Abstract
epidermal vekstfaktor reseptor tyrosin kinase hemmere (EGFR-TKI), inkludert gefitinib, er effektive for ikke-småcellet lungekreft lungekreft (NSCLC) hos pasienter med
EGFR
mutasjoner. Men disse pasientene etter hvert utvikle resistens mot EGFR-TKI. Målet med denne studien var å undersøke involvering av autofagi i gefitinib motstand. Vi utviklet gefitinib-resistente celler (PC-9 /GEF) fra PC-9 celler (som inneholder ekson 19 sletting
EGFR
) etter langvarig eksponering i gefitinib. PC-9 /GEF celler (B4 og E3) var 200 ganger mer motstandsdyktig mot gefitinib enn PC-9 /vekt celler. Sammenlignet med PC-9 /vekt celler, både PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler viste høyere basal LC3-II som ble hemmet av 3-metyladenin (3-MA, en autofagi hemmer) og forsterkes av klorokin ( CQ, en hemmer av autophagolysosomes dannelse), noe som indikerer forhøyet autofagi i PC-9 /GEF celler. 3-MA og CQ konsentrasjonsavhengig hemmet celle overlevelse av både PC-9wt og PC-9 /GEF celler, noe som tyder på at autofagi kan være pro-overlevelse. Videre gefitinib økt LC3-II og autolysosome dannelse i både PC-9 /vekt celler og PC-9 /GEF celler. I PC-9 /vekt celler, CQ forsterket cytotoksisitet av lav gefitinib (3 nM). Videre CQ vant ervervet gefitinib motstand i PC-9 /GEF celler ved å styrke gefitinib-indusert cytotoksisitet, aktivering av caspase 3 og poly (ADP-ribose) polymerase cleavage. Ved hjelp av en
in vivo
modell xenografting med PC-9 /vekt og PC-9 /gefB4 celler, oral administrasjon av gefitinib (50 mg /kg) fullstendig hemmet tumorvekst av PC-9 /vekt, men ikke PC -9 /gefB4cells. Kombinasjon av CQ (75 mg /kg, i.p.) og gefitinib var mer effektiv enn gefitinib alene for å redusere tumorvekst av PC-9 /gefB4. Våre data tyder på at hemming av autofagi kan være en terapeutisk strategi for å overvinne ervervet resistens av gefitinib i
EGFR
mutasjon NSCLC
Citation. Tang MC, Wu MY, Hwang MH, Chang YT, Huang HJ, Lin AM-Y, et al. (2015) Chloroquine Forbedrer Gefitinib Cytotoksisitet i Gefitinib-Resistant Nonsmall Cell lungekreft celler. PLoS ONE 10 (3): e0119135. doi: 10,1371 /journal.pone.0119135
Academic Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Sør-Korea
mottatt: 1 mai 2014; Godkjent: 26 januar 2015; Publisert: 25 mars 2015
Copyright: © 2015 Tang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. NSC 101-2314-B-002 -090 -MY3 av departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Autophagy, kjent som en selv-spising mekanisme, er preget av de novo syntetisere dobbel-membran autophagosomes som beslaglegge cellulære komponenter som overdreven eller unødvendig protein og organeller [1-3]. Fusjon av autophagosomes med lysosomer velig forringer cytosolic innholdet i viktige komponenter for resirkulering. Fysiologisk, er en basal nivå av autofagi viktig for cellulær homeostase. Videre er autofagi velig overtalt til å takle påkjenninger som hypoksi samt nærings deprivasjon og regnes som en overlevelsesstrategi [1-3]. I motsetning til dette er et pro-død rolle autophagy foreslått som en type II programmert celledød gjennom overaktivering av selv-spising [4]. Faktisk ble autofagi indusere funnet å redusere tumorvolum [5-7]. Imidlertid inhibering av autophagy velig indusert kreft celledød [8-10], som tyder på at autophagy spiller en rolle for cytobeskyttende kreftceller. Til støtte for denne oppfatningen, autofagi hemming av 3-metyladenin (3-MA), klorokin (CQ, en lysosomotropic middel for å hemme autophagolysosome dannelse) og autofagi (ATG) -relaterte genet 5 lyddemping ble funnet å forsterke den cytotoksiske effekten av kjemoterapi og target terapi [11-16]. Følgelig blir autofagi et potensielt mål for kreftbehandling.
Drug motstand har vært et fokus av interesse i studiet av kreftbehandling. Flere linjer av bevis har antydet involvering av autophagy i medikamentresistens, både medfødt og ervervet resistens medikamentresistens. For eksempel har CQ vist seg å overvinne primær motstand av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) tyrosinkinase-inhibitorer (TKI) i A549 lungekreftceller [16] og trastuzumab i HER-2 positiv brystkreft [17]. Flere
in vitro
studier har vist at CQ og bafilomycin A1 gjenopprette følsomheten til crizotinib og trastuzumab i kjøpte resistente celler, henholdsvis [18-19]. Videre ble 3-MA funnet å øke den cytotoksiske effekt av cisplatin i cisplatin-resistente celler [20], noe som indikerer at inhibering av autophagy synes å være et terapeutisk mål for ervervet resistens.
Ikke-småcellet lunge lungekreft (NSCLC) er den mest vanlige cancer i verden. Foreløpig epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) tyrosinkinasehemmere (TKI), inkludert gefitinib, erlotinib og afatinib, er svært effektiv i behandling av lungekreft pasienter med spesifikk
EGFR
mutasjoner i sine tumorprøver, for eksempel ekson 19 sletting eller ekson 21 L858R mutasjon [21-23]. Til tross for suksessen med å bruke EGFR-TKI i behandling for østasiatiske NSCLC pasienter, alle pasienter som responderer til slutt utviklet ervervet resistens mot EGFR-TKI [24-27]. I denne studien, involvering av autofagi i det oppkjøpte gefitinib motstanden i
EGFR
mutasjon NSCLC-celler ble undersøkt ved hjelp av PC-9 /vekt celler som bærer
EGFR
ekson 19 sletting og den oppkjøpte gefitinib- resistent PC-9 /GEF celler (PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3).
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
De kjemikalier som ble brukt var gefitinib (en slags gave fra Astrazeneca, Alderley Park, UK), klorokindifosfat (CQ, Sigma, St. Louis, MO, USA), 3-metyladenin (3-MA, Sigma), og Cremophor EL (Sigma). De primære antistoffer inkludert microtubule-assosiert protein en lett kjede 3 (LC3, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA, # 2775), caspase 3 (Cell Signaling Technology, # 9668), og PARP (Cell Signaling Technology, # 9542) , α-tubulin (Cell Signaling Technology, # 2144) og β-actin antistoff (Millipore, Bedford, MA, USA). De sekundære antistoffer var pepperrotperoksidase-konjugert sekundært IgG (Chemicon, Temecula, CA, USA).
Utvikling av gefitinib fast PC-9 celler
PC9 /gefB4 og PC9 /gefE3 cellene ble utviklet i vårt laboratorium og publisert tidligere [26]. PC-9 /vekt-celler, en human lunge adenokarsinom-cellelinje huse en delesjon i exon 19 av
EGFR product: [28], dyrket i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C i RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium inneholdende 10% føtalt bovint serum, 4,5 g /l glukose, og 1% (volum /volum) penicillin /streptomycin. PC-9 /vekt-celler ble dyrket i kultur medier som inneholder økende konsentrasjoner av gefitinib. Etter 6 måneder med passasjer, ble celler som kan vokse i mikromolare konsentrasjoner av gefitinib holdt i stoff-fri media i 2 uker og ble klonet. To kloner (PC-9 /gefB4, og PC-9 /gefE3) ble oppnådd for fremtidige studier.
Veksthemming analysen
De lager løsninger av gefitinib og 3-MA ble utarbeidet i dimetyl sulfoxide mens CQ var i ddsH
2o. Femten hundre celler ble anbrakt i 96-brønners flatbunnede plater og dyrket i 24 timer. For å etablere IC
50 av gefitinib, forskjellige konsentrasjoner av gefitinib ble inkludert i dyrkningsmediet i 96 timer. Ved å bruke sulforhodamin B-analyse [29], ble cellenes levedyktighet bestemt ved å dividere absorbansverdiene for behandlede celler med den i ubehandlede celler. IC
50 beregnet fra konsentrasjon-responskurve ble definert som den konsentrasjon av gefitinib som 50% veksthemning ble oppnådd. For effekten av 3-MA og CQ, ble vekstinhibering målt etter 96 timers inkubering av 3-MA (0,1, 0,3 eller 1 mM) eller CQ (5, 10 eller 15 uM). For effekten av CQ på gefitinib-indusert celledød ble veksthemming bestemt etter 96-h inkubasjon av gefitinib pluss CQ (5 eller 10 mm).
Western blot analyse av proteiner
for å vurdere den medvirkning av autophagy av PC-9 /vekt og gefitinib-resistente celler, ble cellene behandlet med gefitinib pluss 3-MA eller CQ i 24 timer. Behandlede celler ble høstet, vasket med fosfatbuffret saltvann (PBS), og lysert i radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) lysebuffer inneholdende 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% (volum /volum) NP-40, 1% (w /v) natriumdeoksycholat, 1 mM Ethylenediaminetetraacetates (EDTA), 0,1% (w /v) natriumdodecylsulfat polyakrylamid (SDS) og 0,01% (vekt /volum) natriumazid (pH 7,5) i 20 min på is. Lysatene ble deretter sentrifugert ved 12 000 rpm i 10 min, og proteinkonsentrasjonen av supernatanten ble bestemt ved BCA Protein Assay Kit. Proteinprøver (30 ug) ble kjørt på 12 til 13,5% SDS-polyakrylamid-gelelektroforese og deretter overført til en polyvinylidendifluorid (Bio-Rad, USA) ved 90 V i 120 minutter. Blottene ble probet med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Etter primært antistoff inkubasjon, ble membranen vasket og inkubert med et sekundært antistoff (1: 3000) i 1 time ved romtemperatur. Immunoreaksjonen ble visualisert ved å bruke Amersham Enhanced Chemiluminescence (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Etter denne påvisning ble de bundne primære og sekundære antistoffer strippet ved inkubering av membranen i strippebuffer (100 mM 2-merkaptoetanol, 2% SDS) ved 50 ° C i 45 minutter. Membranen ble reprobed med en primær antistoff mot β-actin (1: 5000) /α-tubulin (1: 5000).
Fluorescent og Immunofluorescent flekker analysen
Autolysosomes flekker: Cellene ble behandlet med gefitinib i 24 timer og deretter ble mediet erstattet med friskt medium inneholdende 50 nM Lysotracker Rød (LysoTR, LysoTracker Red DND-99, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Etterpå ble cellene renset i PBS og fiksert med 3,5% paraformaldehyd (i PBS) i 10 minutter, permeabilisert med 0,5% Triton X-100 i TBS i 30 minutter, og behandlet med 2% BSA i TBS i 1 time ved romtemperatur . Prøvene ble deretter inkubert med LC3 antistoff (1: 200) over natten ved 4 ° C, skylles tre ganger med 0,01% Triton X-100 i TBS og inkubert i 30 minutter med et sekundært antistoff (FITC-konjugert kanin-IgG på 1: 250 ) ved 37 ° C. Etterpå ble cellene videre farget med DAPI og observert under en konfokalmikroskopi (Olympus FV1000, Olympus America Inc., Center Valley, PA, USA).
Xenotransplantat musemodell
Sixty- tre 6 -week gammel hann Balb /c nakne mus, som veide 25-30 g, ble anvendt. Dyret protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Taipei Veterans General Hospital, Taipei, Taiwan. (Permit Number: 2011-037) .Tumors ble indusert ved å injisere PC-9 /vekt og PC-9 /gefB4 celler (10
7 celler i 100 mL PBS) subkutant i ryggen av mus. For å oppnå den tumorvekstkurven, ble daglig måling av tumor utført. Vinkelrett diameter med en digital caliper og volumene ble beregnet ved (lengde x bredde
2) /2. Når tumorene vokste til 200 mm
3, ble mus randomisert til 4 grupper behandlet oralt med bærer (10% Cremophor EL /10% etanol /4% dekstrose i DDH
2o), gefitinib alene (50 mg /kg, av en sonde), CQ alene (75 mg /kg, ip) og gefitinib pluss CQ. Gefitinib ble fremstilt i 10% Cremophor EL /10% etanol /4% dekstrose og CQ ble oppløst i PBS.
statistikker og
Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. Statistiske sammenligninger av celle levedyktighet ble gjort ved hjelp av uavhengige-Samples T Test av SPSS. P-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Forhøyet basal autofagi i PC-9 /GEF celler
Å studere autofagi og narkotika motstand, nivået på LC3-II, et kjennetegn protein av autofagi, ble målt i PC-9 /vekt, PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler. Western blot analyse viste høyere basale nivåer av LC3-II i PC-9 /GEF celler (B4 og E3) mens sammenlignet med PC-9 /vekt celler (Fig. 1a). I samsvar med den Western blot analysen, det farging studien viste mer LC3 immunfluorescens puncta i PC-9 /gefB4 celler sammenlignet med PC-9 /vekt-celler (Fig. 1B). Videre ble 3-MA og CQ ansatt for å karakterisere autofagi. Vi fant at tre-MA redusert (Fig. 1C) mens CQ økt basal LC3-II i PC-9 /vekt, PC-9 /gefB4 celler og PC-9 /gefE3 etter 24-h medikamentelle behandlinger (Fig. 1D ). Disse data indikerer at PC-9 /gef (B4 og E3-celler) har en høyere basalnivå autophagy enn PC-9 /vekt celler. Videre ble den celleoverlevelse analysen anvendes for å avgrense den rolle autophagy anvendelse av 3-MA og CQ. SRB-analysen viste at 3-MA og CQ konsentrasjonsavhengig redusert celleoverlevelse i PC-9 /vekt, PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler (Fig. 2), hvilket antyder at autophagy spiller en pro-overlevelse rolle celleproliferasjon.
(A) Representative Western blot data viste basal LC3-II i PC-9 /vekt og PC-9 /GEF celler (B4 og E3). (B) immunofluorescerende flekker studier ble utført ved anvendelse av LC3 antistoff for å vise LC3 puncta i PC-9 /vekt og PC-9 /gefB4 celler. (C og D): PC-9 /vekt, PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3-celler ble behandlet med 3-metyladenin (3-MA, 10 mM) og klorokin (CQ, 1 og 10 uM) i 24 h. Totalt protein av behandlede celler ble høstet; LC3-I og II-nivåene ble analysert med Western blot-analyse. Hver kolonne inneholdt 30 pg protein for alle forsøk. Resultatene ble gjentatt i uavhengige eksperimenter.
PC-9 /vekt, PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler ble behandlet med (A) 3-MA (0,1-1 mm) og (B) CQ (5-15 mm) i 96 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av SRB-analysen. Verdier er gjennomsnitt ± S.E.M. (N = 3). *
P
0,05 statistisk signifikante i 3-MA eller CQ-behandlede grupper sammenlignet med kontrollene.
Gefitinib-indusert autofagi
in vitro
Involvering av autofagi i gefitinib-indusert cytotoksisitet ble undersøkt. Western blot analyse viste at gefitinib konsentrasjonsavhengig økt LC3-II i PC-9 /vekt, PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler (fig. 3A). Immunofluorescent flekker studier viste at 24-h inkubasjon av gefitinib (1 um) forhøyet LC3 puncta i både PC-9 /vekt og PC-9 /gefB4 celler (fig. 3B). Videre ble samlokalisering av LC3 immunfluorescens og LysoTR fluorescens observert i gefitinib-behandlet PC-9 /WT og PC-9 /gefB4 celler (fig. 3B), noe som indikerer at gefitinib er i stand til å indusere autofagi og autolysosome formasjon.
(A) PC-9 /vekt, PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3-celler ble behandlet med gefitinib (nM) i forskjellige konsentrasjoner i 24 timer. Totalt protein av behandlede celler ble høstet; LC3-I og II-nivåene ble analysert med Western blot-analyse. Hver kolonne inneholdt 30 pg protein for alle forsøk. Resultatene ble gjentatt i uavhengige forsøk. (B) PC-9 /vekt og PC-9 /gefB4-celler ble behandlet med gefitinib (1 uM) i 24 timer. Immunofluorescent farging og fluorescerende fargestudier ble gjennomført med LC3 antistoff og LysoTracker rød (LysoTR) henholdsvis for å vise puncta i cellene. Green, FITC-merket LC3; rød, LysoTR; blå, DAPI-merkede kjernen.
På grunn av den gefitinib-forhøyet autophagy, effekten av CQ på gefitinib-indusert cytotoksisitet ble undersøkt. Tjuefire timer etter medikamentell behandling, CQ ytterligere økt gefitinib-indusert LC3-II i PC-9 /vekt og PC-9 /gefB4 celler (fig. 4A). Cell overlevelse studier viste at gefitinib (100 nM) alene indusert dyp celledød av PC-9 /vekt celler; Men CQ (5 og 10 mikrometer) var ikke i stand til å ytterligere styrke gefitinib-indusert cytotoksisitet (Fig. 4B). Når det gjelder PC-9 /gefB4 celler, gefitinib (100 nM) alene induserte en svak celledød; CQ betydelig forsterket gefitinib-indusert cytotoksisitet (fig. 4C), dvs. CQ vant gefitinib motstand i PC-9 /gefB4 celler. For ytterligere å teste potensering av CQ i PC-9 /vekt celler, lav dose av gefitinib (3 nM) ble ansatt. Mens 96-h inkubasjon av gefitinib (3 nM) induserte en ubetydelig cytotoksisitet i PC-9 /vekt celler, co-inkubasjon med CK (10 nM) og gefitinib dypt redusert celleoverlevelse (fig. 4D). CQ-indusert potensering av gefitinib-indusert cytotoksisitet ble videre undersøkt ved å måle apoptose relaterte proteiner, inkludert caspase-3 og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) nivåer. Vi fant ut at gefitinib (0,1 mm) indusert apoptose ved å vise caspase 3-aktivering og PARP spalting i PC-9 /vekt celler; CQ (10 mm) konsekvent ikke øke gefitinib-indusert apoptose i PC-9 /vekt-celler (fig. 5). I kontrast, når gefitinib eller CQ alene var ikke i stand til å indusere apoptose i PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler, CQ pluss gefitinib betydelig indusert caspase 3-aktivering og PARP spalting i både PC-9 /GEF celler (Fig. 5 ).
(A) PC-9 /vekt og PC-9 /gefB4 ble behandlet med gefitinib (100 nM) og klorokin (CK, 5, 10 mm) i 24 timer. Totalt protein av behandlede celler ble høstet. LC3-II ble analysert med Western blot analyse. Hver kolonne inneholdt 30 pg protein for alle forsøk. Resultatene ble gjentatt i uavhengige forsøk. (B) PC-9 /vekt og (C) PC-9 /gefB4-celler ble dyrket med gefitinib (100 nM) og CQ (5, 10 pM) i 96 timer. (D) PC-9 /WT-celler ble dyrket med gefitinib (3 nM) og CQ (5, 10 pM) i 96 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av SRB-analysen. Verdier er gjennomsnitt ± S.E.M. (N = 3). *
P
0,05 statistisk signifikant i gefitinib eller CQ-behandlede grupper sammenlignet med kontrollene; # P 0,05 statistisk signifikant i gefitinib pluss CQ-behandlede grupper sammenlignet med gefitinib bare grupper.
PC-9 /vekt, PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler ble behandlet med gefitinib (100 nM ) og klorokin (CQ, 10 pM) i 24 timer. Totalt protein av behandlede celler ble høstet. Procaspase 3, aktiv caspase 3, PARP cleavage nivåer ble analysert med Western blot analyse. Hver kolonne inneholdt 30 pg protein for alle forsøk. Resultatene ble gjentatt i uavhengige eksperimenter.
Gefitinib pluss CQ forsterkes gefitinib-indusert anti-tumor aktivitet i PC-9 /gefB4 xenografter
CQ-indusert forsterkning av den anti-tumor aktivitet av gefitinib ble videre undersøkt ved hjelp av Balb /c nakne mus med PC-9 /vekt og PC-9 /gefB4 menneskelige tumorxenotransplantater (fig. 6). CQ alene ikke endre tumorvekst av PC-9 /vekt og PC-9 /gefB4 menneskelige tumorxenotransplantater (Fig. 6). Sammenlignet med kjøretøy-behandlede tumorvekst, gefitinib monoterapi vesentlig hemmet tumorvekst av PC-9 /vekt xenografter; Samtidig administrering av CQ var ute av stand til å utfylle den anti-tumor effekt av gefitinib i PC-9 /vekt xenografter (Fig. 6A). Den fullstendige inhibering av tumorvekst av PC-9 /wt xenografter varte til slutten av eksperimentet (fig. 6A). I motsetning til dette, gefitinib ubetydelig redusert tumorvekst av PC-9 /gefB4 xenotransplantater sammenlignet med den til PC-9-xenotransplantater (figur 6B;. P = 0,07). PC-9 /gefB4 svulster gjen vokste etter 15 dager med gefitinib administrasjon (Fig. 6B). Overraskende, CQ pluss gefitinib undertrykte betydelig tumorvekst av PC-9 /gefB4 xenografter sammenlignet med gefitinib bare (figur 6B, p. 0,05)
Balb /c nakne mus med PC-9 /vekt (A. ) og PC-9 /gefB4 (B) xenografter ble behandlet med biler som kontroll (○, n = 4 for PC-9 /vekt og PC-9 /gefB4, henholdsvis), gefitinib (50 mg /kg /dag av en sonde , ◆; n = 5 til PC-9 /vekt og PC-9 /gefB4, henholdsvis), klorokin (CQ, 75 mg /kg, ip ▲; n = 4 til PC-9 /vekt og PC-9 /gefB4, henholdsvis), eller en kombinasjon av begge (■; n = 5 til PC-9 /vekt og PC-9 /gefB4, henholdsvis) .Tumors fikk vokse til 200 mm
3 før medikamentbehandlinger. Verdier er gjennomsnitt ± S.E.M. (N = 4-5). ** P 0,001, statistisk signifikant i gefitinib og gefitinib pluss CQ grupper i forhold til kjøretøygruppe i PC-9 /vekt tumorxenotransplantater. * P 0,05, statistisk signifikant i gefitinib pluss CQ-gruppen sammenlignet med kjøretøyet gruppe; # P 0,05 statistisk signifikant i gefitinib pluss CQ-gruppen sammenlignet med gefitinib alene PC-9 /gefB4 tumorxenotransplantater av uavhengige-Samples T Test. (C) Representative data viser 4 mus med PC-9 /vekt xenograft og 4 mus med PC-9 /gefB4 xenografter som ble behandlet med kjøretøy, CQ bare, gefitinib bare og gefitinib pluss CQ.
diskusjon
Autophagy og narkotika motstand
å utvikle terapeutiske strategier for ervervet resistens indusert av gefitinib, brukte vi PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler som har IC
50 av gefitinib ca 200 ganger mer enn for PC-9 /vekt celler [26]. Western blot analyse og immunfluorescens studien viste høyere basale nivåer av autofagi i både PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler. Anvendelse av 3-MA og CQ å svekke dannelse og funksjon av autophagy, er mekanismen for den forhøyede basal autophagy i gefitinib-resistente celler foreslått. For å takle uheldige påkjenninger, dvs. konstant eksponering for gefitinib, kreftceller økt autofagi å opprettholde metabolsk homeostase og passende cellevekst [4]. Celleviabilitet analysen viste at autofagi var pro-overlevelse fordi 3-MA og CQ redusert celle overlevelse av PC-9 /vekt og PC-9 /GEF celler (B4 og E3). I tillegg til gefitinib motstand, har tidligere studier har rapportert at trastuzumab-ildfaste brystcancerceller og cisplatin-resistente lungekreftceller har høyere autofagi sammenlignet med de sensitive kreft celler [19-20]. På samme måte ble 3-MA og bafilomycin A1 (en inhibitor av autolysosome modning) funnet å redusere cellenes levedyktighet av disse resistente celler [19-20]. I motsetning til den 200-ganger forskjell i IC
50 av gefitinib [26], 3-MA og CQ-indusert celledød i en tilsvarende grad i PC-9 og PC-9 /GEF-celler, noe som viser PC-9 /gefB4 cellene ikke var resistente mot tre-MA og CQ-indusert cytotoksisitet.
rolle autofagi i gefitinib-indusert cytotoksisitet
Ulike terapier inkludert strålebehandling [20], chemotherapies [30] og målrette behandlings [16, 31] har blitt rapportert å indusere autofagi. Vår studie bekrefter denne oppfatningen at gefitinib økt autofagi i en konsentrasjonsavhengig måte i PC-9 /vekt og PC-9 /GEF celler (B4 og E3). Rollen til autofagi i gefitinib-indusert cytotoksisitet ble ytterligere avgrenset ved kombinasjon av CQ og gefitinib. Konsekvent til vår tidligere studie [26], gefitinib (100 nM) alene indusert merket cytotoksisitet i PC-9 /vekt celler. Den cytotoksiske mekanisme gefitinib er kjent for å konkurrere ATP-bindingssetet i PC-9 /vekt celler som bærer
EGFR
ekson 19 sletting [32] og dermed indusere cytotoksisitet gjennom apoptose [26, 33-35]. Potensieringen av CQ pluss gefitinib i PC-9 /WT-celler ble observert bare når gefitinib ble redusert til 3 nM, noe som indikerer at CQ kan anvendes for å forsterke gefitinib-indusert apoptose i PC-9 /wt-celler. En klinisk studie av gefitinib og hydroksyklorokin gjennomgår på avansert NSCL pasienter pasienter [36], våre data tyder på at ved samtidig administrasjon med CK og dets analoger, lavere doser av gefitinib kan være nok for pasienter med gefitinib sensitiv lungekreft med mindre side effekter [37].
Autophagy og ervervet resistens
Sammenlignet med PC-9 /vekt-celler, en 200-fold forskjell i IC
50 av gefitinib ble identifisert i PC-9 /gefB4 celler [26]. Vår tidligere studie fant at MEK-hemmere (AZD6244 og CI1040) dypt reverseres de oppkjøpte motstander til gefitinib i PC-9 /gefB4 celler [26]. Konsekvent, gefitinib (100 nM) alene var ikke i stand til å indusere betydelig cytotoksisitet i PC-9 /gefB4 (fig. 4C), PC-9 /gefE3 og PC-9 /gefE7 [26]. Men denne studien viste at gefitinib pluss CQ betydelig indusert caspase 3-aktivering og PARP spalting i både PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler, noe som indikerer at CQ sensibilisert PC-9 /GEF celler (B4 og E3) til gefitinib . Sammenlignet med 200 ganger forskjell i IC
50 av gefitinib, gefitinib viste ikke signifikante forskjeller i LC3-II høyde og celledød i PC-9 /vekt celler, PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler indikerer autofagi kan ikke være ansvarlig i den oppkjøpte gefitinib motstand. Likevel, våre
in vitro
data viste at CQ svekket overlevelse av PC-9 /gefB4 celler, noe som indikerer at gefitinib og CQ kan være effektive for å overvinne gefitinib motstand. I tillegg har flere
in vitro
studier har rapportert at autofagi hemming synes å forsterke cytotoksisiteten i crizotinib-resistente celler [18], trastuzumab-resistente celler [19] og cisplatin-resistente celler [20]. Så langt er begrenset
in vivo
studier har fokusert på den terapeutiske virkning av CQ på ervervet resistens [18]. Våre funn fra
in vivo
xenograft modell støtte
in vitro
data i at gefitinib konsekvent hemmet PC-9 /vekt tumorvekst og CQ ikke styrke anti-kreft effekt av gefitinib. Som til tumorvekst av PC-9 /gefB4 xenografter, CQ pluss gefitinib betydelig forsinket tumorvekst av PC-9 /gefB4 xenografter sammenlignet med gefitinib monoterapi, noe som indikerer at CQ er i stand til allergi PC-9 /gefB4 celler til gefitinib og da reduserer tumorvekst av PC-9 /gefB4 menneskelige xenografter.
i konklusjonen, EGFR-TKI, slik som gefitinib, er kjent for å behandle lungekreft med betydelige efficacies. Vår tidligere studie benyttet kombinasjon av gefitinib og ERK-hemmere og demonstrert betydelige terapeutiske potensialer for ervervet resistens mot gefitinib [26]. I denne studien, viste vi at autofagi kan spille en cytoprotective rolle i tumordannelse og ervervet resistens. Videre synes CQ å være terapeutisk nyttig for både gefitinib-følsom og motstandsdyktig NSCLC, noe som tyder på at CK og dets analoger kan være et lovende kreftterapi [38-39] for lungekreftpasienter med
EGFR
mutasjon som utvikler en ervervet motstand etter å ha mottatt gefitinib behandling.
