, flere genom-wide association studier tyder på en integrasjon av data fra genomassosiasjonsstudier av magekreft fra kinesiske populasjoner; Derfor data skal integreres, og kan anvendes som kandidat polymorfi områder som skal studeres i fremtiden. Fjerde, er samspillet mellom genet og miljø for magekreft risiko en viktig faktor som skal vurderes, slik som røyking og drikking. I denne studien har vi samlet noen data om røyking og drikking, men det er fortsatt nesten en tredjedel av manglende data fra prøvene. Interaksjoner mellom gener og røyking og drikking oppførsel på magekreft risiko bør undersøkes.
Konklusjon
Denne studien, for første gang, rapporterer at pri-la-7a-en rs10739971 polymorfisme og
ERCC6
rs1917799 polymorfisme kan ha en interaksjon effekt på magekreft risiko; og pri-la-7a-en rs10739971 polymorfisme kan ha en interaksjonseffekt med
PGC
rs6458238 og rs9471643 polymorfismer på atrofisk gastritt risiko. Noen data er samlet sørge for mulig bygging av en magekreft nettrute. Future store studier og mekanisme eksperimenter er nødvendig for å bekrefte funnene i denne studien.
