Abstract
mTOR (mammalian target of rapamycin) signaltransduksjonsbane integrerer ulike signaler, som regulerer ribosom biogenese og proteinsyntese som en funksjon av tilgjengelig energi og aminosyrer, og sikre en passende kobling av cellulær proliferasjon med økning i cellestørrelse. I tillegg har de siste bevis peker til et samspill mellom mTOR og p53 veier. Vi har undersøkt den genetiske variabilitet av 67 nøkkelgener i mTOR-reaksjonsveien, og i gener av p53 sti som samhandler med mTOR. Vi testet foreningen av 1,084 tagging SNPs med prostatakreft risiko i en studie av 815 prostatakreft tilfeller og 1.266 kontroller nestet i den europeiske Prospective Investigation inn Cancer and Nutrition (EPIC). Vi valgte SNPs (n = 11) med den sterkeste tilknytning til risiko (p 0,01) og forsøkte å kopiere deres forening i en ekstra serie av 838 prostatakreft tilfeller og 943 kontroller fra EPIC. I felles analyse av første og andre fase to SNPs av
PRKCI
genet viste en sammenheng med risikoen for prostatakreft (OR
allel = 0,85, 95% KI 0,78 til 0,94, p = 1,3 × 10
-3 for rs546950 og OR
allel = 0,84, 95% KI 0,76 til 0,93, p = 5,6 × 10
-4 for rs4955720). Vi har bekreftet dette i en meta-analyse ved hjelp som replikering sette data fra den andre fasen av vår studie i fellesskap med den første fasen av kreft genetiske markører av følsomhet (CGEMS) prosjekt. I konklusjonen, fant vi en sammenheng med prostatakreft risiko for to SNPs tilhørighet til
PRKCI
, et gen som ofte overuttrykt i ulike svulster, inkludert prostatakreft
Citation. Campa D, Hüsing A, Stein A, Dostal L, Boeing H, Pischon T, et al. (2011) Genetisk variasjon av mTOR Pathway og prostatakreft risiko i det europeiske Prospective Investigation på Cancer (EPIC). PLoS ONE 6 (2): e16914. doi: 10,1371 /journal.pone.0016914
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 6 oktober 2010; Godkjent: 01.01.2011; Publisert: 23 februar 2011
Copyright: © 2011 Campa et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Konkrete resultater av denne studien ble oppnådd med økonomisk støtte fra US Army Medical Research and Material Command (W81XWH-05-1-0156). https://cdmrp.army.mil/pcrp/default.shtml. EPIC studien ble finansiert av «Europa mot kreft» Program for Europakommisjonen (SANCO); Ligue contre le Cancer (Frankrike); Société 3M (Frankrike); Mutuelle Générale de l’Education Nationale; Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE (INSERM); Tyske Kreft Aid; Tysk Cancer Research Center, German Federal Kunnskapsdepartementet; Danske Kreftforeningen; Health Research Fund (FIS) i den spanske helsedepartementet; de deltakende regionale myndigheter og institusjoner i Spania; Cancer Research UK; Medical Research Council, UK; Hellenic Helse- og sosial solidaritet; den Stavros Niarchos Foundation og den hellenske Health Foundation; Italiensk Association for kreftforskning; Italiensk National Research Council; Dutch Ministry of Public Health, velferd og Sport (VWS), nederlandsk Helsedepartementet, Nederland Kreftregisteret (NKR), LK forskningsmidler, nederlandske Prevention Funds, nederlandsk ZON (Zorg Onderzoek Nederland), World Cancer Research Fund (WCRF) (The Nederland); Statistikk Nederland; Svenske Kreftforeningen; Svenske Scientific Council; Regional Government of Skåne, Sverige; Norske Kreftforening. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i prostatavevet, blir tumorfremmende virkninger av endogene hormoner og vekstfaktorer antatt å være assosiert med stimulering av cellevekst og mitose, og inhibering av apoptose. I tillegg til signalering av IGF-I (men også insulin, og andre vekstfaktorer), veksten og proliferasjonen av celler som er ko-bestemt ved energimengder og essensielle aminosyrer som er tilgjengelig for celle [1], [2],.
Nylige studier har vist at mTOR (mammalian target rapamycin) signaltransduksjonsbane integrerer disse forskjellige signaler, som regulerer ribosom biogenese og proteinsyntese som en funksjon av tilgjengelig energi og aminosyrer, og sikre en passende kopling av cellulær spredning med økninger i cellestørrelsen [1], [2]. Den mTOR veien er regulert gjennom en kaskade av enzymatiske fosforyleringsreaksjoner gjennom fosfatidyl-inositol-trifosfat kinase (PI3K) /protein kinase B (PKB-akt1), atypisk protein kinase C (aPKC), AMP-aktivert protein kinase (AMPK), hamartin /tuberin (kodet henholdsvis ved tuberøs sklerosekompleks-en (
TSC1
) og 2 (
TSC2
) gener), ras-homolog anriket i hjernen (rheb), regulatoriske assosiert protein med mTOR (raptor), og mammalian target of rapamycin (mTOR). mTOR-aktivering i sin tur fører til fosforylering av nedstrøms elementer som direkte styrer ribosom biogenese og ribosomale mRNA oversettelse for proteinsyntese [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]. Supplerende figur S1 viser en forenklet ordning av mTOR veien
Denne veien har flere etablerte proto-onkogener (
PI3K, akt1
) og tumorsuppressorgener (
PTEN
. – som reduserer mTOR aktivitet gjennom hemming av
PI3K /akt1 – TSC1, TSC2
). Disse gener er ofte mutert eller avvikende uttrykt i humane kreftformer, inkludert prostata-tumorer [9], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23].
i tillegg har nyere bevis peker til et interessant samspill mellom mTOR og p53 trasé (gjennomgått av Levine et al., 2006) [24]. Det er to viktige forbindelser mellom disse banene, som fører til endrede respons på stress signaler etter aktivering av p53, ved aktivering av AMPK, TSC2 og en p53 fosfatase, sammensatt av en alfa-4-subenhet og PP2A katalytiske subenheten.
Vi antok at gener i mTOR sti og gener av p53 vei som er direkte relatert til mTOR kan være sentralt innblandet i prostata kreftutvikling, og at polymorfe alleler i disse genene kan endre sitt uttrykk eller aktivitet, og dermed overdragelse endret prostatakreft mottakelighet. SNPs i gener som tilhører mTOR vei har allerede blitt studert i forhold til kreftrisiko, med noen lovende resultater [25], [26], [27].
I denne rapporten har vi undersøkt den genetiske variasjonen av 67 nøkkelgener i de ovenfor nevnte veier. Vi testet foreningen av 1,084 tagging SNPs med prostatakreft risiko i en case-control studie nestet innenfor det europeiske Prospective Investigation inn Cancer and Nutrition (EPIC). Så vidt vi vet er dette den første rapporten om polymorfismer av disse genene og prostata kreftrisiko.
Resultater
Sammendrag kjennetegn ved studiepopulasjoner er vist i tabell 1. I den første fasen av denne studien vi analyserte 1,084 SNPs i 67 gener som er involvert i mTOR veien (som oppsummert i supplerende tabell S1) i 815 prostatakreft tilfeller og 1.266 matchet kontroller. Vi replikert de beste hits i en uavhengig befolkning bestående av 838 prostatakreft tilfeller og 943 matchede kontroller.
Genotyping suksess priser og kvalitetskontroll
Vi hadde 1,163 SNPs på vår Golden array, hvorav 30 ble inkludert som kvalitetskontroller og 1133 var i kandidat genet regioner av interesse i denne studien. Tretti-fire SNPs ble droppet fordi de hadde en takst lavere enn 75%, som vanligvis er et tegn på dårlig genotyping kvalitet. Eleven SNPs (1% av totalen) viste sterk avgang fra Hardy-Weinberg likevekt (p 10
-5) og ble dermed ikke analysert videre. Fire SNPs var monomorfe i denne populasjonen. Dette gjorde til sammen 1,084 SNPs (96% av de som velges i utgangspunktet) i de 67 kandidatgener som skal analyseres
Den gjennomsnittlige takst av 1,084 SNPs brukes for statistisk analyse var 99,8% (fra 85,2%. – 100%).
Tredve SNP ble inkludert, som tidligere hadde blitt genotypet på de samme prøvene i sammenheng med en annen studie. Den konkordans av de nye genotyper med de gamle genotypene var 100%.
Vi i utgangspunktet tatt 2.099 prøver, og etter å ha fjernet fag prøver med en takst lavere enn 75% (n = 39), hadde vi et datasett inkludert 815 prostatakreft tilfeller og 1,239 kontroller. Forekomsten tetthet prøvetaking Den førte til duplisere utvalg av 27 kontroller slik at 1.266 kontroller ble inkludert i den betingede analysene.
Tilfeldig duplikatprøvene (~ 5%) ble også inkludert og samsvars av deres genotyper var 100,0%.
viktigste effektene av genotypet SNPs
Eleven SNPs var signifikant assosiert med prostatakreft risiko, ved en terskel på p 0,01 (p
trend 0,01 eller p
2DF 0,01) ( rs520820 i
GADD45A
; rs546950 og rs4955720 i
PRKCI
; rs706711, rs13156223 og rs831123 i
PIK3R1
; rs6797860 i
TP63
, rs11763144 i
PRKAG2
; rs388372 i
RPS6KA2
; rs13337626 i
TSC2
; rs3783501 i
GADD45B
). Vedleggstabell S2 viser detaljerte resultater for alle 1,084 SNPs.
Replication
Vi genotypede de elleve SNPs fra første fase i et ekstra sett med 838 prostatakreft tilfeller og 943 matchede kontroller. I den andre fasen SNP rs546950 i
PRKCI
genet viste en statistisk signifikant sammenheng med prostata kreftrisiko ved den konvensjonelle terskelen til p. 0,05 (p
2DF = 0,02)
når vi analyserte fellesskap resultatene fra de to prøvesettene, både
PRKCI
SNPs viste en sammenheng med risiko (OR
allel = 0,84, 95% CI = 0,76 til 0,93, p
2DF = 0,0028 , p
trend = 0,0007 for rs4955720 ELLER
allel = 0,86, 95% CI = 0,78 til 0,95, p
2DF = 0,0014, p
trend = 0,0020 for rs546950). Resultater for første fase, replikering sett og for felles analyse er vist i tabell 2.
Vi beregnet M
eff verdier for hver kandidat gen separat og for hele studien (ved å legge den enkelte genet M
eff verdier, detaljene er vist i tabell supplerende S3). Den veien bred M
eff var 849. Vi har derfor brukt en studie omfattende betydning p-terskel på 0,05 /849 = 5,9 × 10
-5. Ved hjelp av denne grensen, ingen signifikante assosiasjoner (p
trend 5.9.x10
-5 eller p
2DF 5,9 × 10
-5) ble observert mellom noen av polymorfismer genotypede og generell prostatakreft risiko.
de to SNPs i
PRKCI
ble også genotypede i sammenheng med kreft genetiske markører av følsomhet (CGEMS) prosjekt (https://cgems.cancer.gov/), én av de første genom-wide association studier på prostatakreft mottakelighet. Foreningene observert i den første fasen av CGEMS (OR
allel = 0,85 p
trend = 0,0024 for rs4955720, OR
allel = 0,94 p
trend = 0,089 for rs546950) var lik de som ble observert i denne rapporten. I en meta-analyse ved bruk av ubetinget OR-estimatet fra dataene i den andre fasen av vår studie i samarbeid med resultater fra CGEMS, de to SNPs viste svært like resultater som de som oppnås med den episke data alene (eller
allel = 0.91 , 95% KI 0,83 til 0,99, p = 0,029 for rs546950 og OR
allel = 0,87, 95% KI 0,79 til 0,95, p = 0,002 for rs4955720). En meta-analyse utført med tanke på de felles data for den første og andre fase av vår undersøkelse med resultatene fra CGEMS viste vesentlig de samme resultater (OR
allele = 0,91, 95% CI 0,84 til 0,98, p = 0,019 for rs546950 og OR
allel = 0,85, 95% KI 0,78 til 0,92, p = 0,00016 for rs4955720).
Effekter av genotypet SNPs i undergrupper av sykdommen aggressivitet
Vi analyserte sammenslutninger av SNPs med prostatakreft risikoen ved å gruppere sakene etter sykdom aggressivitet, men vi gjorde ikke observere statistisk signifikant (p 0,05) heterogenitet mellom lagene. Resultater for de elleve SNPs som ble genotypet på hele datasettet er vist i supplerende tabell S4
Diskusjoner
mTOR veien er involvert i tumorutvikling, og analoger av rapamycin -. Et naturlig antibiotikum som spesifikt forstyrrer mTOR handling (via en ytterligere reseptor-protein) – viser store løftet som potensielle terapeutiske midler for behandling av visse typer av faste tumorer [28], [29], [30]. Vi antok at gener som hører til mTOR veien kan være sentralt involvert i kreftutvikling, inkludert prostatakreft, og at polymorfe alleler av disse genene kan påvirke prostata kreftrisiko.
I denne studien har vi grundig fanget felles genetisk variasjon over 67 gener i mTOR sti og til vår kunnskap, er dette den mest omfattende evaluering av felles og koding variasjon i mTOR sti gener i forhold til prostatakreft risiko. Vi fant en sammenslutning av to SNPs i
PRKCI
genet, rs546950 og rs4955720, med en redusert risiko for prostatakreft. Den første SNP viste en forening ved første screening, i en replikering sett og i en meta-analyse av våre andre fase med data fra CGEMS, mens rs4955720 viste en forening bare i screening settet og i meta-analysen. Siden de to SNP ble valgt som merke SNP’er de ikke er i sterk LD, men vi kan ikke utelukke at de kan gjenspeile det samme signal som følge av en moderat underliggende LD (R «> 2 mellom de to SNP’er er 0,53).
En rolle av genetisk variasjon i
PRKCI
genet i prostatakreft etiologi er sannsynlig gitt at atypisk protein kinase C lambda /tøddel (aPKCλ /ι), kodet av
PRKCI
genet , er en proteinkinase C isozym, som spiller multifunksjonelle rolle i cellulær vedlikehold og vekst av epitelceller [31], [32], [33], [34], [35], [36], [37]. En av de fysiologiske funksjoner aPKCλ /ι er å mekle insulin-indusert økning i glukose transport. Insulin regulerer glukose transport gjennom fosfatidyl-inositol-trifosfat kinase (PI3K). Distale effektorer av PI3K inkludere protein kinase B (PKB /Akt) og aPKC isoformene ζ og λ /ι [38].
PKC isozymer er også involvert i celle spredning, overlevelse, differensiering og apoptose. Studier av lunge, eggstokk, tykktarm og brystkreft har vist en sammenheng mellom aPKCλ /ι uttrykk og kreft progresjon og foreslår at aPKCλ /ι uttrykk kan forutsi dårlig overlevelse [21], [22], [23], [39], [40], [41], [42], [43]. Det er flere rapporter som viser forbedret aPKCλ /ι uttrykk i menneskelige prostata kreft vev, men forholdet mellom aPKCλ /ι og prostata kreft progresjon er fortsatt uklart [44], [45]. Videre eksperimenter ved hjelp av prostatakreft cellelinje DU145 avdekket at aPKCλ /ι er involvert i prostata kreft vekst både
in vivo Hotell og
in vitro product: [46]. Overekspresjon av aPKCλ /ι kan forklares med en forsterkning av
PRCKI
genet, som har blitt rapportert i lunge og eggstokk-kreft [22], [23], [39], eller forsterkningen av kromosom 3Q inkludert
PRCKI
gen som er blitt rapportert i prostata kreft cellelinjer [47]. En annen mulighet er at aPKCλ /ι uttrykk er oppregulert gjennom transkripsjonen aktivering av
PRCKI
promoter [48].
I denne rapporten har vi funnet at to allele varianter av
PRKCI
genet ble forbundet med en studie-messig betydelig nivå med en redusert risiko for prostatakreft. rs546950 og rs4955720 ikke er plassert i den kodende region av genet, og det ikke er umiddelbart innlysende hvordan å relatere den genetiske variabilitet av genfunksjon. Vi søkte offentlige databaser for noen rapporterte funksjoner av de to SNPs, men vi fant ikke bevis peker mot en differensial genekspresjon eller mRNA stabilitet. Ingen rapport til dags dato har blitt publisert på enten SNP i forhold til sykdom suceptibility. Vi kjørte også i silico analyse av mulige endringer på trasciption bindingssteder. Disse analysene forutsi en differensiell binding til allelene til de to SNP’er av forskjellige transkripsjonsfaktorer. Spesielt MYOD1 er anslått til å binde bare til den marginale allelet (A) av rs546950 og POU3F3 til mindre allelet (A) av rs4955720. Begge transkripsjonsfaktorer har pro-differensiering, anti-spredning effekt [49], [50]. Det faktum at begge bindes til de mindre, beskyttende alleler er interessant, selv om MYOD1 og POU3F3 har bare blitt rapportert å utøve sin funksjon i muskel og i hjernen, respektive. rs546950 befinner seg i den første intron
PRKCI
, meget nær begynnelsen av genet, derfor er dette i samsvar med en mulig involvering i regulering av transkripsjon av genet. Siden variant allele utøver en beskyttende virkning på prostatakreft risiko vi kan hypotese at det senker eller øker muligheten for transkripsjonsfaktorer til å binde og på en slik måte som resulterer i en minskning av genekspresjon, og dermed redusere risikoen for prostatakreft.
det er vanskeligere å forstå sammenhengen mellom rs4955720 og redusert risiko for prostatakreft fra et biologisk synspunkt. Imidlertid, i den felles analyse p-verdien av denne SNP var den mer signifikante av de to. Dette SNP er plassert ved den 3 «av genet, etter slutten av den siste exon, og en mulig funksjon ikke er umiddelbart innlysende. Også mulig differensial binding med transkripsjonsfaktorer synes å være mindre relevante i dette tilfellet. rs4955720 kan være i høy koblingsulikevekt (LD) med en annen SNP som direkte påvirker transkripsjonen og /eller funksjon av
PRKCI
. Men alle kjente vanlig
PRKCI
SNPs i høy LD med rs4955720 er lokalisert i introner av genet, og ikke synes funksjonelt relevant. Avslutningsvis er det vanskelig å forstå den biologiske mekanismen som kan forklare foreningen av de to polymorfisme med prostatakreft risiko og videre funksjonelle studier er garantert.
SNPs av noen av PI3K genene vi undersøkt her ble også undersøkt i Breast og prostatakreft Cohort Consortium (BPC3) (Koutros 2010). I den studien, rs7556371, en SNP av
PIK3C2B
, ble vist å være assosiert med økt prostata kreftrisiko. I vår studie genotypet vi rs4951384, hvilke merker rs7556371 (r
2 = 1), men vi fikk ikke observere noen bevis for foreningen (tilleggs tabell S2). Imidlertid har det å bli lagt merke til at økningen av risiko funnet av Koutros et al var veldig beskjeden og kan derfor oppdages bare ved en studie med en stor utvalgsstørrelse, slik som BPC3.
Den intensive SNP tagging tilnærming anvendes forutsatt en nær uttømmende analyse av mulige mono-allelisk (hovedeffekt) sammenslutninger av prostata kreftrisiko med vanlige polymorfe varianter som er kjent for hver av de loci studert. Vi hadde nok strøm (0,80 for codominant modell i felles analyse) for å påvise eller = 1,40 (eller OR = 0,71 for assosiasjoner til en redusert risiko) ved alfa = 5,9 × 10
-5 (studie omfattende betydning p-terskel ) for en SNP med en mindre allel frekvens på 0,30.
Selv om over 97% av den episke fagene er anslått til å være av kaukasisk opprinnelse, forskjeller i allele frekvenser i Europa kan i teorien føre konfunderende av befolkningen lagdeling. Vi har imidlertid ikke observere store variasjoner i allelfrekvenser mellom land for SNP studert her (data ikke vist).
En mulig ulempe med dette arbeidet er det store antallet tester utført, selv om flere hint foreslår en reell foreningen: 1) vi observerte foreninger (p 0,05) i begge faser av studien, 2) etter korrigering for antall tester (n = 11) utført i andre fase sammenhengen mellom rs546950 og prostata kreftrisiko fortsatt betydelig, 3 ) foreningen er biologisk plausibel og 4) meta-analyse CGEMS /EPIC (2,743 tilfeller og 3,088 kontroller) viste svært like resultater som de som oppnås med den episke data alene (p = 0,002 for rs4955720 og p = 0,029 for rs546950.
i konklusjonen, fant vi en sammenheng med prostatakreft risiko for to SNPs tilhørighet til
PRKCI
, et gen som ofte overuttrykt i ulike kreftformer, blant annet prostatakreft. Denne observasjons garanterer replikasjon i en større studie .
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle deltakere signert en informert skriftlig samtykke. Studien ble godkjent av de etiske gjennomgang styrene i International Agency for Research on Cancer, og av den samarbeidende institusjoner ansvarlig for faget rekruttering i hver av de EPIC rekrutteringssentre.
EPIC kohort
Et fullt detaljert beskrivelse av EPIC kohorten er publisert andre steder [51]. Kort, EPIC består av ca 370 000 kvinner og 150.000 menn, i alderen 35-69, rekruttert mellom 1992 og 2005 i 10 vesteuropeiske land
De aller fleste ( 97%). Fag rekruttert i EPIC-kullet er av europeisk ( «kaukasisk») opprinnelse. Alle EPIC forsøkspersonene gitt antropometriske målinger (høyde, vekt, og midje og hofte omkrets) og omfattende, standardisert spørreskjema informasjon om medisinsk historie, kosthold, fysisk aktivitet, røyking og andre livsstilsfaktorer. 260.000 kvinner og 140.000 menn gitt en blodprøve.
Tilfeller av kreft oppstår etter rekruttering inn i kohort og blodgivning er identifisert gjennom lokale og nasjonale kreftregistre i syv av de 10 landene, og i Frankrike, Tyskland, og Hellas ved en kombinasjon av kontakter med nasjonale helseforsikringer og /eller aktiv oppfølging gjennom forsøkspersonene eller deres pårørende. Oppfølging av vital status oppnås gjennom posten kobling med dødelighetsregistre.
Valg av case og kontrollpersoner
Case-fagene ble valgt blant menn som utviklet prostatakreft etter blodprøvetaking. Kontrollpersoner (1-2 kontroller per sak) ble valgt tilfeldig av forekomsten tetthet prøvetaking, matchende sakene for sentrum av rekruttering, alder blodgivning og varighet av oppfølging. Totalt 815 invasive prostatakreft tilfeller og 1.266 kontroller, for totalt 2,081 fag, ble inkludert i den første fasen av denne studien. Hver kontroll burde vært gratis for kreft opp til varigheten av oppfølgingen av indeksen saken.
SNP utvalg
For hver av de 67 kandidatgener vi valgt en genomisk region mellom 5 kb 5 «fra begynnelsen av det første kjente ekson og 5 kb 3» av enden av den siste kjente exon. En liste over SNP i alle 67 genområder ble satt sammen ved hjelp av data fra HapMap (slipp 22, på grunnlag av dbSNP versjon 126 og NCBI genom bygge 36), og merking SNP ble selektert ved bruk av Taging algoritmen [52], som implementert i Haploview programvare. Parametere brukt for Tagger utvalget var små allelfrekvens ≥5% i kaukasiere, minimum r
2 = 0,8 mellom hvert par av merkede og merking SNPs, parvis merking (vi observert en gjennomsnittlig bety r
2 mellom tagging SNPs og SNPs de tag på 0,95). SNPs som ble spådd å gjøre det dårlig med Illumina Golden genotyping teknologi ble enten erstattet av SNPs i høy LD (r
2 = 0,8, beregnet fra HapMap data), eller utelatt fra listen hvis ingen proxy var tilgjengelig. Dette ga oss en liste over 1,133 SNPs. Til slutt, for kvalitetskontroll formål, har vi lagt til 30 SNPs som hadde blitt genotypet på de samme prøvene i en urelatert prosjekt.
Prøvepreparering og genotyping
DNA ble ekstrahert fra blodprøver på en Autopure instrument (Qiagen, Hilden) med Puregene kjemi (Qiagen, Hilden, Tyskland). Rekkefølgen av DNA fra kasser og kontroller ble randomisert på PCR-plater for å sikre at et like stort antall tilfeller og kontroller kan analyseres samtidig.
genotyping ble utført ved anvendelse av Illumina Golden teknologi (San Diego, CA. , USA), i henhold til protokollen spesifisert av produsenten.
data~~POS=TRUNC filtrering og statistisk analyse
alle prøve hvor mer enn 25% av SNPs mislyktes hadde alt av SNPs satt til mangler og disse motiver ble utelatt fra analysen. Vi så filtrert data for å fjerne dårlige resultater SNPs: alle SNPs som feilet på 25% av prøvene eller mer ble satt til mangler, samt alle SNPs som viste statistisk signifikant (p 10
-5) avvik fra Hardy-Weinberg likevekt (HWE) blant kontrollene.
Vi har analysert sammenhengen mellom prostatakreft risiko og genotyper for hver SNP bruker betinget logistisk regresjon. Genotypene ble kodet enten som tellinger av mindre alleler (trend test) eller som to indikatorvariabler, en for heterozygoter og én for mindre-allelet homozygote (to frihetsgrader test).
Vi utførte også analyser i undergrupper av sykdom aggressivitet (aggressiv sykdom ble definert som extraprostatic forlengelse (stadium C /D) eller høy histologisk grad (Gleason score ≥8).
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SAS 9.11.
for for å ta hensyn til det store antall av tester som er utført i dette prosjektet, vi beregnet for hvert gen antall effektive uavhengige variabler, M
eff, ved bruk av SNP Spectral Dekomponering tilnærming [53]. Vi har oppnådd et gen for hele M
eff verdi for hvert gen og også en studie omfattende M
eff verdi, ved å legge opp genet M
EFF.
Replication
Vi replikert SNPs viser de sterkeste assosiasjoner med prostatakreft risiko (p
trend 0,01 eller p
2DF 0,01; n = 11) på et ekstra sett av 838 tilfeller og 943 kontroller velges innenfor EPIC kohort. All den ekstra genotyping ble utført ved bruk av Taqman assay. De MGB TaqMan prober og primere ble kjøpt fra Applied Biosystems (Foster City, CA) som pre-designet analyser. Reaksjonsblandingen inkluderte 10 ng genomisk DNA, 10 pmol hver primer, 2 pmol hver sonde og 2,5 ul av 2x Master Mix (Applied Biosystems) i et endelig volum på 5 ul. Den termocykling inkluderte 40 sykluser med 30 sek ved 95 ° C, etterfulgt av 60 s ved 60 ° C. PCR-plater ble lest på en ABI PRISM 7900HT instrument (Applied Biosystems).
Alle prøver som ikke gir et pålitelig resultat i første runde av genotyping ble sendt inn til opptil to ekstra runder med genotyping. Datapunkter som fortsatt ikke var fylt etter denne prosedyren ble tomt. Gjentatte kvalitetskontroll genotyper (5% av det totale) viste en samstemmighet av 100,0%.
bioinformatiske analyse
Potensielle bindingssteder av transkripsjonsfaktorer innenfor sekvensen som omfatter to studiemessig signifikant assosiert SNPs ble utført med MatInspector Professional (https://genomatix.de/cgi-bin/matinspector_prof/mat_fam.pl) [54].
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Cartoon av mTOR pathway
doi:. 10,1371 /journal.pone.0016914.s001 plakater (PNG)
Tabell S1.
kandidat gener og deres SNPs
Doi. 10,1371 /journal.pone.0016914.s002 plakater (DOC)
Tabell S2. On Main effekter av 1,084 SNPs genotypet i den første fasen. Kolonnene i denne tabellen viser: genet navn, NCBI dbSNP rs nummer, antall saker og kontroller for hver av de tre genotyper, odds ratio for heterozygoter, homozygote for den sjeldne allelet (referert til de homozygote for det felles allelet) og per allel, med 95% konfidensintervall, p-verdien av testen med to indikatorvariabler (2 df test), p-verdi på trenden test
doi:. 10,1371 /journal.pone.0016914.s003 plakater (XLS)
Tabell S3.
M
eff for hvert gen i studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0016914.s004 plakater (XLS)
Tabell S4.
Analyser i undergrupper av sykdommen aggressivitet. Kolonnene i denne tabellen viser: genet navn, NCBI dbSNP rs nummer, mulige genotyper, antall saker og kontroller for hver av de tre genotyper, odds ratio for heterozygoter og for homozygote for den sjeldne allelet (referert til de homozygote for det felles allelet) med 95% konfidensintervall, Cochran Q parameter, jeg
2 statistikk, p-verdien av testen for heterogenitet, p-verdi på trenden test for hvert stratum, navn på stratum
doi:. 10,1371 /journal.pone.0016914.s005 product: (XLS)
