Abstract
Bakgrunn
En spredning-induserende ligand (april) er et medlem av tumornekrosefaktor (TNF) super familie. Det binder seg til sine spesifikke reseptorer og er involvert i flere prosesser i løpet tumorigenesis og kreftceller spredning. Høye nivåer av april uttrykk er nært korrelert til vekst, metastase, og 5-FU legemiddelresistens av tykk- og endetarmskreft. Hensikten med denne studien var å identifisere en bestemt april bindende peptid (BP) i stand til å blokkere april aktivitet som kan brukes som en potensiell behandling for tykktarmskreft.
Metoder
Et fag display-bibliotek ble anvendt for å identifisere peptider som bandt seg selektivt til løselig rekombinant human april (sAPRIL). Peptidene med den høyeste bindingsaffinitet for sAPRIL ble identifisert ved hjelp av ELISA. Virkningene av sAPRIL-BP for celleproliferasjon og cellesyklus /apoptose
in vitro
ble evaluert ved bruk av CCK-8-analysen og strømningscytometri, respektivt. En
in vivo
musemodell for tykktarmskreft ble brukt til å bestemme anti-tumor effekt av sAPRIL-BP.
Resultater
Tre kandidat peptider ble preget av åtte fag kloner med høy bindende affinitet for sAPRIL. Peptidet med høyest affinitet ble valgt for ytterligere karakterisering. Den identifiserte sAPRIL-BP undertrykket tumorcelleformering og cellesyklusprogresjon i Lovo-celler på en doseavhengig måte.
In vivo
i en muse kolorektal utfordring modell, sAPRIL-BP reduserte veksten av tumorxenotransplantater i hårløse mus ved å hemme spredning og indusere apoptose intratumorally. Videre, i en
in vivo
metastase modell, sAPRIL-BP redusert levermetastaser fra kolorektal kreft celler.
Konklusjoner
sAPRIL-BP undertrykte betydelig tumorvekst
i vitro Hotell og
in vivo Hotell og kan være en kandidat for behandling av kolorektal kreft som uttrykker høye nivåer av april
Citation. Han Xq, Guan J, Liu F, Li J, han Mr (2015) Identifikasjon av sAPRIL Binding Peptide og dens veksthemming virkninger i tykktarmskreftceller. PLoS ONE 10 (3): e0120564. doi: 10,1371 /journal.pone.0120564
Academic Redaktør: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, TAIWAN
mottatt: 1 august 2014; Godkjent: 05.02.2015; Publisert: 31 mars 2015
Copyright: © 2015 Han et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:.. Dette arbeidet ble støttet av emnet for Guangzhou Science and Technology planlagte prosjekter (2012J4300091)
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste fordøyelses kreft på verdensbasis, og pasientene ofte dø av kreft celle metastase [1]. Tradisjonelle kjemoterapi har ulemper, inkludert, forskjellige grader av celle cytotoksisitet og utenfor mål effekter som kan skade friskt vev, er disse bivirkningene ha en ugunstig innvirkning på pasientens livskvalitet. Det er avgjørende å utvikle en målrettet kreftbehandling som har lav cytotoksisitet og er svært selektiv for å bedre prognosen og overlevelse av pasienter med kolorektal kreft.
En spredning induserende ligand (april) er en ligand i tumor nekrose faktor (TNF) superfamilien som fungerer som en oppløselig faktor [2]. April er først og fremst uttrykt av hematopoetiske celler og har biologiske roller i B-celle overlevelse og T-celleaktivering [3-5]. Normale vev uttrykker svært lavt nivå av april imidlertid cancercellelinjer og tumorer så som fordøyelses kreft, hematologisk malignitet, og urothelial kreft, uttrykker høye nivåer av april [6-9]. April er involvert i multippel prosess knyttet til tumorgenese, slik som å fremme tumorcelle-proliferasjon og overlevelse i ulike typer av kreft [10-14]. I tykktarmskreft, er høyt uttrykk av april nært korrelert med tumorvekst, metastase, og 5-fluorouridin (5-FU) motstand [12, 13, 15].
april utøver sine biologiske funksjoner ved å samhandle med flere reseptorer. Kjente APRIL reseptorer inkluderer B-celle modning antigen (BCMA), trans aktivator og cyklofilin ligand Interactor (taci), og heparin sulfat proteoglykaner (HSPGs) [7, 16]. BCMA er primært uttrykkes på modne B-lymfocytter [17], men er også sterkt uttrykt på multiple myelom-celler [18]. Taci uttrykkes primært på modne B-celler og plasmaceller [19], og HSPGs allment uttrykt på overflaten av mange pattedyrceller [20]. Ved binding til disse reseptorene, forbedrer april proliferasjon, apoptose eller undertrykker for å fremme tumorprogresjon gjennom flere molekylære mekanismer. I B-celle kronisk lymfatisk leukemi (B-KLL), stimulerer løselig april NF- μB aktivering, og beskytter B-KLL celler fra spontan eller medikamentindusert apoptose [21]. I ikke-Hodgkins lymfom (NHL) B-celler, aktiverer rekombinant april NF- μB, oppregulerer anti-apoptotiske proteiner Bcl-2 og Bcl-xL, og nedregulerer den pro-apototic protein Bax å hemme apoptose [14]. I gliomceller, ektopisk ekspresjon av april confers beskyttelse mot død ligand /reseptor-mediert apoptose eventuelt ved oppregulering anti-apoptotiske protein X-bundet hemmer av apoptose protein (XIAP) [22]. I multippel myelom, fremmer april cellesyklusprogresjon ved å øke i S-fasen og G
2-M-fase [23]. I menneskelige kolorektal kreft celler, banket ned april bruker RNA interferens blokker transformere vekstfaktor (TGF) -μ1 signalering og aktivering av ekstracellulære signalregulerte kinaser (ERK) for å indusere cellesyklus og apoptose [24].
targeting april å undertrykke tumorvekst, spredning og overlevelse kan være en mulig strategi for å behandle kolorektal kreft. Andre har vist at å kneble april reduserer tumor celleproliferasjon og metastase i tykk- og endetarmskreft [25-27]. Vi har tidligere vist at nedregulering av april reduserer proliferasjon, apoptose øker, og øker følsomhet for 5-FU kjemoterapi i kolorektal cellelinje LoVo, som uttrykker høye nivåer av april [28]. Gao
et al
. har utviklet en anti-april monoklonalt antistoff og demonstrert sin anti-proliferativ effekt
in vitro Hotell og
in vivo product: [29]. Andre grupper har brukt rekombinante sAPRIL reseptorer eller mutant sAPRIL å konkurrere med endogen sAPRIL for binding til sine reseptorer [30, 31]. Sammenlignet med andre strategier for målretting april, slik som siRNA eller anti-APRIL-antistoffer, polypeptider som har flere fordeler, inkludert lav immunogenisitet, en høy grad av sikkerhet, enkel syntese og rensing, til evnen trenge inn i vev og organer, og mindre toksisitet. Identifisere og syntetisere anti-tumor polypeptider har blitt en populær strategi for å utvikle målrettede anti-kreft terapier [32, 33]. Imidlertid har ingen APRIL spesifikke polypeptider blitt rapportert til dags dato. Derfor er målet med denne studien var å identifisere sAPRIL spesifikke peptider ved hjelp av et fag display-bibliotek, og å evaluere
in vitro Hotell og
in vivo
anti-kreft effekt for å gi en terapeutisk kandidat for bruk mot kolorektal kreft som uttrykker høye nivåer av april
Materialer og metoder
In vitro panorering
Menneskelig rekombinant sAPRIL (R D, USA). ble brukt som målprotein for screening av et fag display-12-peptid-bibliotek i henhold til produsentens protokoll (NEB, USA). Kort sagt ble fager fra biblioteket lagt inn på sAPRIL-belagte ELISA-plater og inkubert ved romtemperatur i 60 min. Ubundne fager ble fjernet ved vasking med TBST (TBS + 0,1% [volum /volum] Tween-20). Deretter ble bundet fager vasket av med glycin-HCl (pH 2,0) og amplifisert. Fagene med bindende affinitet for sAPRIL ble høstet etter fire runder med binding /forsterkning. Bortsett fra den første runden, vaskebuffer for å fjerne ubundet fagene var TBST (TBS + 0,5% [v /v] Tween-20).
Valg av positiv klon av ELISA
Twenty enkelt kolonier ble plukket fra den siste runden av panorering og inkuberes med
E
.
coli-vertsstamme
ER2738 i 4,5 timer ved 37 ° C med risting. En sAPRIL-belagt ELISA-plate ble blokkert med 5% bovint serumalbumin (BSA) over natten og deretter supernatanten fra en enkeltkoloni fag-suspensjonen ble tilsatt i 1 time. For å detektere bundet fager, et pepperrotperoksidase (HRP) -merket anti-M13-antistoff (GE Healthcare, USA) ble tilsatt i 1 time, etterfulgt av tetrametylbenzidin (TMB) i 10 minutter, og deretter ble reaksjonen stoppet med en H
2SO
4 løsning. Kolonier med en A
450 som var minst seks ganger høyere enn den positive kontrollen ble ansett som positivt for sAPRIL bindende.
Sekvensanalyse av utvalgte positive kloner og peptidsyntese
Sekvensene de positive kloner ble analysert og oversatt til aminosyresekvensene og de tilsvarende peptider ble syntetisert og renset (Hang kinesisk Peptide Company). De sAPRIL bindende peptider ble deretter testet med hensyn til deres affinitet for sAPRIL og TNF-superfamilien medlem BAFF ved hjelp av ELISA. Den peptid som hadde den høyeste bindingsaktivitet for sAPRIL ble valgt for oppfølgingsforsøk.
Cell kultur
kolorektal kreft i tykktarmen cellelinjer SW620, Løvø, HCT116, HT29, og SW480 ble kjøpt fra ATCC. Alle cellelinjene ble dyrket i RPMI-1640 med 10% FBS, og 100 KU /l penicillin og amp (Gibco BRL Co. Ltd., USA.); streptomycin ved 37 ° C med 5% CO
2.
In vivo modell
Alle dyrestudier ble gjennomført i samsvar med institusjonelle retningslinjer, og godkjent av Animal Care og bruk komité på Nanfang sykehus. BALB /c naken mus (4-6 uker gamle) ble kjøpt fra Guangdong Medical Laboratory Animal Center og opprettholdt under gnotobiotiske forhold. LoVo-celler (2 x 10
6-celler i 100 ul PBS) ble injisert subkutant (100 pl /injeksjon, en injeksjonsstedet /tumor) og tumorstørrelsen ble målt hver 3. dag. Etter 3 uker ble det subkutane nodule betraktet som en svulst da den nådde 100-200 mm
3. Musene ble delt i tre grupper og injisert intratumorally med PBS (kontroll), 20 mg /kg sAPRIL-BP (lav dose), eller 40 mg /kg sAPRIL-BP (høy dose) annenhver dag i to uker. Tumorvolum (V) ble beregnet ved anvendelse av formelen: V = AB
2/2, hvor A er den maksimale diameter, og B er diameteren loddrett på den linje av A.
For kolorektal kreft levermetastaser modell, LoVo-celler (2×10
6 celler /100 ul) ble injisert inn i milten etter laparotomi. Tre uker etter injeksjon ble musene randomisert til 3 grupper (N = 5) og intraperitonealt injisert med PBS (200 ul) som en kontroll, lav dose av sAPRIL-BP (20 mg /kg), eller den høye dosen av sAPRIL- BP (40 mg /kg) på dagene 22, 24, 26, 30, 32, og 34 ettertumorinjeksjon. Musene ble avlivet på dag 35. Leveren ble høstet, og antallet og størrelsen av metastasized noduler ble bestemt.
Revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
RNA fra tykktarmskreftcelle linjer ble ekstrahert med Trizol (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA fra hver prøve ble anvendt for cDNA-syntese ved bruk av RevertAID kit (Fermentas, Canada). PCR ble utført ved anvendelse av PCR forblanding (SBS Genetech, Kina). Primersekvensene for april var: frem 5′-AGAAGAAGCAGCACTCTGTC-3 «og omvendt 5′-CCATGTGGAGAGAGGTTAAG-3′ (produkt 394 bp). GAPDH ble benyttet som intern kontroll. GAPDH-primere var: forover 5»-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3 «og 5′-revers AGGGTCTACATGGCAACTG-3» (produkt 240 bp). PCR-reaksjonsbetingelsene var: 95 ° C i 3 minutter, 94 ° C i 50 s, 58 ° C i 30 s, og 72 ° C i 1 min, i 32 sykler, etterfulgt av forlengelse ved 72 ° C i 7 min. PCR-produktene ble separert ved hjelp av agarosegelelektroforese og visualisert med UV-bestråling.
Western blotting
Western blotting ble utført i henhold til standard protokoller. Antistoffene som ble brukt var mot april, cyklin D1, cyklin A, cyklin E, cyklin B1, CDK4, CDK6, p53, p27 og p16 (1: 1000, Abcam, USA) og kanin-anti-GAPDH (1: 2000, ZSGB- BIO, Kina).
celleproliferasjonsanalyse
LoVo og SW620-celler ble sådd ut i 96-brønners kulturplater (2 x 10
3 celler /brønn) i et 200 pl volum over natten . Fem doser av rekombinant sAPRIL bindende peptid (5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM og 80 uM) ble tilsatt til 24 timer, 48 timer og 72 timer. Celleproliferasjon ble bestemt ved bruk av CCK-8 kit (Beyotime Institutt for bioteknologi, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner.
Cellesyklus og apoptose analyse
Løvø celler ble sådd i 6-brønnen kultur plater (1 x 10
5-celler /brønn /ml). Etter 24 timer sAPRIL bindende peptid (20 uM eller 40 uM) ble tilsatt i ytterligere 48 timer. For cellesyklusanalyse ved strømningscytometri (BD LSR flowcytometer, BD Biosciences, USA), ble cellene høstet og fiksert med 7% etanol i 24 timer ved 4 ° C. Etter vasking med PBS ble cellene farget med propidiumjodid (PI) løsning (50 ug /ml PI, 100 ug /ml RNAse A, 0,2% Triton X-100) i 30 minutter ved 4 ° C. Dataene ble analysert ved anvendelse av Modfit LT-programvaren. For apoptose analyse ved flowcytometri, ble de høstede cellene farget med en apoptose deteksjonssett (Beyotime, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene farget med 500 ul av bindingsbuffer, 5 mL av Annexin V-FITC, og 5 ul av PI i 5-15 minutter ved romtemperatur i mørke.
Immunhistokjemi farging
Alle xenografttumorer ble fiksert med 10% formalin og parafin-embedded for seksjonering. For antigen gjenfinning, ble vevssnitt plassert i en 0,01 M citratbuffer ved pH 6,0 og deretter oppvarmet ved 98 ° C til 100 ° C i 15 minutter i en mikrobølgeovn. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved inkubering av delene i 3% -ig hydrogenperoksyd (i frisk metanol) i 15 minutter ved romtemperatur. Deretter vevssnitt ble farget med primære antistoffer som er spesifikke for Ki-67 (1: 100, Abcam, USA) og spaltet caspase-3 (1: 200, CST, USA). En konjugert kanin anti-mus IgG sekundært antistoff (1: 200, Abcam, USA) ble anvendt. Positiv farging ble visualisert med DAB. Bilder ble tatt med et Olympus BX41 lysmikroskop. Prosentandelen av Ki67-positive tumorceller (proliferativ indeks) og andelen av spaltede caspase-3-positive tumorceller (apoptose indeks) ble bestemt for tre separate felt som inneholder minst 1000 tilstøtende celler for hvert lysbilde.
statistikker
Alle resultater ble analysert med SPSS versjon 17,0 programvare. Alle eksperimenter ble gjentatt minst tre ganger. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) hvis ikke annet er angitt. Statistisk signifikans ble evaluert ved anvendelse av en enveis ANOVA eller to-halet t-test. Forskjellen mellom gruppene ble betraktet som signifikant når
p
. 0,05
Resultater
Identifikasjon av spesifikke sAPRIL bindende peptid
En fagbibliotek ble brukt å identifisere 20 enkeltrom kloner uttrykker potensielle sAPRIL bindende peptider. Klonene ble tilfeldig valgt etter fire runder med panorering. Åtte enkle kloner ble identifisert som «positive» som indikerer en høy bindingsaffinitet (definert som en OD ≥6 ganger den ytre diameter av den positive kontroll) for sAPRIL ved hjelp av ELISA (figur 1A). De åtte kloner som representeres tre DNA-sekvenser som tilsvarer de følgende bindings-polypeptider (BP): AAAPLAQPHMWA, SSTTTSDKYLSA, og SNLHDNNTEKNV (tabell 1). Affiniteten for sAPRIL ble målt for hvert polypeptid ved hjelp av ELISA og sammenlignet med et ubeslektet polypeptid (HWDPFSLSAYFP) som en negativ kontroll. De tre peptider som er identifisert ved hjelp av fag-bibliotek hadde sAPRIL bindingsaffiniteter som var 13,7, 10,8 og 9,3 ganger høyere enn kontrollen peptid, henholdsvis (figur 1B). Bindingsaffiniteten til den sAPRIL-BPs ble også testet mot andre TNF-superfamilien ligand BAFF (B-celleaktivering faktor av TNF-familien). Bindingsaffinitetene for hver sAPRIL-BP var 1.2, 1.1 og 0.9, respektivt (figur 1B). Samlet utgjør disse resultatene indikerte at sAPRIL-BPs binder seg spesifikt til april, og ikke kryssreagerer med BAFF. sAPRIL-BP1 (AAAPLAQPHMWA) hadde høyest bindende affinitet og ble senere brukt
in vitro
å vurdere om det var i stand til å hemme sAPRIL bindende i den faste menneskelige tykktarmskreft cellelinje Løvø celler (figur 1C). sAPRIL-BP1 viste en dose-avhengig inhiberende effekt på sAPRIL binding til Lovo-celler. Derfor ble sAPRIL-BP1 (heretter sAPRIL-BP) valgt for ytterligere funksjonell karakterisering.
(A) Bindingen affinitet fagklonene No.1-20 for sAPRIL ble bestemt av ELISA. Klon 21 ble anvendt som en positiv kontroll. Folden endring av den optiske tetthet ble normalisert til den positive kontroll. Kloner som hadde minst seks ganger høyere affinitet enn den positive kontrollen ble betraktet som «positive» for sAPRIL bindende. (B) Tre bindende peptider ble syntetisert, og deres bindingsaffinitet med sAPRIL (svarte søyler) ble bestemt og sammenlignet med den negative kontroll (NC) ved hjelp av ELISA. Kryssreaktivitet ble vurdert ved å måle bindende affinitet til BAFF (grå søyler). (C) Clone BP1 (sAPRIL-BP) ble blandet med sAPRIL på ulike doser for å konkurrere om binding med faste Løvø celler.
Anti-proliferative effekter av sAPRIL peptider i Løvø celler
for å vurdere rollen til april i tykktarmskreft, ble april uttrykk undersøkt i fem menneskelige kolorektal cellelinjer ved RT-PCR (fig 2A og 2B) og western blotting (fig 2C og 2D). Den HCT116 og Løvø cellelinjer hadde signifikant høyere nivåer av april mRNA (
p
0,05) og protein (
p
0,05) enn SW480, SW620, og HT29 cellelinjer. Derfor ble effekten av sAPRIL-BP evaluert i Lovo og HCT116 (april
høye) celler, og SW620 og HT-29 (april
lav) celler. For å avgjøre om det var dose effekter, ble cellevekst målt ved forskjellige konsentrasjoner av sAPRIL-BP. Satsen for spredning ble betydelig hemmet (
p
0,05) ved behandling med sAPRIL-BP i Løvø og HCT116-celler (figur 3A) i et tids- og doseavhengig måte. Imidlertid var dette ikke tilfelle i SW620 og HT-29-celler (figur 3B). Der resultatene tyder på at anti-proliferative effekter av sAPRIL-BP er spesifikke for april
høye celler.
april uttrykk ble undersøkt i fem menneskelige kolorektal cellelinjer (indikert) ved hjelp av RT-PCR (A) og Western blotting (C). Representative gel Bildene vises. GAPDH ble benyttet som intern kontroll. De optiske tettheter av den april mRNA (B) og protein (D) bånd ble analysert og normalisert til den interne kontrollen. *
P
. 0,05 sammenlignet med SW620, HT-29, eller SW480
(A) april
høy Løvø og HCT116-celler og (B) april
lav SW620 og HT-29 celler ble behandlet med de angitte doser av sAPRIL bindende peptider for 24, 48 og 72 timer, og proliferasjon ble bestemt ved bruk av CCK-8 kit. Hastigheten for inhibering proliferasjon ble beregnet som: (%) = [(middel av OD
kontroll-midlere OD
eksperimentelt) /middelverdi OD
kontroll] x 100%
.
Effekter av sAPRIL bindende peptider på cellesyklus og apoptose i Lovo-celler
Siden den spredning av kreftceller reguleres primært av cellesyklusen, vi neste bestemmes hvilken fasen av cellesyklusen ble påvirket av sAPRIL behandling. Basert på resultater av sprednings (figur 3A), valgte vi å teste 20 uM og 40 uM av sAPRIL-BP i Lovo-celler for å bestemme hvor inhibering sAPRIL endret cellesyklus og apoptose. Ved strømningscytometri, sAPRIL-BP økt betydelig prosentandelen av celler i G
0 /G
en fase ved den lave dosen (20 uM sAPRIL-BP: 73,1 ± 0,6%;
p
0,001) og høy dose (40 mikrometer sAPRIL-BP: 76,2 ± 0,1%;
p
0,001) sammenlignet med bilen kontroll (65,2 ± 0,8%). sAPRIL-BP også betydelig redusert prosentandelen av celler i G
2 /M fasen sammenlignet med bærerkontrollen (24,3 ± 0,8%) ved den lave dosen (20 uM sAPRIL-BP: 15,1 ± 0,5%;
p
0,05) og høy dose (40 uM sAPRIL-BP: 13,7 ± 0,5%;
p
0,001, fig 4A og 4B). Dette tyder på at de anti-proliferative effekter av sAPRIL-BP i Løvø celler skyldes en opphopning av celler i G
0 /G
en scene, som blokkerer cellesyklusprogresjon. Når det gjelder de apoptotiske virkninger av sAPRIL-BP, flowcytometri analyse viste at sAPRIL-BP hadde doseavhengige effekter på prosentandelen av Løvø celler i tidlig apoptose (PI
– Annexin V
+ celler). Sammenlignet med Vehicle kontroll (1,76 ± 0,12%) i lav dose (20 mikrometer sAPRIL-BP: 2,49 ± 0,23%;
p
0,05) og høy dose (40 mikrometer sAPRIL-BP: 3,82 ± 0,36 %;
p
0,05) betydelig økt tidlig apoptotiske celler (fig 4C og 4D). Vi videre undersøkt mulige molekylære mekanismen bak effekten av sAPRIL-BP på cellecyklusprogresjonen. Behandling med sAPRIL-BP hadde ingen effekt på cyklin A, B, E1, CDK6, p53, p27 og p16 ekspresjon (Fig 5A). Men ekspresjonen av G1 /S-spesifikt protein cyclin D1 (figur 5A og 5B) og celledeling kinase cyklin-avhengig kinase 4 (CDK4) (figur 5A og 5C) ble nedregulert på en doseavhengig måte ved behandling med sAPRIL- BP.
Løvø celler ble behandlet med de angitte doser av sAPRIL-BP for 48 timer. Celler ble farget med PI for cellesyklusanalyse (A og B) og PI + Annexin V for apoptose analyse (C og D) ved strømningscytometri. *
p
0,05 sammenlignet med kjøretøy kontroll; #
p
0,05 sammenlignet med gruppen med lav dose
Løvø celler ble behandlet med de angitte doser av sAPRIL-BP for 48 h.. (A) Et uttrykk nivåer av de angitte cellesyklusproteiner ble undersøkt ved Western blotting-analyse. GAPDH ble benyttet som intern kontroll. Proteinet størrelsen cyclin D1 er 34 kDa, cyclin A 49 kDa, Cyclin E 50 kDa, Cyclin B1 55 kDa, CDK4 34 kDa, CDK6 37 kDa, p53 53 kDa, p27 27 kDa, p16 40 kDa, og GAPDH 36 kDa. De optiske tettheter av cyklin D1 (B) og CDK4 (C) proteinbånd ble analysert og normalisert til den interne kontrollen som gangers endring. *
P
0,05 sammenlignet med Vehicle gruppe; #
P
0,05 sammenlignet med 10 mikrometer gruppe, †
P
0,05 sammenlignet med 20 mikrometer gruppe
Effekt av sAPRIL-BP på. xenograft tumorvekst
Så
in vivo
effekten av sAPRIL-BP ble evaluert i colorectal cancer xenograft modell. LoVo-celler ble subkutant injisert inn i nakne mus, etterfulgt av kontroll, lav dose (20 mg /kg) eller høy (40 mg /kg) sAPRIL-BP injisert intratumorally når tumoren ble etablert. Musene ble avlivet på dag 14, er representative bilder av mus og tumorer er vist på fig 6A. Behandling med sAPRIL-BP doseavhengig redusert tumorvolumet (figur 6A) og tumorvekt (figur 6B) i musemodellen. Fra dag 8 av sAPRIL-BP injeksjonen ble tumorstørrelse av lave og høye dosegruppene signifikant
(p
0,05). Mindre enn kontrollgruppen (figur 6C)
LoVo-celler ble injisert subkutant i nakne mus og fikk vokse i 3 uker. Når svulsten var etablerer ble musene delt inn i 3 grupper (N = 5) og behandlet med PBS (kontroll), lav (20 mg /kg) eller høy (40 mg /kg) dose av sAPRIL-BP annenhver dag . (A) Representative eksempler på tumorer fra hver gruppe er vist. Topplate: Scale bar, 8 mm. Bunnplate: Scale bar, 7 mm. (B) Mus ble avlivet etter to ukers behandling med sAPRIL-BP og tumorvekter ble registrert. *
p
0,05 sammenlignet med kontroll. #
p
0,05 sammenlignet med gruppen med lav dose. (C) Den tumorvolum ble registrert annenhver dag i løpet av behandlingen. *
p
. 0,05 sammenlignet med kontroll
Effekt av sAPRIL-BP på celleproliferasjon og apoptose i xenograft tumor
For ytterligere å undersøke mekanismen som sAPRIL-BP hemmer xenograft tumorvekst, utførte vi H E-farging (fig 7A) på tumorvev og fant at behandling med enten lav dose eller høy dose av sAPRIL-BP hadde ingen signifikant effekt på tumorcelle morfologi og tumormasse arkitektur . Det ble observert et lite antall større tomrom mellom tumorceller i høydosegruppen enn de to andre gruppene. Videre immunhistokjemisk farging for spredning Ki67 på xenograft tumorer (figur 7B og 7D) viste sAPRIL-BP signifikant inhiberte kreftcelleformering
in vivo
på en doseavhengig måte. I motsetning til dette, immunhistokjemisk farging for apoptose markør spaltet caspase-3 (figur 7C og 7E) viste sAPRIL-BP behandling førte til en signifikant og doseavhengig økning i apoptose av tumorceller. . Disse resultatene viste at sAPRIL-BP hemme tumorvekst gjennom proliferasjon inhibering og apoptose-induksjon
Parafin innleiret tumorvev ble anvendt for morfologisk analyse med H E farging (A), analyse proliferasjon med Ki67-farging (B), og apoptose analyse med spaltede caspase-3 (cle-Casp-3) farging (C). Representative bilder av svulster fra hver gruppe vises (forstørrelse 200 ×). Utbredelsen indeks (D) og apoptose indeksen (E) ble beregnet og normalisert til kontroll (Con) gruppe. *
p
0,05 sammenlignet med kontroll. #
p
. 0,05 sammenlignet med 20 mg /kg gruppe
Effekt av sAPRIL-BP på xenograft tumor metastase
For ytterligere å undersøke om sAPRIL- BP behandling sperre metastaser, vi etablert en levermetastaser modell ved å injisere Løvø celler i milten. Representative bilder av metastatisk levertumor ble vist i figur 8A. Behandling med sAPRIL-BP redusert antall metastatiske noduler i en doseavhengig måte (figur 8B;
p
0,05). Fordelingen av nodule størrelser var lik i hver gruppe (Fig 8C). Samlet utgjør disse resultatene antydet sAPRIL-BP behandling ikke bare redusert tumorvekst, men også redusert levermetastaser i en musemodell av tykktarmskreft.
Løvø celler ble injisert i milten av nakne mus å observere eksperimentell levermetastaser. Tre uker etter injeksjonen ble musene delt inn i 3 grupper (N = 5) og behandlet med PBS (kontroll), lav (20 mg /kg) eller høy (40 mg /kg) doser av sAPRIL-BP annenhver dag. Mus ble avlivet etter to ukers behandling med sAPRIL-BP. (A) Representative bilder av metastatiske leversvulster fra hver gruppe vises. (B) Tall av metastatiske knuter per mus ble registrert. *
P
0,05 sammenlignet med kontroll. #
P
0,05 sammenlignet med gruppen med lav dose. (C) Tall av metastatiske knuter med den angitte størrelsen ble registrert. Totalt antall metastatiske knuter. N = 197 (con), n = 130 (20 mg /kg), og n = 84 (40 mg /kg)
Diskusjoner
i denne studien har vi identifisert og karakterisert et sAPRIL-BP som kan være en potensiell terapeutisk for tykktarmskreft.
In vitro
studier har vist både anti-proliferative og pro-apoptotiske virkninger av sAPRIL-BP. Konsekvent, sAPRIL-BP redusert
in vivo
tumorvekst ved å redusere intratumoral celleproliferasjon og økende intratumoral celle apoptose. Videre sAPRIL-BP betydelig redusert levermetastaser fra kolorektal kreft celler i en musemodell. Effektene av sAPRIL-BP ble identifisert i denne studien vil trenge å bli testet videre i kliniske studier. Anti-kreft-polypeptider har flere fordeler, såsom enkel syntese og rensing lav immunogenisitet, og høy borsynk. Dette sAPRIL-BP kan være en mulig strategi for behandling april
høye cancere [34-38].
A fag-display-bibliotek inneholder et stort antall av forskjellige polypeptider som blir uttrykt på overflaten av fager [39]. Denne teknikken er mye brukt for screening narkotika mål, reseptor agonist /antagonist, antigen epitop analyse, vaksine utforming og analyse av proteinstruktur [40-42]. Vi benyttet denne metoden for å utvikle sAPRIL spesifikke peptider. Fordi en av de mekanismer som ligger til grunn tumorigenesis er den forstyrrelse av balansen mellom celleproliferasjon og apoptose, blir anti-kreft strategier som inkluderer inhibering proliferasjon og /eller indusere apoptose i kreftceller anbefales [43, 44]. Vi antok at bindende peptider, som konkurrerer med endogene APRIL reseptorer å binde løselig form av april, vil ha terapeutisk effekt mot april
høye kreft. Lignende strategier rettet april som, ved hjelp av løselige former av lokkereseptorer for å konkurrere med ligand-binding og stanse april, har blitt vist å hemme tumorvekst i visse typer kreft. For eksempel har den oppløselige formen av BCMA blitt vist å inhibere den proliferative aktivitet av april
in vitro
og redusere tumorcelle-proliferasjon i nakne mus [45]. Nedregulering av april med lentivirus-mediert RNAi hemmer effektivt veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro Hotell og
in vivo product: [46]. Wang
et al
. [15, 26] også brukes siRNA til taushet april i en naken mus tykktarmskreft modell, og fant at april knockdown økt kreftceller apoptose og redusert tumorvekst og metastasering. Tilsvarende har vi tidligere har vist at lentivirus-mediert RNAi knockdown av april hemmer veksten av LoVo-celler og øker antall celler i G0 /G1 fase og reduserer antallet i G2 /M fase [28]. I samsvar med den tidligere arbeid, denne studien viste at målretting april bruker sAPRIL-BP har noen effekt mot tykktarmskreft linjer.
Tidligere arbeid [14, 21, 22, 24] antydet at anti-apoptotiske mekanismer sAPRIL -bp kanskje skyldes blokkering NF-kB signalering, og reguleringen av anti-apoptotiske proteiner (BCL-2, BCL-XL, XIAP, ERK, og TGF-p) eller pro-apoptotiske proteiner som Bax. Men de detaljerte molekylære mekanismene sAPRIL-BP økt apoptose i Løvø celler der gjenstår å bli ytterligere undersøkt. I tillegg sAPRIL-BP vi identifisert viste spesifikk bindingsaffinitet med sAPRIL og sterk evne til kompetitivt å inhibere binding til sAPRIL APRIL reseptorer på Lovo-celler. HSPG er den eneste april reseptoren som finnes på LoVo-celler (data ikke vist). Derfor, om sAPRIL-BP og HSPG deler de samme bindende epitoper på sAPRIL, og den strukturelle likheten mellom HSPG og sAPRIL-BP krever ytterligere studier.
April-regulert celleproliferasjon har vært innblandet i mange forskjellige krefttyper, men til dags dato er det få publiserte studier som viser den molekylære mekanismen bak april-mediert cellesyklusregulering. Wang
et al
. viste en reduksjon i cyclin D1 og CDK4, som er kritiske regulatorer av G1 /S overgang, når april ble slått ned i kolorektal kreftceller.
