Abstract
Bakgrunn
Malignt melanom er en aggressiv svulst i huden og ser ut til å være resistente mot dagens terapeutisk tilnærminger. Melanocyttisk transformasjon er tenkt å skje ved sekvensiell oppbygging av genetiske og molekylære forandringer i stand til å aktivere de Ras /Raf /MEK /ERK (MAPK) og /eller den PI3K /AKT (AKT) signalveier. Spesielt mutasjoner av B-RAF aktivere MAPK veien resulterer i cellesyklusprogresjon og apoptose forebygging. Ifølge disse funnene, kan MAPK og AKT trasé representerer lovende terapeutiske mål for en ellers ødeleggende sykdom.
Resultat
Her viser vi en beregningsmodell i stand til å simulere de viktigste biokjemiske og metabolske interaksjoner i PI3K /AKT og MAPK trasé potensielt involvert i melanom utvikling. Samlet kan dette beregnings tilnærmingen akselerere drug discovery prosessen og oppmuntrer identifisering av nye sti-aktivatorer med påfølgende utvikling av nye antioncogenic forbindelser for å overvinne tumorcelleresistens med konvensjonelle terapeutiske midler. Kildekoden til de ulike versjonene av modellen er tilgjengelig som S1 Arkiv
Citation. Pappalardo F, Russo G, Candido S, Pennisi M, Cavalieri S, Motta S, et al. (2016) Computational Modellering av PI3K /AKT og MAPK signalveier i melanom kreft. PLoS ONE 11 (3): e0152104. doi: 10,1371 /journal.pone.0152104
Redaktør: Suzie Chen, Rutgers University, USA
mottatt: 22 januar 2016; Godkjent: 08.03.2016; Publisert: 25 mars 2016
Copyright: © 2016 Pappalardo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og som støtteinformasjon arkiv
Finansiering:. Dette arbeidet er delvis støttet av FIR 2014 Universitetet i Catania, Italia stipend. Det var ingen andre finansieringskilder som støtter dette arbeidet. FIR 2014 delvis støttet arbeidet. De resterende innsats kommer fra interne personalarbeid
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
RAS /RAF /MEK /ERK og PI3K /AKT /mTOR trasé representerer grunnleggende signaloverføring og regulatoriske nettverk for de fleste cellulære fysiologiske prosesser, som for eksempel spredning, differensiering og celleoverlevelse.
Disse banene er for det meste aktiveres av endringer i Ras, B-RAF, PI3K og PTEN gener [1]. Aktivering av slike baner er ansvarlig for ukontrollert celleproliferasjon, og kan bidra til medikamentresistens. Kombinasjonsterapier med farmakologiske inhibitorer av disse banene kan ha potensielle anvendelser for undertrykkelse av cancer celleproliferasjon og i sin tur kan være effekt i forhold til tilbake motstand. Malignt melanom er en god tumormodell for å undersøke aktivering av RAS /RAF /MEK /ERK og PI3K /AKT /mTOR veier som det er ofte påvirket av B-RAF
V600E mutasjon som forårsaker aktivering av MAPK-reaksjonsveien [2- ]. Det er en aggressiv tumor i huden med en dårlig prognose for pasienter med langt fremskreden sykdom, og det ser ut til å være motstandsdyktig mot dagens terapeutiske tilnærminger.
melanocyttisk transformasjon er tenkt å skje ved sekvensiell oppbygging av genetiske og molekylære forandringer [3- , 4]. Selv om de sykdomsfremkallende mekanismene bak melanom utvikling er fortsatt i stor grad ukjent, har flere gener og metabolske veier vist seg å bære molekylære endringer i melanom. Melanomer utstillingen mutasjoner i RAS /RAF /mitogen aktivert protein kinase (MAPK) bane. Det har vist seg at 50% kutant melanom oppviser B-RAF
V600E mutasjoner, noe som resulterer i en aminosyresubstitusjon i posisjon 600 i B-RAF, fra et valin (V) til en glutaminsyre (E). Denne mutasjonen er kjent for å spille en viktig rolle i spredning og overlevelse av melanomceller, gjennom aktivering av MAPK-reaksjonsveien [5]. Særlig forekommer det innenfor aktiverings segment av kinase-domenet og det resulterer i en økt aktivitet av kinasen selv. Konstitutiv aktivering av kinase aktivitet fører til unresponsitivity av negative tilbakekoblingsmekanismer innenfor MAPK-reaksjonsveien [6].
I tillegg er en interaksjon mellom MAPK og den phosphatidylinositide 3-kinase (PI3K) /AKT veier har blitt funnet i kutant melanom [7]. Interessant nok har disse studier tyder på at MAPK og AKT veier er aktivert i parallell og det bevis for at PI3K /AKT og MAPK /ERK1 /2 kaskader er forbundet med hverandre er i stor grad beskrevet [8, 9, 10]. Det er flere krysstale punkter mellom de to banene, som har koordinert handling bestemmer cellens skjebne [11]. Det er ikke overraskende at de PI3K /AKT og MAPK trasé påvirker hverandre på ulike stadier av signal forplantning, både negativt og positivt, noe som resulterer i dynamiske og komplekse krysstale. Ifølge disse funnene, kan MAPK og AKT trasé representerer lovende terapeutiske mål for en ellers ødeleggende sykdom.
Datasimuleringer og beregningsorientert modellering er nyttige for å analysere og å øke kunnskapen om metabolske veier og deres komplekse samspill med det formål å forstå mekanismene for motstand mot konvensjonell medikamentell behandling i melanom [12, 13, 14].
i dette arbeidet utvikler vi en beregningsmodell som simulerer både PI3K /AKT og MAPK trasé og deres samspill, for å analysere kaskadereaksjoner er ansvarlige for melanom utvikling. Videre modellert vi atferden til malignt melanom A375 cellelinje, husing B-RAF
V600E mutasjon under behandling av Dabrafenib, en kommersiell selektiv B-RAF-hemmer, nylig godkjent til behandling av pasienter med BRAF V600E mutation- positiv avansert melanom [15].
Totalt denne modellen kan brukes til en in silico lab for å studere effekter av potensielle hemmere som kan forbedre responsen på standard behandling.
Metoder
Computational modell av MAPK og PI3K /AKT trasé
for å forstå effekten av B-RAF endringer på begge RAF-ERK og PI3K-AKT trasé vi startet fra modellen som er utviklet av Brown og medarbeidere [16]. I sitt arbeid, forfatterne presentert en beregningsmodell av epidermal vekstfaktor (EGF) og nervevekstfaktor (NGF) aktivert ERK-reaksjonsveien i PC12-celler, inneholdende 13 forskjellige proteinarter og 16 biokjemiske reaksjoner. Vår modell ble utviklet ved hjelp COPASI (kompleks Pathway simulator), en programvare for simulering og analyse av biokjemiske nettverk og dynamikk [17]. Vår modell har betydelig utvidet Brown modell. Den består av 48 arter og 48 biokjemiske reaksjoner.
Hvis du vil inkludere alle enheter og deres respektive interaksjoner nyttige til målet med denne studien har vi hentet all nødvendig informasjon fra KEGG (Kyoto Encyclopedia of gener og genomer) veien database [18]. Spesielt har vi fokusert på samspillet mellom to spesifikke pathways: MAPK signalveien (KEGG referanse: ko04010) og PI3K-AKT signalveien (KEGG referanse: hsa04151). Vi studerte kompleks oppførsel av de viktigste proteinkinase-kaskader som involverer den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR), fosfatidylinositol-4,5-bifosfat 3-kinase (PIK3CA), RAC serin /treonin-proteinkinase (AKT) og RAF proto -oncogene serin /treonin-protein kinase (RAF1). Dette uunngåelig føre oss til å vurdere de andre signalveier som viste en sammenheng med de som kan indusere Dabrafenib motstandsfenomener. For å oppnå dette har vi også tatt inn i modell Ras signalveien (KEGG referanse: ko04014) og mTOR signalveien (KEGG referanse: ko041150). For å undersøke mulige mekanismer ikke observert før
Relative innledende konsentrasjoner av enhetene som omfattes vår modell ble samlet fra GSE22301 tilgjengelig på GEO (Gene Expression Omnibus) datasett (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) inkludert uttrykk profilering av flere melanoma cellelinje samt A375 brukt i denne studien. Microarray matrisedata ble normalisert ved log transformasjon hjelp MeV data analyseverktøy [19]. Oppsummering, brukte vi KEGG database for å forstå og modellere sti flyt og GEO datasettet for å få A375 cellelinje uttrykk profilering; Videre setter vi verdiene av konsentrasjonene av de proteinene som finnes av Brown et al.
De lover som styrte de aktiveringer /deaktivering i Brown-modellen var basert på Henri-Michaelis-Menten kinetikk. Denne kinetiske lover er en av de vanligste utførelsen av enzymkinetisk. Dens matematisk form er følgende:
Den beskriver graden av enzymatiske reaksjoner, der «V» representerer den maksimale hastigheten nås av systemet, mens Henri-Michaelis-Menten konstant (Km) er underlaget konsentrasjon på som reaksjonshastigheten er halvparten av V [20].
litt modifisert den klassiske Henri-Michaelis-Menten lov til å ta hensyn til både underlaget og modifiserings som spiller en spesiell rolle når vi har vurdert reaksjoner som aktiveres (og /eller deaktivert) spesifikke proteiner. Ligningen for den modifiserte Henri-Michaelis-Menten er:
kcat representerer antall enzymatiske reaksjoner katalysert per sekund og ligningen inneholder to typer underlag. Substrate1 står for modifiseringsmidlet for reaksjonen, mens Substrate2 er generisk substrat. Det resulterer mer egnet for våre formål, fordi den analyserer forholdet mellom reaksjonene i systemet og deres affinitet for substratet å ta i betraktning effektiviteten av modifiserende middel som er involvert.
Alle de biokjemiske reaksjoner som brukes i vår modell kan bli derfor delt inn i fire hovedklasser:
i)
aktivering /deaktivering reaksjoner modellert med en modifisert Henri-Michaelis-Menten lov (for eksempel Raf1Inactive blir aktivert (Raf1Active) gjennom RasActive);
ii)
reaksjoner som fysiologisk inaktiverer arter, modellert med massevirknings lov (for eksempel C3G deaktivering);
iii)
proteiner degradering modellert med massevirknings lov (for eksempel Dabrafenib nedbrytning);
iv)
proteiner produksjon modellert med irreversible konstant forandring lov (for eksempel produksjon av frie RTK).
Et av målene i modellen var å analysere dynamikken i kritiske noder i A375 melanoma cellelinje husing B-RAF
V600E mutasjon. Derfor har vi modellert denne cellelinjen som følger:
i)
vi innført nye arter bRafMutated med samme opprinnelige konsentrasjonen av bRafInactive av 120 000 mmol /ml;
ii)
vi slettet B-RAF aktivering av Rap1 som de nye artene bRafMutated er ikke berørt av dette signal (det samme gjelder for Ras);
iii)
vi hemmet deaktivering av B-RAF av Raf1PPtase (som Raf1PPtase ikke lenger påvirke B-RAF);
iv)
bRafMutated erstatter bRafActive arter i utløser Mek aktivering. Det andre målet for modellen er å bruke den som en in silico laboratorium for å analysere oppførselen av spesifikke terapeutiske behandlinger mot melanom, spesielt i dets resistensmekanismer, med det mål å foreslå nye strategier som kan anvendes i slike tilfeller. Vi har derfor satt inn i modellen funksjoner for å reprodusere virkningen av Dabrafenib inhibitor i de komplekse dynamikken av PI3K /AKT pathway. For å gjøre denne oppgaven, har vi lagt til Dabrafenib arter (på ulike konsentrasjoner, se resultater avsnitt). Deretter modellert vi to spesifikke reaksjoner dvs. den normale medikament degradering og den viktigste effekten av Dabrafenib ved inhibering av de bRafMutated arter. Fra den spesifikke litteraturen er det rapportert at halveringstiden for Dabrafenib er 10 timer (European Medicines Agency: https://www.ema.europa.eu). Vi brukte denne parameteren for å sette den tilhørende masseaksjoner lov til å reprodusere sin forfall.
Et annet viktig aspekt ikke vurdert i Browns modellen er at alle reseptorene er svært raskt utløst av EGF og følgelig de forblir konstitutivt aktivert fordi deres modell ikke ta hensyn til noen reaksjon fra degradering av reseptorer. Vi modellert dette aspektet sette inn en nedbrytningsprosess basert på en irreversibel masseaksjon loven påvirker både den frie og bundne RTK reseptorer. Dessuten gjorde den opprinnelige Brown EGF modellen inkluderer ikke C3G /Rap1 sti, en grunnleggende viktig punkt for aktivering av B-RAF og dermed på ERK dynamikk. For dette formål modellert vi aktivering av C3G arten gjennom bundet RTK-reseptoren, og den Rap1 aktivering gjennom den aktiverte C3G proteinet.
Videre har vi dypt analysert grunnleggende rolle AKT proteinkinase i krysstale mellom de to hovedveier involvert. Spesielt har vi fokusert på rollen av AKT på aktivering av mTORC1 sti og på aktivering /deaktivering maskiner av flere proteiner på AKT signalering. Den resulterende gjennomføring av trasé-modellen, sammen med de relative settet med oder kan bli funnet å se på figurene 1 og 2.
aktivering /deaktivering reaksjoner (modellert med en modifisert Henri-Michaelis-Menten-lov) er vist på følgende måte: modifiserings dvs. katalysatoren som utløser reaksjonen er vist ved en tynn lys grønn linje som ender med en rombe; de involverte artene er forbundet ved hjelp av piler som starter med en blå farge (input slag), og slutter med en brun farge som følge (arter). For eksempel blir Raf1Inactive aktivert (Raf1Active) gjennom RasActive. Reaksjoner som inaktiverer fysiologisk arter (modellert med massevirknings lov) er angitt med en pil som starter med en blå farge, og slutter med en brun farge, for eksempel C3G deaktivering. Proteiner degradering (modellert med massevirknings lov) er avbildet med de vurderte artene er forbundet med en pil avslutning med et tomt sett symbol, for eksempel Dabrafenib degradering. Proteiner produksjon (modellert med irreversibel konstant forandring lov) er avbildet med de vurderte artene forbundet ved hjelp av en pil (for eksempel, er produksjonen av frie RTK). Arcadia programvare (https://arcadiapathways.sourceforge.net) har blitt brukt til å produsere grafisk representasjon av modellen.
De tilgjengelige versjoner av Copasi modellene kan nås som S1 Archive.
Cell linje kultur og behandling
A375-cellelinjen ble innhentet fra ATCC (LGC Standards, Italia). Denne cellelinjen stammer fra en 54 år gammel kvinne med malignt melanom og representerer en god modell for å studere rollen MAPK og AKT veier fordi det påvirkes av enkelt endring vises i B-RAF genet (V600E) (Se Cosmic nettside , https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic). Faktisk kan nærværet av andre genetiske endringer, slik som mutasjonene i KRAS eller NRAS gener, bestemme aktiveringen av MAPK-reaksjonsveien.
A375 melanomcellelinje, oppnådd fra ATCC (LGC Standards, Italia), ble dyrket i en fuktig 5% CO2 inkubator ved 37 ° C med RPMI-1640 supplert med 2 mmol /l L-glutamin, 100 IU penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS), kjøpt fra Lonza ( Walkers, USA). Den A375 ble sådd ut i 70 mm cellekulturskåler ved tetthet på 500.000 celler, og etter 24 timer ble behandlet i 48 timer med Dabrafenib (Selleck Chemical, USA) for å sluttkonsentrasjon på 2, 1, 0,5, 0,25 og 0,125 nM. Dimetylsulfoksid (DMSO) (Sigma-Aldrich, USA) ble anvendt som kontroll.
Western blot-analyse
Protein profilering av behandlede A375 cellelinjer ble analysert ved western blot ved anvendelse av anti-MAP kinase ERK1 /ERK2 (pThr202 /pThr204) kanin Ab (kat. n. 442685) og Anti-MAP kinase ERK1 /ERK2 kanin Ab (kat. n. 442704) levert fra Merck Millipore (Darmstadt, Tyskland) for å oppdage fosforylert og total ERK en /2 proteiner, henholdsvis. The Anti-beta Tubulin Ab (ab 15568- Abcam, Cambridge, UK) ble brukt som husholdningsgenet. Kromogen påvisning av proteiner ble utført med Novex HRP kromogen (Invitrogen, USA). Western blot bildene ble analysert med bilde J programvare. Alle forsøk ble utført in triplo. T-test ble brukt for statistisk analyse.
Resultater
Vi simulert vår modell under normale generiske vekstfaktor (GF) stimulering vilkår for å bekrefte at det ga en sterk forbigående aktivering av ERK. Da vi simulert A375-cellelinjen med B-RAF mutasjon. I dette tilfellet forventes vi forhøyet ERK-aktivitet som er karakteristisk for B-RAF
V600E mutert melanomer. Fig 3 viser dynamikken i både aktivert ERK (perk) og B-RAF. Venstre panel streker normal tilstand saken; mens viser panel høyre B-RAF mutert A375 cellelinje scenario. Til slutt, forut simuleringen korrekt forventet oppførsel dvs. arten ErkActive har en konstant forhøyet aktivitet. På grunn av de ulineariteter av de presenterte modellen og til det høye antall noder og interaksjoner inne i veien, selv om det er en klar sammenheng mellom bRafActive og ErkActive, kan vi ikke si at det er en lineær sammenheng mellom de to.
Venstre panel viser oppførsel under normale GF stimulering mens panelet til høyre viser dynamikken med B-RAF (bRafMutated) mutasjon i A375-cellelinjer.
spesielt høyere nivåer av ErkActive er ikke observert sannsynligvis på grunn av det faktum at ErkActive allerede er nær sine terskelnivåer, og /eller som følge av bidraget fra andre noder i den bane som kan påvirke det endelige utfall.
Videre har vi simulert oppførselen til A375 cellelinjer under forskjellige konsentrasjoner av Dabrafenib inhibitor. B-RAF hemming fører til begrensning av Perk aktivitet. Følgelig, i tabell 1, andelen av hemming av ekstra fordel er vist som følge av ekstra fordel og ERK-forhold. Konkordant resultater ble oppnådd analyse in vitro og i silikoaluminofosfater data.
Dynamikken i både Perk og B-RAF muterte ble modellert (fig 4). ERK in silico-konsentrasjonen ble satt til 600000 mmol /ml. Fem paneler. Hvert panel viser den ekstra fordel, B-RAF mutert og Dabrafenib dynamikk i 48 timer for simulering ved forskjellig Dabrafenib dosering dvs. 0,125 nM (A), 0,250 nM (B), 0,500 nM (C), 1,0 nM (D) og 2,0 nM (E). Når ingen behandling gis (DMSO) Perk konsentrasjon nådd 571950 mmol /ml ved 48 h. Med forskjellige doseringer av Dabrafenib, Perk konsentrasjoner nås 529602 mmol /ml (A), 368352 mmol /ml (B), 207518 mmol /ml (C), 106758 mmol /ml (D) og 53385 mmol /ml (E), som viser henholdsvis den prosentvise inhibering rapportert i tabell 1.
Perk konsentrasjonen reduseres i løpet av Dabrafenib behandling i A375 melanoma cellelinje. Oppførselen til ekstra fordel er direkte korrelert til Dabrafenib konsentrasjon. Forskjellige doseringer av Dabrafenib er vist (1 nM = 1e-9 mmol /ml): 1.25e-10 mmol /ml (A), 2.5E-10 mmol /ml (B), 5e-10 mmol /ml (C), 1e -9 mmol /ml (D) og 2e-9 mmol /ml (E). I alle panelene høyre y-akse stiplede linjene representerer bRafMutated konsentrasjoner mens heltrukne linjer representerer Dabrafenib konsentrasjoner.
Reduksjonen av Perk konsentrasjoner er i overensstemmelse med det som er observert in vitro.
fig 5 streker vestlige blotting plott. Også i dette tilfelle oppnås vi en god overensstemmelse med de i silikoaluminofosfater resultater. I konklusjonen, både fra modellresultatene og fra in vivo eksperimenter, kan vi observere at p-ERK synker ned på grunn av hemmer aktiviteten til Dabrafenib løpet B-RAFV600E protein. Vi analyserte p-ERK som det er en av de viktigste protein kinase som er involvert i cellesignalisering proliferasjon. Et viktig aspekt i forbindelse med inhibering av B-RAFV600E proteinet er at en liten brøkdel av behandlede melanompasienter utvikler resistensmekanismer som gjør at behandlingen ikke er mer effektive. Modellen kan være nyttig for å analysere den komplekse PI3K /AKT og MAPK veier for å oppdage proteiner som kan forårsake slike motstandsfenomener.
Western blot-analyse av p-Erk og total ERK i A375 melanoma cellelinje etter behandlingen med forskjellige doser av Dabrafenib i 48 timer (A). p-ERK signal ble normalisert med total ERK signal (B), SD og hjelp av de normaliserte p-ERK verdiene ble rapportert.
Konklusjoner
Vi presenterte en beregningsmodell som simulerer både PI3K /AKT og MAPK stier og deres samspill, for å analysere kaskadereaksjoner er ansvarlige for melanom utvikling. Vi simulerte en terapi intervensjon dvs. administrasjon av en kjent B-RAF-hemmer, Dabrafenib. Denne studien har vist hvordan beregningsmodeller kan være nyttige verktøy for å undersøke og sammenligne biologiske oppførsel av signaltransduksjon Path- måter som de kan foreslå nye hypoteser for å forklare de observerte biologiske data og bidra til å forstå dynamikken i hvordan veien funksjoner. Videre kan beregningsmodeller lett kan brukes til å undersøke ulike sykdomstilstander, og foreslår hvordan medikamentbehandling kan forbedres for å bedre bekjempe effektene av sykdommen. Vi mener at vår modell er en god representasjon av PI3K /AKT og MAPK med aktivert ERK sti som kan utvides og brukes i fremtiden for å ytterligere undersøke dynamikken i resistente mekanismer for å foreslå nye tiltak for å foreslå nye terapeutiske intervensjoner.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 arkiv. I zip arkivet, er det tre forskjellige tilgjengelige versjoner av modellen: File PI3K_AKT_Final_V2.1.cps, fysiologiske modell dvs. ingen B-RAF mutasjon; File PI3K_AKT_Final_V2.1_A375.cps, A375 cellelinje modell dvs. med B-RAF mutasjon; File PI3K_AKT_Final_V2.1_A375_Dabrafenib.cps, komplett modell med både B-RAF mutasjon og Dabrafenib hemmer satt til laveste dose
doi:. 10,1371 /journal.pone.0152104.s001 product: (ZIP)
