Abstract
Bakgrunn
RNases er nå studert som ikke-mutagene alternativer til de skadelige DNA-skade kreft narkotika som vanligvis brukes i klinisk praksis. Mange pattedyr RNases ikke er potente giftstoffer på grunn av sterk hemming av ribonukleasehemmer (RI) presentert i cytoplasma i pattedyrceller.
Metodikk /hovedfunnene
På jakt etter nye effektive antikreft RNases vi studert effekten av barnase, en ribonuklease fra
Bacillus amyloliquefaciens
, på menneskelige kreftceller. Vi fant at barnase er motstandsdyktig mot RI. I MTT celleviabilitet assay barnase var cytotoksisk for humane carcinom cellelinjer med halv-hemmende konsentrasjoner (IC
50) som strekker seg fra 0,2 til 13 uM, og for å leukemicellelinjer med IC
50 verdier i området fra 2,4 til 82 pM . Også, karakterisert vi de cytotoksiske effektene av barnase-baserte immunoRNase scFv 4D5-dibarnase, som består av to i serie koblede barnase molekyler til enkeltkjede variabel-fragment (scFv) av humanisert antistoff 4D5 som gjenkjenner det ekstracellulære domene av markør kreft HER2. ScFv 4D5-dibarnase spesifikt bundet til HER2-positive celler og er internaliseres via reseptor-mediert endocytose. Den intracellulære lokalisering av internalisert scFv 4D5-dibarnase ble bestemt ved elektronisk mikroskopi. Den cytotoksiske effekt av scFv 4D5-dibarnase på HER2-positiv human ovarian carcinoma SKOV-3-celler (IC
50 = 1,8 nM) var tre størrelsesordener større enn for barnase alene. Både barnase og scFv 4D5-dibarnase indusert apoptose i Skov-3 celler ledsaget av internucleosomal kromatin fragmentering, membran blebbing, utseendet på fosfatidylserin på den ytre vedlegget plasmamembranen, og aktivering av caspase-3.
konklusjoner /Betydning
Disse resultatene viser at barnase er en potent giftig middel for målretting til kreftceller
Citation. Edelweiss E, Balandin TG, Ivanova JL, Lutsenko GV, Leonova OG, Popenko VI , et al. (2008) barnase som en ny terapeutisk middel Utløsende apoptose i humane kreftceller. PLoS ONE 3 (6): e2434. doi: 10,1371 /journal.pone.0002434
Redaktør: Gideon Schreiber, Weizmann Institute of Science, Israel
mottatt: 22 august 2007; Godkjent: 13 mai 2008; Publisert: 18 juni 2008
Copyright: © 2008 Edelweiss et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra det russiske stiftelsen for Grunnforskning (nr. 07-02-00649, 07-04-00584, 06-04-49686-en), SNSF (No. IB73AO-110842/1), og programmet » molekylær og cellebiologi «RAS
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
barnase, en ribonuklease fra
Bacillus amyloliquefaciens
, blir syntetisert som en aktiv proenzym, behandlet ved fjerning av den amino-terminale signalpeptid, og skilles ut i det ekstracellulære rom. I denne bakteriearter, barstar, en spesifikk intracellulær inhibitor av barnase, blir produsert. Barstar binder seg tett til barnase og derved hemmer dens intracellulære enzymatiske aktivitet og beskytter vertsceller mot den skadelige virkning av dette RNase. Barnase er et lite (110 aa) enkeltkjedet protein. Den har ingen disulfidbindinger, og krever ikke noen post-translasjonelle modifikasjoner, divalente kationer, eller andre ikke-peptid-komponenter for sin funksjon [1], [2]. På grunn av disse fordelaktige egenskaper, er barnase aktiv i en hvilken som helst celletype, hvor den kommer til uttrykk. Muligheten av barnase å spalte RNA er blitt utnyttet i en rekke bio- anvendelser ettersom innføring av dette enzymet i celler fører til celledød. Spesifikke ablasjon av bestemte celler som er mulig ved å dirigere barnase genekspresjonen ved bruk av celle-spesifikke promotorer [3] – [5]. Alternativt proteiner som er rettet mot barnase til spesifikke celler gi gave til spesifisitet til barnase handling [6] -. [8]
Den giftige effekten av barnase genekspresjon ble brukt til å designe vektorer for positiv utvelgelse av klonede innskudd [9], [10], for å generere mannlige og kvinnelige sterilitet i planter [11], [12], for å gi nematode motstand på avlinger [13], for å produsere potente midler for å drepe den tredje instar larver av bomull bollworm [14], for å studere sykdommer forårsaket av tapet av en spesifikk celletype hos pattedyr, og for å eliminere kreft celler [5]. Disse eksemplene illustrerer klart den effektive og spesifikke eliminering av celler i forskjellige arter ved bruk av barnase genekspresjon; men har lite arbeid vært fokusert på effekten av eksogent tillegg av barnase på ondartede og normale pattedyrceller. Faktisk undersøkelse av barnase nefrotoksisitet er det bare publisert eksempel [15]. Derfor er målet med dette arbeidet var å karakterisere virkningene av ribonuklease barnase på menneskelig kreft og normale celler.
RNases er for tiden under intens etterforskning for sin kreft potensial [16], [17]. Den mest lovende blant dem er menneskelige bukspyttkjertel-type RNases godt tolerert av menneskets immunsystem. Men den cytotoksiske potensialet i mange av dem er redusert ved deres følsomhet overfor inhibering av cytoplasmiske ribonuklease inhibitor (RI) som finnes i alle pattedyrcelle studert [18]. Flere metoder er blitt utforsket for å redusere følsomheten av pankreas-type RNaser til RI [19] – [22]. Bruken av RNaser bunn og er motstandsdyktige mot RI er en annen måte å overvinne denne hindring. Vi undersøkte mottakelighet av barnase til RI og fant at barnase er heldigvis ufølsomme overfor hemming av RI.
Kreftceller er en spesifikk cellepopulasjon, karakterisert ved tilstedeværelse av tumor-spesifikke promotorer og kreftmarkører. En av disse markørene er HER2-antigen (også kalt HER-2, ErbB2, p185HER-2), som blir overuttrykt i et bredt spekter av humane neoplasmer [23], spesielt i ovarier og brystkarsinomer [24], [25]. Vi sammensmeltet to barnase molekyler til enkeltkjede variabel-fragment (scFv) av det humaniserte antistoffet 4D5, som gjenkjenner det ekstracellulære domene av HER2, for å fremstille scFv 4D5-dibarnase [8]. Vi har gjort en immunoRNase (IR), som omfattet to ribonuklease per bærer, ettersom spesifikk cytotoksisitet er begrenset av celleoverflatetetthet av HER2-antigen. Denne konfigurasjonen muliggjorde innføring av det dobbelte av ribonuklease-aktivitet i celler med bare en HER2-reseptoren. Som vist tidligere [26], en to-gangers økning i antall av RNase-molekyler i immunkonjugatet forsterkes det av femten ganger. Hensikten med denne studien var å undersøke hvorvidt scFv 4D5-dibarnase er i stand til å interagere spesifikt med HER2-positive humane ovarie-celler, internaliseres inn i cellene, og utøve cytotoksisitet.
Følgelig, i dette arbeidet beregnet vi fordeler av barnase for å utvikle kreft narkotika og demonstrerte styrken av barnase baserte immunoRNase for kreftcelle ablasjon.
Resultater
Karakterisering av barnase og scFv 4D5-dibarnase
rekombinante proteiner var produsert i
E. coli Hotell og renset som beskrevet i materialer og metoder. De oppnådde proteiner var av den forventede størrelse og homogent i henhold til SDS-PAGE (data ikke vist). Den enzymatiske aktivitet av klare for barnase var 1,8 x 10
6 enheter /mg, som var i samsvar med tidligere publiserte verdier [27]. Den ribonuklease aktivitet av hver barnase enzymet i scFv 4D5-dibarnase fusjonsprotein var 75% av opprinnelig barnase (figur 1A). Den ribonukleaseaktivitet av scFv 4D5-dibarnase ble inhibert med barstar (figur 1B, stiplet linje). Således barnase-del av scFv 4D5-dibarnase beholdt sin funksjonalitet.
(A) ribonuklease aktivitetene av barnase (stiplet linje og diamanter) og scFv 4D5-dibarnase (prikket linje og sirkler) ble bestemt i henhold til metoden av Rushizky et al. [58]. X-aksen representerer konsentrasjonen av barnase alene eller halv-konsentrasjonen av scFv 4D5-dibarnase. Absorbansen på 0,5 AU
260 tilsvarer aktiviteten av 2 nM innfødt barnase som tidligere beskrevet [27]. (B) Følsomhet for barnase til HRI (heltrukket linje og sirkler) og av scFv 4D5-dibarnase å barstar (stiplet linje og trekanter). Dataene er midler ± SD av tre bestemmelser; kurvene er resultatene av sigmoideum regresjon utføres med Sigmaplot programvare.
Etter inntrengning i celler, eksogent tilsatte RNase kan mislykkes i å være aktive på grunn av følsomhet overfor det cytoplasmatiske ribonuklease-inhibitor [18]. Derfor, før testing av cytotoksisiteten til scFv 4D5-dibarnase, undersøkte vi følsomheten av barnase til human ribonuklease inhibitor (HRI). Ved en konsentrasjon på fire ganger større enn den som er nødvendig for å inhibere RNase A med 50% (bestemt i henhold til produsentens instruksjoner), HRI hemmet ikke barnase (figur 1B, heltrukket linje).
Binding av barnase og scFv 4D5-dibarnase til celler
bindingen av barnase og scFv 4D5-dibarnase til HER2-overuttrykk menneskelig ovarialcancer Skov-3 celler [28] og muse-CTLL-2 cytotoksiske T-celler som mangler menneskelig HER2 ble bestemt av fluorescerende mikroskopi. Membranen fluorescens av SKOV-3-celler, men ikke CTLL-2-celler, farget med 20 nM scFv 4D5-dibarnase ble observert (figur 2, B og D). I kontroller, når scFv 4D5-dibarnase eller kanin-anti-barnase-antiserum ble utelatt, ble ingen fluorescens detektert i SKOV-3-celler og CTLL-2-celler (data ikke vist). Tilsetningen av scFv 4D5 4D5 til scFv-dibarnase ført til merk slukking av cellemembranen fluorescens (figur 2, sammenlign B og C), noe som indikerer at scFv 4D5-dibarnase bundet til HER2-reseptoren. Ingen fluorescens ble påvist i enten SKOV-3-celler eller CTLL-2-celler i nærvær av 20 nM barnase (data ikke vist). Ved barnase konsentrasjon på 20 uM, ble et skarpt cytoplasmisk farging av SKOV-3-celler observert (figur 2E), noe som tyder på inntrengning av barnase inn i celler. Egnede kontroller uten enten barnase eller kanin anti-barnase antiserum var negative (data ikke vist).
cellebindende evnen til de rekombinante proteiner påvist ved fluorescens mikroskopi. Celler ble inkubert ved 4 ° C i 1 time med enten 20 nM scFv 4D5-dibarnase (A, B og D), eller en blanding av 20 nM scFv 4D5-dibarnase og 20 nM scFv 4D5 (C), eller 20 uM barnase ( E). -Bundne proteiner ble fjernet, og deretter levende (A-D) eller fast (E) celler ble farget med anti-kanin-antiserum barnase og GAR-TR som beskrevet i Materialer og Metoder. ScFv 4D5-dibarnase bundet til HER2-positiv SKOV-3-celler (A og B), ble den spesifikke binding inhiberes av scFv 4D5 (C). ScFv 4D5-dibarnase ble ikke bundet til HER2-negative CTLL-2-celler (D). Cytoplasmisk farging av SKOV-3-celler med 20 pM barnase ble observert (E). Forstørrelse, 400 ×.
Samspillet mellom scFv 4D5-dibarnase med HER2-overuttrykk menneskelige brystkreft BT-474 celler [25] ble studert av konfokal mikroskopi. BT-474-celler ble inkubert med 20 nM scFv 4D5-dibarnase ved enten 4 ° C for å undertrykke internalisering eller 37 ° C for å la internalisering og farget med kanin anti-barnase antiserum, etterfulgt av fykoerytrin-konjugert geit-anti-kanin-IgG. Fluorescensen ble observert hovedsakelig på overflaten av cellene inkubert ved 4 ° C (figur 3A) og inne i cellene inkubert ved 37 ° C (figur 3B), som indikerer at scFv 4D5-dibarnase binder seg til og penetrerer inn i BT-474-celler. I kontroller, når scFv 4D5-dibarnase eller kanin-anti-barnase-antiserum ble utelatt, ble ingen fluorescens detektert i BT-474-celler (data ikke vist).
(A) Celler ble inkubert med scFv 4D5-dibarnase hos 4 ° C, eller (B) ved 37 ° C. ScFv 4D5-dibarnase ble påvist med kanin-anti-barnase antiserum, etterfulgt av GAR-PE. Fluorescens ble observert hovedsakelig på overflaten av cellene inkubert ved 4 ° C og inne i cellene inkubert ved 37 ° C. Denne forskjellen i lokalisering av fluorescerende markør antyder internalisering av scFv 4D5-dibarnase ved 37 ° C i BT-474-celler.
Internalisering av scFv 4D5-dibarnase undersøkt ved hjelp av elektronmikroskopi
Den intracellulære lokalisering av scFv 4D5-dibarnase ble utforsket ved elektronmikroskopi. ScFv 4D5-dibarnase ble kompleks med gullpartikler (AU). ScFv 4D5-dibarnase-Au-komplekset bundet til SKOV-3-celler (figur 4), men ble ikke bundet eller trenge inn i CTLL-2-celler (data ikke vist) ved 4 ° C og 37 ° C. Ved binding av komplekset til celleoverflaten av SKOV-3-celler, ble gullpartiklene avsettes på fremspring og glatte deler av cellemembraner (figur 4, A-D). Inntrengning av scFv 4D5-dibarnase-Au inn i SKOV-3-celler ble observert ved 37 ° C, men ikke ved 4 ° C, noe som tyder på at gjennomtrengning er en temperaturavhengig prosess. Internalisering av scFv 4D5-dibarnase-Au involvert i dannelsen av belagte groper (figur 4D) som budded fra cellemembranen og omdannes til belagte vesikler (figur 4E). Inne i cellene, ble mesteparten av gullpartiklene ligger i endosomer (figur 4, F og G). Et par gullpartikler ble funnet fritt i cytoplasma i tilknytning til endosomer (figur 4, F og G, pilspisser). Disse observasjonene tyder på at scFv 4D5-dibarnase kan frigjøres fra endosomer inn i cytoplasma. Gullpartiklene også skjedde i muitivesikulære organer (Figur 4H). Cellekjernene ble ikke merket (figur 4F).
SKOV-3-celler ble inkubert med 20 nM scFv 4D5-dibarnase-Au i 1 time ved 4 ° C eller ved 37 ° C. (A og B) ved 4 ° C, ble gull etikett avsatt på den cytoplasmiske membranen (m) og fremspring (asterisker), men ikke inne i cellen. (C-H) ved 37 ° C, scFv 4D5-dibarnase-Au bundet til celleoverflaten på samme måte som ved 4 ° C, men ble også funnet inne i cellene i belagte groper (cp) (D), belagte vesikler ( cv) (E), endosomer (E) (F og G), cytoplasma (c) (F og G, pilspisser), og multivesikulære legemer (MVB) (H). ScFv 4D5-dibarnase-Au ble ikke funnet i kjernen (n) (F). Bar, 200 nm.
Effekt av barnase og scFv 4D5-dibarnase på celle overlevelse
Vi har undersøkt effekten av rekombinant barnase og scFv 4D5-dibarnase på overlevelse av forskjellig menneskelig kreft cellelinjer. Humane perifere mononukleære blodceller (hPBMCs) ble isolert fra det perifere blod fra friske donorer og umiddelbart brukt for å undersøke cytotoksisitet av barnase og scFv 4D5-dibarnase på normale humane celler. Murine CTLL-2 cytotoksiske T-celler som mangler humant HER2 ble også anvendt. Alle cellelinjer og hPBMCs ble inkubert med protein i forskjellige konsentrasjoner i komplett kulturmedium i 72 timer og cellelevedyktigheten ble bedømt i MTT-analysen (tabell 1). De menneskelige brystkreft BT-474 celler viste den høyeste følsomhet for barnase (IC
50 = 0,21 mm), det laveste ble vist av myelocytic leukemi HL-60 celler (IC
50 = 82 mikrometer). For andre kreftcellelinjer, barnase var giftig med IC
50 spenner 2,4 til 13 mikrometer. Den dose-respons kurver ikke nådde platå metning, noe som tyder på ikke-spesifikk interaksjon mellom barnase med celler. De Skov-3 celler viste moderat følsomhet (IC
50 = 5 mm), viser mer generell respons på barnase-indusert cytotoksisitet enn BT-474 celler. Derfor SKOV-3-celler ble anvendt for ytterligere karakterisering av scFv 4D5-dibarnase effekter på HER2-overuttrykkende celler. For hPBMCs, ble den maksimale cytotoksisk effekt (27%) oppnådd ved 110 uM barnase (figur 5A, kort stiplet linje), mens for SKOV-3-celler, 1,2 pM av barnase var tilstrekkelig til å gi den samme virkning. Således barnase toksisitet var to størrelsesordener større for humane kreft SKOV-3-celler enn for hPBMCs.
(A) Virkningen av barnase og scFv 4D5-dibarnase på levedyktigheten av kreft hos mennesker og normale celler. SKOV-3-celler ble behandlet i 72 timer med barnase (lang stiplet linje) eller scFv 4D5-dibarnase (heltrukket linje), og hPBMCs ble behandlet med barnase (kort stiplet linje) eller scFv 4D5-dibarnase (stiplet-prikket linje). (B) Den kompetitiv hemming av scFv 4D5-dibarnase cytotoksisitet av scFv 4D5. SKOV-3-celler ble behandlet i 72 timer med scFv 4D5-dibarnase i fravær (svarte sirkler) eller nærvær (hvite trekanter) på 300 nM scFv 4D5 eller 4D5 med scFv alene (hvite firkanter). (C) Hemming av barnase cytotoksisitet og scFv 4D5-dibarnase cytotoksisitet av barstar. SKOV-3-celler ble behandlet i 72 timer med barnase (hvite sirkler), barnase og ekvimolare mengder av barstar (hvite trekanter), scFv 4D5-dibarnase (svarte sirkler), scFv 4D5-dibarnase med tre-ganger molart overskudd av barstar (svart trekanter), eller barstar alene (sorte firkanter). (D) Effektene av HRI på cytotoksisiteten av scFv 4D5-dibarnase. SKOV-3-celler ble behandlet i 72 timer med enten scFv 4D5-dibarnase i fravær av HRI (svarte sirkler), scFv 4D5-dibarnase i nærvær av HRI (hvite diamanter), eller HRI alene (svarte diamanter). Cellelevedyktighet er uttrykt som prosentandelen av den metabolske aktivitet av behandlede celler i forhold til ubehandlede celler (crosshairs). Hver regresjonskurve i panel A (med 95% konfidensintervaller indikert med stiplede linjer) representerer minst tre uavhengige eksperimenter. Sigmoid regresjon ble utført med Sigmaplot programvare. Curves i B-D representerer typiske eksperimenter. Feilfelt (B-D) ble oppnådd fra triplikate målinger.
Eksponering av HER2-overuttrykkende SKOV-3-celler til scFv 4D5-dibarnase i 72 timer viste en doseavhengig cytotoksisitet fra 0,1 nM til 20 nM (Figur 5A, heltrukket linje). Ytterligere økning i konsentrasjonen forbedret cytotoksisitet svakt, peker på at effekten av scFv 4D5-dibarnase var begrenset av celleoverflatetetthet av HER2-reseptoren. IC
50 av scFv 4D5-dibarnase var 1,8 nM, som var 2800 ganger mindre enn den IC
50 of barnase (figur 5A, sammenlign faste og lange stiplede linjer). BT-474-celler viste scFv 4D5-dibarnase følsomhet sammenlignbar med den til SKOV-3-celler. Som IC
50 og IC
30 av scFv 4D5-dibarnase var 1,3 ganger høyere for BT-474 celler enn for Skov-3 celler, men IC
70 var 1,5 ganger lavere for BT-474 celler enn for SKOV -3-celler (tabell 1). Verdt å merke seg, mens effekten av barnase alene på SKOV-3 og BT-474-celler var forskjellig 25 ganger, scFv 4D5-dibarnase vist lignende effekter på disse HER2-positive celler. På samme tid, ble HER2-negativ hPBMCs ikke påvirkes av scFv 4D5-dibarnase ved konsentrasjoner opp til 2600 nM (figur 5A, stiplet-prikkede linjen). Disse funnene tyder på at effekten av scFv 4D5-dibarnase var bestemt og reseptor-mediert.
For ytterligere å bekrefte at cytotoksisitet av scFv 4D5-dibarnase ble formidlet av samspillet av scFv 4D5 delen med HER2-reseptoren, vi undersøkt effekten av scFv 4D5-dibarnase på SKOV-3-celler i nærvær av scFv 4D5 ved en konsentrasjon på 300 nM. Mens scFv 4D5 i seg selv ikke påvirker SKOV-3-celler (Figur 5B, hvite firkanter) ved konsentrasjoner på 0,1 nM til 2000 nM, den miniantibody redusert cytotoksisiteten til scFv 4D5-dibarnase på en doseavhengig måte (figur 5B, hvite trekanter) . Denne avhengigheten tyder på at scFv 4D5 og scFv 4D5-dibarnase konkurrerer om de samme bindingssetet, og ytterligere bekreftet det spesifikke samspill av scFv 4D5-dibarnase med HER2-reseptoren.
For å finne ut om den enzymatiske aktiviteten til barnase var avgjørende for cytotoksisitet, barstar, en spesifikk inhibitor av barnase, ble anvendt. Barstar alene ikke hemmer levedyktigheten til SKOV-3-celler i konsentrasjoner opp til 2000 nM. (Figur 5C, svarte firkanter). Tilsetning av barstar til barnase i ekvimolare mengder oppheves barnase cytotoksisitet ved et konsentrasjonsområdet 0,4 til 13 uM (figur 5C, hvite trekanter). Da lagt i tre gangers overskudd, barstar redusert den giftige effekten av scFv 4D5-dibarnase ved konsentrasjoner på 0,6 nM til 80 nM (figur 5C, svarte trekanter).
Hemming av scFv 4D5-dibarnase cytotoksisitet av barstar og scFv 4D5 bekreftet at både 4D5 scFv og barnase bidra til cytotoksisitet av scFv 4D5-dibarnase til Skov-3 celler.
for å teste om HRI påvirker effekten av scFv 4D5-dibarnase på kreftceller, HRI og scFv 4D5-dibarnase ble inkubert ved et forhold på 100 enheter HRI til 1 ug scFv 4D5-dibarnase i 30 minutter ved 4 ° C og deretter tilsatt til cellene. HRI alene verken påvirket Skov-tre celleoverlevelse (figur 5D, svarte diamanter) eller scFv 4D5-dibarnase cytotoksisitet (figur 5D, sammenligne svart sirkel og hvite diamanter).
RNA degradering indusert av barnase i Skov-3 cellene
polyakrylamid gel-analyse av total cellulær RNA isolert fra SKOV-3-celler viste at cellulært RNA undergår degradering i celler behandlet med 50 uM barnase (figur 6). Omfattende RNA-degradering var tydelig 24 timer etter eksponering av celler for barnase (kolonne 3); etter 48 timer, degradering av cellulært RNA var nesten fullstendig (felt 4). Begge lav molekylvekt tRNA og rRNA 5.8S, men ikke 5S rRNA, syntes mer utsatt for 24-timers behandling barnase. Det vises av de ytterligere bånd (felt 3, stjerner) indikerer den enzymatiske spaltning av høy molekylvekt rRNA av barnase. Digital bildeanalyse av gelen i figur 6 (spor 2 og 3) viser at den relative overflod av tRNA og rRNA 5.8S ble redusert til 30% og 16% av kontrollceller, henholdsvis, mens nivåene av 5S, 18S og 28S rRNA ble redusert til 60%, 43% og 54% av kontrollceller, henholdsvis.
SKOV-3-celler ble eksponert for 50 uM barnase i 24 timer (kolonne 3) eller 48 timer (kolonne 4). Totalt RNA ble isolert som beskrevet i Materialer og Metoder, og analysert på en 9% polyakrylamidgel inneholdende 7,5 M urea. Hver prøve felt ble ladet med RNA fra 2 x 10
5 behandlede (+) eller ubehandlet (-) celler. Lane 2 tilsvarer mock-behandlet kontroll. Posisjonene for RNA-molekylvektstandarder (kolonne 1) er vist som antall baser til venstre for panelet. Stjernene viser de mest fremtredende band som vises som et resultat av enzymatisk spalting av høy molekylvekt rRNA av barnase (spor 3).
Mekanisme av barnase og scFv 4D5-dibarnase på SKOV-3 celler
å identifisere og karakterisere måte celledød utløst av barnase eller scFv 4D5-dibarnase behandling, Skov-3 celler ble fremstilt som beskrevet i materialer og metoder. Både barnase og scFv 4D5-dibarnase induserte en karakteristisk apoptotisk blebbing av den cellulære membranen som ble observert hos visse celler så tidlig som 6 timer etter behandling og fortsatte å være tydelig for de følgende 72 timer (figur 7).
(A) de mock-behandlede celler ble festet til plate og var flat. (B og C) Celler inkubert med enten 50 uM barnase eller 50 nM scFv 4D5-dibarnase ble avrundet og frittliggende. Membran blebbing (B og C, stjernetegn) og ødelagte celler (B, pilspiss) ble observert. Fasekontrastmikroskopi av et tilfeldig felt ved en forstørrelse på 400 x.
DNA fragmentering i døende celler er en generell sluttpunkt som er felles for begge nekrotiske og apoptotiske mekanismer for celledød. For å avgjøre om barnase og scFv 4D5-dibarnase indusere DNA pauser i Skov-3 celler, ble propidiumjodid (PI) farget celler analysert for endringer i cellesyklus distribusjon ved hjelp av DNA innhold målinger via flowcytometri. Behandling av SKOV-3-celler med enten barnase eller scFv 4D5-dibarnase resulterte i en gradvis økning av den andel av celler i sub-G1 fase (celler som inneholder mindre DNA enn 2N), sammenlignet med ubehandlede kontrollceller (Figur 8A). Barnase-behandlede SKOV-3-celler viste øker med 2,1%, 4,5% og 23,9% i antall celler i sub-G1 fase og avtar i 4,0%, 0,2% og 19,5% i antall celler i G1 fase cellesyklus sammenlignet med kontroller etter 24, 48, og 72 timer med behandling, henholdsvis. Tilsvarende scFv 4D5-dibarnase-behandlede SKOV-3-celler viste øker med 8,5%, 8,1% og 19,7% i antall celler i sub-G1 fase og reduksjoner på 7,5%, 3,0% og 20,6% i antall celler i G1 fase sammenlignet med deres respektive kontroller. I tillegg ble antallet celler i S-fasen ble redusert med 4,9% og 3,1% i barnase-behandlede celler etter 48 og 72 timer henholdsvis, og ved 3,6% i scFv 4D5-dibarnase-behandlede celler etter 48 timer. På den annen side, cellesyklusanalyse viste ingen signifikante forskjeller i celler i G2 /M-fasen av cellesyklusen mellom kontroll og behandlede celler (Figur 8A). Disse resultatene tyder på at både barnase og scFv 4D5-dibarnase indusert DNA-bryter, hovedsakelig G1-celler. I motsetning til serum-sultet SKOV-3-celler, viste en økning i prosentandelen av celler i sub-G1 fase (35,7%), som følger avtar i de tre andre faser [G1 (12,7%), S (9,1%), og G2 /M (13,8%)], sammenlignet med kontrollceller.
(A) Strømningscytometrisk analyse av cellesyklusfordelingen ble utført som beskrevet i Materialer og Metoder. Histogrammer representerer forskjellene i prosenter av celler mellom barnase- eller scFv 4D5-dibarnase-behandlede og ubehandlede celler for hver celle syklus stadium (sub-G1, G1, S og G2 /M) målt etter 24 timer (svarte søyler), 48 h (blå søyler), og 72 timer (grønne søyler) for behandling. Feilsøylene viser standardavviket. Positive kontroller for DNA-fragmentering var Skov-3 celler dyrket i 7 dager i serumfritt medium (oransje søyler). (B) DNA-elektroforese analyse. Celler ble behandlet med enten 50 uM barnase eller 50 nM scFv 4D5-dibarnase. Syttito timer senere, genomisk DNA fra begge behandlet (+) og ubehandlet (-) celler ble isolert og DNA fra et likt antall celler ble løst i ikke-denaturerende 1,5% agarosegeler. DNA ble visualisert ved hjelp av etidiumbromidfarging. Kromatin fragmenter som resulterer fra spalting internucleosomal var til stede i prøver av DNA fra celler behandlet med barnase (kolonne 2) og scFv 4D5-dibarnase (felt 6). DNA fra serum-sultet (SS) celler ble spaltet med uvanlig (spor 7). Kolonnene 3 og 5 representerer ubehandlede kontroller. Felt 1 og 4 er molekylvektmarkører ((M) HyperLadder I, Bioline). (C) Cellene ble utsatt for 50 nM scFv 4D5-dibarnase i 72 timer og deretter farget med acridin oransje, analysert ved fluorescens mikroskopi, og fotografert. En representant tilfelle atom pyknosis og fragmentering (karyorrhexis) vises (innfelt). Forstørrelse, 400 × (1200 ×, innfelt).
For å belyse hvilke apoptotiske eller nekrotiske modus av DNA fragmentering ble utløst av barnase og scFv 4D5-dibarnase, genomisk DNA som ble isolert fra Skov-3 celler behandlet med enten 50 uM barnase eller 50 nM scFv 4D5-dibarnase ble elektroforesebehandlet gjennom en 1,5% agarosegel (figur 8B). Syttito timer etter barnase eller scFv 4D5-dibarnase behandling, SKOV-3-celler viste karakteristiske internucleosomal kromatin spaltning (figur 8B, sporene 2 og 6), som skiller seg fra den uregelmessige DNA-spalting av serum-sultet SKOV-3-celler (figur 8B spor 7). Videre behandling av Skov-3 celler med scFv 4D5-dibarnase indusert et tydelig mønster av kjernefysisk pyknosis og fragmentering (karyorrhexis) som observert av fluorescens mikroskopi etter farging av celler med acridinoransje (figur 8C).
Vi har også brukte Annexin V-FITC-/PI farging for å måle forekomsten av fosfatidylserin, en markør for apoptose, på den ytre paknings av plasmamembranen av SKOV-3-celler (figur 9, A-C). Celler behandlet i 72 timer med enten 50 uM barnase eller 50 nM scFv 4D5-dibarnase ble funnet å være Annexin-V-FITC positive og PI negativ ved en høyere prosentandel (21,7% og 32,7%, henholdsvis) enn i ubehandlede celler (1,5% ). Disse resultatene tyder på at arten av celledød indusert av både barnase og scFv 4D5-dibarnase er apoptotiske. En økning i nekrotiske celler (Annexin-V-FITC positive og PI positiv) var 2,0% for barnase-behandlede celler og 2,6% for scFv-4D5-dibarnase-behandlede celler sammenlignet med kontroller, ti ganger mindre enn den for apoptotiske celler.
(A-C) SKOV-3-celler ble uekte behandlet med (A) eller behandlet med enten 50 uM barnase (B) eller 50 nM scFv 4D5-dibarnase (C) i 72 timer. Celler ble analysert for tidlig apoptose av Annexin V-FITC-/PI farging. Nedre venstre kvadrant av hvert panel viser levedyktige celler, som utelukker PI og er negative for Annexin-V-FITC bindende. De øvre høyre kvadrant inneholde ikke-levedyktige, nekrotiske celler, som er positivt for både Annexin-V-FITC bindende og PI opptak. De nedre høyre kvadrant representerer apoptotiske celler, Annexin-V-FITC positive og PI negative. En representant eksperiment av tre er vist. (D og E) caspase-3-lignende enzymatiske aktiviteter av celler behandlet med enten 50 uM barnase (D, ufylt topp) eller 50 nM scFv 4D5-dibarnase (E, uten fylling topp) i 72 timer ble bestemt ved spalting av det fluorogene substratet PhiPhiLux-G
1 D
2 og sammenlignes med den for ubehandlede celler (fylte topper). M1 og M2 markører tilsvarer nivåer av caspase-3-aktivering i ubehandlede og behandlede celler, henholdsvis.
For å undersøke videre måte celledød indusert av barnase og scFv 4D5-dibarnase, vi målte aktiverings av en apoptose-spesifikk caspase-3 ved proteolytisk spaltning analyse av PhiPhiLux-G
1 D
2-substrat (figur 9, D og E). Caspase-3-lignende aktivitet ble øket med 13,1% for barnase- og på 11,6% for scFv 4D5-dibarnase-behandlede SKOV-3-celler sammenlignet med ubehandlede kontroller.
Som konklusjon, evne til barnase og scFv 4D5 -dibarnase å indusere membran blebbing, utseendet på fosfatidylserin på den ytre vedlegget plasmamembranen, internucleosomal kromatin fragmentering, og aktivering av caspase-3-støtte tanken om at disse proteinene utløse apoptotisk celledød.
Diskusjoner
barnase har blitt anvendt i en rekke studier for fjerning av celler i ulike arter [3] – [5 og 9-14]; Men de cytotoksiske effektene av barnase på kreftceller er ikke tilstrekkelig undersøkt. Her ble rekombinant barnase vist å være giftig for humane carcinom cellelinjer med IC
50 verdier i området fra 0,2 til 13 uM, og for å leukemicellelinjer med IC
50 verdier i området fra 2,4 til 82 um (tabell 1). Sammenlignet med andre RNases [29], er barnase moderat giftig for humane kreftceller. Effekten av barnase på forskjellige kreftcellelinjer varieres 400-fold. Den mest sensitive cellelinjen var BT-474 (IC
50 = 0,21 uM), og den minst følsomme en var HL-60 (IC
50 = 82 uM). Den store spredningen i IC
50 verdier for ulike cellelinjer er også iboende til storfe bryt ribonuklease (BS RNase) og Onconase, en ribonuklease fra
Rana pipiens
. Effektene av BS RNase på kreft cellelinjer variert 570 ganger; og virkninger av Onconase på karsinom og leukemicellelinjer varierte 6000 gangers [30]. Den observerte variasjon i sensitiviteten for cellelinjer for barnase kan være forårsaket av forskjeller i endringer og /eller sammensetning av celleoverflatemolekyler som bestemmer binding av barnase til celleoverflaten. Den måte og at bindingsstyrken påvirke effektiviteten av cellulært opptak av RNase [31] eller internalise vei av RNase.
