Abstract
Innledning
I de fleste tilfeller av livmorhalskreft, HPV DNA er integrert i genomet carcinoma celler. Denne mutasjons innsetting utgjør en svært spesifikk molekylær markør av tumor-DNA for hver pasient. Sirkulasjons svulst DNA (ctDNA) er en ny markør for kreft dynamikk som deteksjon krever spesifikke molekylære motiv. For å avgjøre om sekvensen av cellen-viral krysset kunne brukes i klinisk praksis som en spesifikk markør for ctDNA, analyserte vi en serie av livmorhalskreft pasient serumer.
Metoder og funn
Serum prøver fra 16 pasienter diagnostisert med HPV16 /18-assosiert cervikal cancer, og for hvilken den viral integrering locus tidligere var blitt lokalisert, ble analysert. Sekvensielle serumprøver, tatt på forskjellige tidspunkter i løpet av sykdommen, var også tilgjengelige for to av disse tilfellene. ctDNA ble funnet i 11 ut av 13 pasienter med tumorstørrelse som er større enn 20 mm ved diagnose, og analyse av sekvensielle serumprøver viste at ctDNA konsentrasjon i serum hos pasienter var relatert til tumor dynamikk.
Konklusjoner
Vi rapporterer at HPV mutasjons innsetting utgjør en svært spesifikk molekylær markør for ctDNA i HPV-assosiert kreftpasienter. Ved hjelp av denne originale tilnærmingen, ble ctDNA påvist i de fleste livmorhalskreftpasienter enn stadium I og ctDNA konsentrasjon ble funnet å reflektere tumorbyrde. I tillegg til sitt potensiale og prognostiske prediktiv verdi, er HPV mutasjon innsetting sannsynlighet for å utgjøre en ny molekylær surrogat for minimal restsykdom og av subklinisk tilbakefall i HPV-assosiert tumor. Dette er av stor betydning i perspektiv av spesifikke anti-HPV terapi
Citation. Campitelli M, Jeannot E, Peter M, Lappartient E, Saada S, de la Rochefordière A, et al. (2012) humant papillomavirus mutasjons Insertion: Spesifikk Marker sirkulerende Tumor DNA i livmorhalskreft pasienter. PLoS ONE 7 (8): e43393. doi: 10,1371 /journal.pone.0043393
Redaktør: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugal
mottatt: 23 februar 2012; Godkjent: 20 juli 2012; Publisert: 24. august 2012 |
Copyright: © Campitelli et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av et partnerskap med La Maison Goyard og av en sjenerøs gave fra Ms A. Mauresmo. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Dette arbeidet ble støttet delvis av partnerskapet av La Maison Goyard, luksus bagasje- maker, gjennom hendelsen «Un Luggage helle Curie «. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Spesifikke typer av humant papillomavirus (HPV) er anerkjent som den viktigste årsaksfaktoren i livmorhals neoplasi [1]. I pre-invasive lesjoner, de virale genomer er til stede som episomale molekyler i kjernen til infiserte celler. I de fleste tilfeller av invasivt karsinom, men er HPV DNA-sekvenser integrert i det cellulære genomet [2], [3], [4]. Virusgenom integrasjon representerer således et viktig skritt i tumorigenesis [5]. En enkelt unikt viral integrering nettstedet har blitt funnet på mer enn 80% av livmorhalskreft [6].
Det karakteristiske klonalitet, spesifisitet og stabilitet over tid av HPV DNA settes inn i genomet til karsinomceller utgjør en svært spesifikk genetisk markør for svulst DNA. Nyere data har vist at mutant-DNA kunne bli påvist i blodet hos pasienter med tumorer, og at mengden av sirkulerende tumor DNA (ctDNA) var relatert til tumor dynamikk [7]. Dette åpner store perspektiver for bruk av ctDNA som en svulst biomarkør hos kreftpasienter [8]. I avansert stadium livmorhalskreft, har flere studier rapportert bevis for sirkulerende HPV DNA (c-HPV-DNA) [9], [10], [11] eller sirkulering av HPV-RNA [12]. Disse studiene viste at det var mulig å påvise virale nukleinsyrer i blodet hos pasienter med kreft i livmorhalsen, men på grunn av mangel på sensitivitet [10], [13], [14] og tvilsom spesifisitet [11], [13], i data var av liten klinisk effekt. I denne sammenheng har vi designet en studie for å vurdere verdien av insertional mutasjon av HPV DNA som en markør for påvisning og kvantifisering av ctDNA ved diagnose i serum hos pasienter med invasiv livmorhalskreft. Vi har også sett på variasjoner av ctDNA konsentrasjon i løpet av sykdommen. I tillegg, for å sammenligne følsomheten av den opprinnelige og spesifikk analyse for at basert på deteksjonen av HPV DNA-sekvenser, har vi også sett for c-HPV-DNA ved anvendelse av primere som ligger i den E7 HPV16 /18-genet.
Materials og metoder
Pasienter og svulster
fra en serie med HPV16 (14 tilfeller) eller HPV18 (2 tilfeller) livmorhalskreft samlet mellom 2001 og 2011, bestemt vi viral innsetting locus bruker DIPS- PCR-metoden [15]. I de 16 tilfeller, serumprøver tatt ved diagnose før behandling var tilgjengelig. I to av disse tilfellene flere sekvensielle serumprøver tatt i løpet av sykdomsforløpet var også tilgjengelig. Fjorten svulster var invasiv plateepitel karsinom og to var kjertel. I henhold til fransk regulering, ble alle pasientene informert og hadde ingen innvendinger mot sine biologiske prøver som brukes til forskning. Den virusmengde, i tumorbiopsiprøver ble bestemt ved kvantitativ PCR (qPCR) ved anvendelse av primere utformet i den E7 HPV16 /18-genet, som tidligere beskrevet [6]. Siden integrerte HPV DNA-sekvenser kan presentere forsterkning ved innsetting locus, ble mutasjons innsetting kopiantall også vurderes ved qPCR å bruke primere og reagenser oppgitt i tabell S1.
KLK3
genet status ble tatt som en to kopier referanse.
DNA serumanalyser
DNA ble isolert fra 200 ul serum med QIAamp Min Eluer Virus Spin Kit (Qiagen® , Courtaboeuf, Frankrike) etter produsentens anvisninger. Elueringen Trinnet ble utført med 25 ul av tilført buffer. Isolerte DNA-konsentrasjoner ble målt ved hjelp av en Real-Time kvantitativ PCR (RT-qPCR) system basert på Long interspaced Nuclear Elements (LINE) sekvens deteksjon [16]. Fortynninger av normalt humant DNA ble anvendt som standard, og PCR ble utført i 25 ul med SYBR® grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, Villebon-sur-Yvette, Frankrike), primere blanding (1 uM) og 2 ul av eluert med DNA følgende sykkel betingelser: 15 minutter ved 95 ° C og 45 sykluser (15 s, 95 ° C, 15 s, 61 ° C, 1 min, 72 ° C) etterfulgt av en dissosiasjon trinn (15 s, 95 ° C; 15 s , 60 ° C, 15 s, 95 ° C). RT-qPCR-analyse ved bruk av Sybr®Green (Applied Biosystems) ble utviklet for å spesifikt forsterke celle-virus-DNA-sekvenser knutepunkt (eluert DNA 2 mL), eller HPV16 E7 DNA (DNA eluert 2 ul) med 400 nM av hver primer i et sluttvolum på 25 pl. Hvert sett av primere ble testet på serielle fortynninger (fra 50 ng /mL til 0,5 pg /ul) av matchende tumor-DNA i Tris-EDTA buffer med termosykler betingelsene i 15 minutter ved 95 ° C og 45 sykluser (15 s, 95 ° C , 1 min, 62 ° C) etterfulgt av en dissosiasjon trinn (15 s, 95 ° C, 1 min, 60 ° C, 15 s, 95 ° C). Primer sekvenser og MgCl
2 konsentrasjoner er gitt i tabell S1. Følsomheten av PCR assay måtte være lik eller større enn 5 pg /mL for å validere primersettene. For å øke sensitiviteten av påvisningen ble 10 replikater av RT-qPCR-analyse utført på hver serumprøve for påvisning av ctDNA og av c-HPV-DNA. Mengden av ctDNA i 200 ul serum tilsvarte summen av ctDNA påvist i hver positiv gjengivelse. Konsentrasjonen av ctDNA ble endelig uttrykt i kopier /ml serum.
Resultater
Klinisk Figo etapper var fra Ib til IVa og ett tilfelle var et bekken tilbakefall av livmorhals SCC (tabell 1). Tumorstørrelse varierte 10-120 mm. De tilgjengelige plateepitelkarsinom antigen (SCC) verdier varierte fra 1,1 ng /ml til 17,4 ng /ml (terskelen til positivitet: 1,5 ng /ml). HPV-DNA ble integrert på forskjellige loci (tabell 1). Virusmengden i vevsprøver varierte fra 0,5 til 160 HPV16 genomer per celle (0,8 10
6 til 24 10
6 HPV16 kopier /ug DNA). Konsentrasjonen av sirkulerende vert DNA varierte fra 6 10
1-77 10
3 kopier /ml serum (tabell 1). Vi var i stand til å oppdage ctDNA i 11 av 16 pasienter diagnostisert med invasiv livmorhalskreft. Tre negative tilfeller samsvarer med tidlig stadium (Ib) karsinom med en størrelse i området fra 10 til 20 mm (tabell 1). Serumkonsentrasjonen av ctDNA varierte fra 5 til 890 kopier /ml serum, som representerer fra 0,01% til 25% av sirkulerende vert DNA. c-HPV-DNA ble påvist i 13/16 tilfeller, de tre tidlig stadium tilfeller gjenværende negativ. -Verdiene i området 5 til 8,5 10
3 kopier /ml serum (tabell 1). De tre høyeste verdier (8,5, 3,5 og 3,4 10
3 kopier /ml) tilsvarte tilfeller med høy virusmengde i tumorbiopsiprøver, noe som tyder på at DNA avledet fra episomale molekyler ble også påvist ved analysen.
ctDNA dynamikk ble analysert på sekvensielle serumprøver i to pasienter. Den første pasient mottok kombinert kjemoradioterapi fulgt av utero-vaginal brakyterapi og kirurgi (figur 1, gjelder n ° 6). Den ctDNA verdi ble redusert under behandlingen og ble null ved slutten av behandlingen ved hvilken tid en fullstendig histologisk respons ble observert på hysterektomi prøven. To måneder senere, pasienten utviklet en 8 mm levermetastaser og ctDNA ble påviselig igjen. Økende nivåer av ctDNA ble senere funnet når pasienten utviklet mage node tilbakefall. De samme dynamikken ble observert i den andre pasienten behandles utelukkende med kjemoradioterapi (Figur 1, case n ° 13). Av interesse under oppfølging, mens bekken MR viste ingen signifikant endring, ble det observert en økning på ctDNA. Like etterpå pasienten presenterte en abdominal tilbakefall forbundet med høye nivåer av ctDNA. De samme dynamikken ble observert med c-HPV DNA.
Diskusjoner
Vi rapporterer her at, ved hjelp av HPV integrasjon mutasjon som en molekylær markør, kan ctDNA påvises i serum av mest pasienter diagnostisert med invasiv cervikal karsinom i løpet av scenen Ib, og at mengden av ctDNA reflektert tumor dynamikk. Siden viral integrering nettstedet er unik for hver pasient, er denne markøren svært spesifikk, mye mer enn SSC markør [17]. Når det gjelder følsomhet, kunne vi påvise ctDNA i 11 ut 13 (85%) pasienter med stadium II-IV tumorer, en hastighet som stort sett er høyere enn 12% [9], 18% [13], 20% [14] og 50% [ ,,,0],11] av positivitet rapportert så langt for c-HPV-DNA. Praksisen med 10 replikater for påvisning av ctDNA i hver serumprøve kan forklare den økede følsomhet av vår analyse. For eksempel, i de fleste av våre positive tilfeller mindre enn 50% av replika gitt bevis for ctDNA. Imidlertid, i to av de 13 tilfeller med en tumorstørrelse ved 20 mm, ble det ikke funnet ctDNA mens c-HPV-DNA ble påvist. Begge sakene samsvarer svulster med lav HPV innsetting belastning (≤1 kopier /celle). I motsetning til livmorhalskreft cellene ofte båtplass gratis HPV genomer som også er utgitt i generelle sirkulasjon, og dermed øke frekvensen av påvisning av sirkulerende virus-DNA. Likevel denne eiendelen kan balanseres av en risiko for falsk positivitet. For eksempel analyser basert på påvisning av HPV DNA tilgjengelig falske positive på 13,5% i normale individer, og 33% i CIN3 pasienter [11]. I tillegg ble hyppige uoverensstemmelser mellom HPV-genotyper som finnes i livmorhalskreft og i serum hos de samme pasientene også rapportert [13]. Disse vanskeligheter må overvinnes ved passende kontroll av spesifisitet og, for kliniske formål, kan c-HPV DNA-analyse utgjør et nyttig alternativ der identifikasjon eller bruken av viral-celle koblingssekvenser er vanskelig.
Analyse av sekvens serumprøver viste dynamikken resultatene: konsentrasjonen av ctDNA redusert etter behandling og økt ved tidspunktet for tilbakefall. Positivitet av ctDNA innledes radiologisk tilbakefall i ett tilfelle, og var forbundet med en 8 mm levermetastaser i den andre. Tumor DNA kan være lettere frigjøres fra svulstvev som tilsvarer tilbakefall eller metastaser enn til primær lesjon. Det kan også være avledet fra sirkulerende tumorceller. En spesifikk og kvantitativ molekylær markør for ctDNA kan anvendes for å følge forløpet av livmorhalskreft. Under innledende behandling, kan ctDNA bidra til å vurdere sykdomsprognosen og tumor følsomhet for terapi. Større prospektive studier vil være nødvendig å validere dette verktøyet. Under oppfølging, kan ctDNA konsentrasjonen være en svært spesifikk surrogatmarkør for minimal restsykdom og subklinisk tilbakefall. Dette er av stor betydning i perspektiv av spesifikke anti-HPV terapi [18] som har potensielle effektivitet er i stor grad avhengig av tumormassen. Disse metodene kan være lett utvides til andre typer HPV-assosiert svulster, analkanalen og hode og nakke kreft, for eksempel. Lokalisering av HPV integrasjon nettstedet er foreløpig ikke vurdert i klinisk praksis. Nye teknologier som Next Generation Sequencing [19], men bør legge til rette for denne avgjørelsen og gi optimal molekylær karakterisering av svulster å tilpasse håndteringen av pasienter. I tillegg kan følsomheten for påvisning av ctDNA være lett økes, bare ved å analysere en større mengde av serum og /eller ved å øke effektiviteten av PCR-assay, for eksempel ved hjelp av digitale PCR [20] .Disse fremskritt vil lette vurderingen av bruken av ctDNA i klinisk onkologi og vil forbedre den biologiske oppfølging av pasienter behandlet med livmorhalskreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Grunning sekvenser og reagenser for påvisning av ct-DNA.
doi: 10,1371 /journal.pone.0043393.s001 plakater (DOC)
Takk
Vi takker Mr F Radvanyi for fruktbare diskusjoner og Ms A. Le Cunff og Z. Maciorowski for deres hjelp i utarbeidelsen av manuskriptet.
