Abstract
Pasienter med kreft i bukspyttkjertelen har dystre prognoser, og nye behandlingsformer er sterkt behov. Mutasjoner av KRAS onkogen forekommer ofte i bukspyttkjertelkreft og representerer et attraktivt mål. Direkte målretting av de dominerende KRAS trasé har vært utfordrende og forskning på terapeutiske strategier har blitt nå refocused på stier nedstrøms av KRAS, phosphoinositide 3-kinase (PI3K) og mitogen-aktivert protein kinase (MAPK [MEK]). Vi antok at samtidig hemming av PI3K og MEK-trasé vil resultere i synergistisk antitumoraktivitet, som det ville omgå den kompenserende tilbakekoblingssløyfe mellom de to veier. Vi undersøkte den kombinerte effekten av PI3K inhibitor, GDC0941, og MEK hemmer AZD6244, på celle levedyktighet, apoptose og cellesignalisering i et panel av bukspyttkjertelkreft cellelinjer. En
in vivo
analyse ble utført på kreft i bukspyttkjertelen xenografter. Mens BxPC-3 (KRAS villtype) og MIA PACA-2 (KRAS muterte) cellelinjer var følsomme for GDC0941 og AZD6244 som enkle midler, synergistisk hemming av tumorcellevekst og induksjon av apoptose ble observert i begge cellelinjene når de to legemidlene ble kombinert. Interessant, fosforylering av cap-avhengige translasjonell komponenter, 4E-bindende protein (p-4E-BP1) og S6 ble funnet å være nært forbundet med følsomhet for GDC0941 og AZD6244. I BxPC-3 celle xenografter, ble observert overlevelse forskjeller mellom kontroll og AZD6244, GDC0941, og kombinasjons grupper. Vår studie gir begrunnelsen for samtidig målretting av PI3K og MEK veier, uavhengig av KRAS-status, og antyder at fosforylering av 4E-BP1and S6 kan tjene som en prediktiv biomarkør for respons på behandling
Citation. Zhong H , Sanchez C, Spitrzer D, Plambeck-Suess S, Gibbs J, Hawkins WG, et al. (2013) synergieffekter av Concurrent blokkaden av PI3K og MEK Pathways i Bukspyttkjertelkreft Prekliniske Models. PLoS ONE 8 (10): e77243. doi: 10,1371 /journal.pone.0077243
Redaktør: Adriano Angelucci, University of L’Aquila, Italia
mottatt: 15 april 2013; Godkjent: 30 august 2013; Publisert: 09.10.2013
Copyright: © 2013 Zhong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Publikasjonen ble støttet av Washington University Institute of Clinical og Translasjonsforskerne Sciences Grant UL1TR000448 fra Nasjonalt Senter for Advancing Translasjonell Sciences (MCATS) og KL2TR000450. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreft dødsfall hos menn og kvinner i USA. Anslagsvis 43,140 mennesker ble diagnostisert med og 36 800 døde av kreft i bukspyttkjertelen i 2013 [1]. Mangelen på screeningmetoder og effektive terapeutiske midler gjør detektering og behandling av kreft i bukspyttkjertelen et vanskelig problem. Mens målrettede midler har blitt mainstream for andre typer kreft, i dag, har bare epidermal vekstfaktor reseptor inhibitor erlotinib fått godkjennelse fra Food and Drug Administration for behandling av bukspyttkjertelkreft [2]. Dessverre er den kliniske nytteverdien av erlotinib i stor grad begrenset på grunn av sin heller beskjeden klinisk nytte, noe som reflekterer en fortsatt haster å utvikle målrettede midler i bukspyttkjertelkreft.
Tilstedeværelsen av en KRAS mutasjon er sett hos 30% av premaligne lesjoner [3] og i opptil 90% av bukspyttkjertelkreft vevsprøver [4], noe som tyder på at KRAS mutasjon er den dominerende kjent trekk ved kreft i bukspyttkjertelen molekylære patogenesen. KRAS er en GTPase, og det konverterer ekstracellulære signaler til intracellulære signaler ved å sykle mellom den aktive (RAS-GTP) og inaktive (RAS-BNP) stater. Muterte KRAS resulterer i konstant aktivering av RAS veien ved å låse RAS inn i den aktive GTP-bindende tilstand og ytterligere utløser flere nedstrøms signalveier, inkludert celle proliferasjon, apoptose, differensiering og overlevelse [5]. Direkte målretting av KRAS har ikke vært vellykket hos pasienter med bukspyttkjertelkreft [6], så dagens forskningsinnsats har refocused på to nedstrøms veier, den phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT sti [7] og RAF /MEK sti [8 , 9].
Fordi cellesignale nettverk er sammensatt, er det bare å blokkere en mellommann er usannsynlig å resultere i en betydelig klinisk respons, med mindre den genetiske veksling gjengir målrettede «effektor» for å være en oncologically drevet hendelse. Dette er neppe tilfelle i KRAS nedstrøms trasé, illustrert av den svært lav forekomst av PIK3CA eller BRAF-mutasjoner i pankreastumorer [10]. Derfor har det vært en teori om at samtidig blokade i to parallelle veier som PI3K og MEK vil øke sjansen for å lykkes i å oppnå en klinisk relevant respons. Faktisk har synergistiske anti-tumoreffekter er observert når PI3K /AKT og MEK-trasé er begge hemmet i prekliniske tumormodeller [11], inkludert en KRAS mutert lungekreft modell [12].
GDC0941 er et oralt middel utviklet for å inhibere alle fire klasse І PI3K-isoformer [13]. Det har doseavhengig anti-tumor aktivitet mot glioblastom og human ovarian cancer xenografter [14]. GDC0941 har vist lovende anti-tumor aktivitet i prekliniske setting, og det blir nå testet ut i tidlig fase kliniske studier [14]. AZD6244 er en potent, selektiv sekundær generasjon MEK1 /2-hemmer, som hemmer MAPK /ERK i en ATP-Jaguaren mote [15]. Sammen med andre MEK-hemmere, er AZD6422 tiden i tidlige fase kliniske studier [16-18]. Prekliniske evalueringer av å kombinere et PI3K /AKT inhibitor og en MEK hemmer i bukspyttkjertelkreft dukker [19], og vår studie bekrefter at en synergistisk effekt oppstår når blokkere disse to veier. Videre har vi ytterligere illustrert at nytten av samtidig blokade er ikke KRAS genotype begrenset. I tillegg viser vår studie at oversettelsesprosessen, spesielt, aktivering av 4E-bindende protein 1 (4E-BP1) og S6 ser ut til å være assosiert med kreft i bukspyttkjertelen celler «fenotypisk respons mot hemmere.
Material og metoder
Cell Kultur og hemmere
bukspyttkjertelkreft cellelinjer, BxPC-3 (KRAS villtype), MIA Paca-2 (KRAS mutant), PANC-en (KRAS mutant) og CAPAN -2 (KRAS mutant) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og dyrket i et vekstmedium av enten DMEM (PANC-1, MIA PACA-2), RPMI-1640 (BxPC-3) eller McCoys 5A medium (CAPAN-2) supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 1 mM natrium pyruvat ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. Den PI3K inhibitor GDC0941 og MEK hemmer AZD6244 ble kjøpt fra Selleck Chemicals LLC (Houston, Texas, USA) og oppløst i dimetylsulfoksyd. Begge inhibitorer ble lagret ved -20 ° C.
celleviabilitet Assay
bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble sådd ut ved en tetthet på 3000 celler per brønn i en 96-brønners mikrotiterplate i vekstmedium og lov til å følge over natten. GDC0941 eller AZD6244 dose-respons ble bestemt ved behandling av kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer med 5 konsentrasjoner av medikamenter basert på en 10-gangers fortynningsserie. Cellenes levedyktighet ble bestemt 72 timer senere ved Alamar blå (Invitrogen, NY, USA) (570λ
Ex /580λ
Em) med et fluorescerende mikroplateavleser, og uttrykt som en prosentandel av medikamentbehandlede celler i forhold til kontroll ( ikke narkotika) celler. Data ble analysert ved bruk av GraphPad Prism programvare 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA), og doseresponskurven ble anvendt for å beregne konsentrasjonen av medikament som resulterer i 50% inhibering av cellelevedyktighet (IC
50) ved hjelp av en fire parametrisk logistisk modell. Alle analyser ble gjentatt fem ganger
For medikamentkombinasjonsstudier, den synergistiske virkning ble vurdert ved kombinasjonen indeksen (CI), i henhold til metoden ifølge Chou Talalay hvor synergisme er definert som CI 1, mens antagonisme er CI 1, og en additiv effekt er betraktet som CI = 1 [20]. Cellelinjer ble behandlet med GDC0941, AZD6244 eller en kombinasjon av GDC0941 og AZD6244, og antall levedyktige celler ble brukt til å beregne CI verdier ved hjelp CalcuSyn programvare (Biosoft, Cambridge, Storbritannia).
apoptose analysen
Omtrent 2 x 10
5-celler ble utsådd i 6-brønners plater i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av GDC0941, AZD6244 eller en kombinasjon av GDC0941 og AZD6244 i 72 timer. Cellene ble høstet med 0,25% trypsin, vasket med fosfatbufret saltvann (PBS), og samlet sammen ved sentrifugering. Cellene ble deretter farget med Annexin V-FITC og PI-løsning (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner og ble analysert med en FAC scan flowcytometer (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA) . Alle forsøk ble utført in triplo.
Western Blot Assay
Celler ble sådd i 6-brønns plater for
in vitro
analyser. Når cellene ble 70-80% sammenflytende, ble de inkubert med GDC0941, AZD6244 eller begge GDC0941 og AZD6244 i 24 timer. Deretter ble cellene vasket med kald PBS og lysert i RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoksykolat, 0,1%, SDS, 1 mM EDTA, proteasehemmere ). Supernatantene ble samlet etter ultralydbehandling og sentrifugering, og like mengder av protein ble underkastet elektroforese gjennom 4-12% Bis-Tris geler og overført til nitrocellulosemembraner (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Membranene ble blokkert med 5% ikke-fettholdig melk etter inkubering over natten med de passende primære antistoffer ved 4 ° C. Alle primære antistoffer ble inkubert i 5% bovint serumalbumin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Membranene ble vasket 3 ganger for å fjerne ubundet antistoff og så inkubert med et pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Membraner ble behandlet med forbedrede Chemiluminescence reagenser i henhold til produsentens protokoll (GE Healthcare Life Science, PA, USA). Primære antistoffer inkludert anti-fosfor-AKT (Ser473), anti-Akt, anti-fosfor-ERK (T202 /Y204), anti-ERK, anti-fosfor-S6 (S240 /244), anti-S6, anti-fosfo 4E-BP1 (S65) og anti-4E-BP1 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). ImageJ (freeware) ble brukt til å sammenligne tettheten av bandene og fullføre densitometrisk analyse.
In vivo studier
Nude mus, 4 eller 5 uker gammel, ble kjøpt fra National Cancer Institute. De ble akklimatisert i 1-2 uker før de ble utsatt for eksperimentelle prosedyrer. BxPC-3-celler (1×10
6) ble injisert subkutant (s.c.) inn i mus flankene. Tumorvolumene ble målt i to dimensjoner (lengde og bredde) av målepunkter før behandling og to ganger i uken, en gang behandling ble igangsatt. Mus ble også veid på disse tider, og vektendring ble beregnet ved den følgende Formulary: [1- (ny vekt /opprinnelige vekt)] x 100. Tumor-størrelse ble beregnet ved standardformelen av tumorstørrelsen = lengde x bredde
2 x 0,5. Mus som utviklet svulster rekkende 100-150 mm
3 i størrelse ble randomisert inn i følgende fire grupper med 8 mus i hver gruppe: kjøretøy, GDC0941, AZD6244, eller kombinasjonsbehandling. Begge medikamenter ble administrert én eller to ganger daglig ved oral tvangsforing i et volum på 10 ml /kg kroppsvekt. Legemidler ble oppløst i et kjøretøy på 0,5% (w /v) methycellulose /0,2% Tween 20 for administrering. Den PI3K inhibitor ble levert daglig ved en sluttkonsentrasjon på 50 mg /kg [14], mens MEK-inhibitor ble administrert to ganger daglig ved en sluttkonsentrasjon på 25 mg /kg [15]. Kontrolldyrene ble gitt et tilsvarende volum av 0,5% methycellulose /0,2% Tween 20 bare, to ganger daglig ved oral tvangsforing. Den behandlingsvarighet var 18 dager. Hvis musetumordiameter ble større enn 15 mm i løpet av behandlingen eller musens vekt redusert med 20% i forhold til sin opprinnelige vekt, vil musen avlives ved CO
2 overdose. Alle studiene ble utført i samsvar med protokollen er godkjent av Washington University Institutional Animal Care Facility (Protocol Nummer: 20100114).
Statistiske analyser
Cell levedyktighet data ble representert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD). Celle apoptose data og tumorvekstforsøk var representert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (s.e.m.). Kaplan-Meier-kurver ble anvendt for å overleve analyser. Statistiske sammenligninger ble gjort ved hjelp av ANOVA (enkeltfaktor) og t-test (paret to prøver for midler og uparet t-test), som angitt. En p-verdi på 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Samtidig hemming av PI3K og MEK har en synergistisk effekt på kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer vekst
in vitro
Å bestemme den anti-tumor aktivitet av PI3K og MEK-inhibitorer alene og i kombinasjon
in vitro
, fire bukspyttkjertelcancercellelinjer ble valgt for studien. BxPC-3 er en KRAS villtype bukspyttkjertelkreft cellelinje, mens de andre tre cellelinjer havn KRAS mutasjon. Alle fire cellelinjer er ikke kjent for å bære enten PI3K eller BRAF mutasjoner [21]. Den anti-proliferative effekt av PI3K eller MEK-inhibitor alene BxPC-3, MIA PACA-2, PANC-1 og CAPAN-2-celler ble målt ved Alamar blå. Bare veksten av BxPC-3 og MIA PACA-2-celler ble påvirket av GDC0941. Konsentrasjonene av GDC0941 som resulterer i 50% inhibering av cellelevedyktighet (IC
50) etter 72 timers eksponering var 376,4 nM i BxPC-3-celler og 754,6 nM på MIA PACA-2-celler (figur 1A). AZD6244 alene også undertrykt cellevekst med en IC
50 verdi av 599 nM og 375 nM i BxPC-3 og MIA PACA-2 celler, henholdsvis (figur 1B). IC
50 ble ikke oppnådd for PANC-1 og CAPAN-2-cellelinjer, og som et resultat, ble dette ansett for å være resistente cellelinjer. Vi observere en svak økning i PANC-1 celleveksten med GDC0941at 1 nM, 10 nM og 100 nM, men forandringene var ikke statistisk signifikant (kontroll vs 1 nM, p = 0,32, kontroll vs 10 nM, p = 0,17, kontroll vs. 100 nM , p = 0,22). I tillegg, sammenlignet vi kontroll vs 1 nM AZD6244 i PANC-1 og MIA PACA-2-celler, og ingen signifikante forskjeller ble observert (p = 0,20, p = 0,64, respektivt)
Celler ble behandlet med varierende konsentrasjoner av GDC0941 (A) eller AZD6244 (B) alene i 72 timer. Doser varierte fra 1 nM til 10 mikrometer.
Den anti-proliferativ effekt av å kombinere en PI3K og MEK inhibitor ble målt i BxPC-3 og MIA Paca-2 celler ved å beregne kombinasjonen indeks (CI) i henhold til Chou-Talalay-metoden (20) ved hjelp av et fast forhold dose. Begge GDC0941and AZD6244 ble introdusert til cellekulturer på 0,25 x 0,5 x 1 x, 2 x og 4 × sine respektive IC
50-tallet i BxPC-3 og MIA PACA-2 cellelinjer. Cellevekst i begge cellelinjene ble markert redusert etter kombinasjonsbehandling ved flere sammen konsentrasjoner sammenlignet med enten monoterapi alene. Data ble evaluert for å få CI under tilsvarende effektive dose (ED) i BxPC-3 og MIA PACA-2-cellelinjer (figur 2) ved CalcuSyn programvare. For BxPC-tre cellelinje følgende CI verdier ble oppnådd: 0,4101 (ED50), 0,0112 (ED75) og 0,0003 (ED90). For MIA PACA-2 cellelinje CI verdiene var 0,02052 (ED50), 0,0295 (ED75) og 0,0440 (ED95). De CI Resultatene antydet at GDC0941 og AZD6244 virket synergistisk for å frembringe en anti-proliferativ effekt i BxPC-3 og MIA PACA-2-cellelinjer (figur 2A-B).
BxPC-3 (A) og MIA Paca-2-celler (B) ble behandlet med GDC0941 alene, AZD6244 alene eller GDC0941-AZD6244 i kombinasjon. Resultatene ble analysert i henhold til Chou-Talalay metoden [18]. Kombinasjonen indeks (CI) verdiene ble beregnet ved hjelp CalcuSyn programvare. PANC-1 (C) og CAPAN-2-cellelinjen (D) ble behandlet med GDC0941 ved 400 nM, AZD6244 ved 200 nM eller kombinasjon. * P-verdi. 0,05 sammenlignet med kontroll eller monoterapi alene
Interessant, mens GDC0941 eller AZD6244 alene ikke påvirke PANC-en og CAPAN-2 cellevekst, administrasjon av disse to stoffene i kombinasjon mildt hemmet cellevekst. Cellevekst ble redusert til 71,4% og 67,0% i PANC-1 og CAPAN-2 cellelinjer, henholdsvis etter administrering av legemidler i kombinasjon (p 0,05, kombinasjonen sammenlignet med ubehandlet gruppe eller monoterapi alene) (Figur 2C- D).
Samtidig PI3K og MEK hemming indusere apoptose av kreft i bukspyttkjertelen celler linjene
in vitro
for å bestemme apoptotisk effekt av kombinasjonsbehandling, to forskjellige konsentrasjoner av GDC0941 og AZD6244 ble anvendt alene og i kombinasjon. Mens apoptose frekvensen av BxPC-3 celler ved baseline var 17,0%, økte betydelig til 34,0% og 47,8% etter administrering av GDC0941 på henholdsvis 380 nM og 1,520 nM konsentrasjoner (p 0,05, GDC0941 alene kontra ubehandlet gruppe). AZD6244 alene ved 600 nM og 2400 nM økt apoptose frekvensen av BxPC-3-celler til 26,5% og 27,2%, henholdsvis (p 0,05, AZD6244 alene vs ubehandlet gruppe). En kombinasjon av GDC0941 og AZD6244 resulterte i en mye høyere hastighet av apoptose i BxPC-3-celler sammenlignet med kontrollgruppen eller inhibitor alene. Kombinasjonen av GDC0941 ved 380 nM og AZD6244 ved 600 nM eller en kombinasjon av GDC0941 ved 1520 nM og AZD6244 ved 2400 nM økte BxPC-3-celle apoptose satsen til 63,3% og 82,8% henholdsvis (p 0,05, kombinasjonen sammenlignet med ubehandlede gruppen eller monoterapi alene) (figur 3A). Satsen for apoptose ved baseline i MIA PACA-2-celler var 8,0%, og den steg til 17,4% og 24,7% med GDC0941 administrert ved 400 nm og 1600 nM konsentrasjoner, henholdsvis (p 0,05, GDC0941 alene kontra ubehandlet gruppe). AZD6244 alene på 200 nM eller 800 nM økt apoptose satsen til 22,7% og 36,9%, henholdsvis (p 0,05, AZD6244 alene kontra ubehandlet gruppe). Kombinasjonen av GDC0941 ved 400 nM og AZD6244 på 200 nM eller en kombinasjon av GDC0941 ved 1600 nM og AZD6244 ved 800 nm økte MIA PACA-2 apoptose satsen til 49,5% og 55,6%, henholdsvis, og dette var en statistisk signifikant forskjell sammenlignet til den ubehandlede gruppe eller enkelt middel alene (p 0,05) (figur 3B). For resistente cellelinjer PANC-1 og CAPAN-2, mens ingen middel alene hadde en betydelig innvirkning på apoptose, kombinasjonen av PI3K og MEK-inhibitor resulterte i en apoptose hastighet på 31,8% i PANC-1-celler; dette var statistisk signifikant sammenlignet med en 14,0% apoptose hastighet i disse celler uten behandling, eller med en enkelt inhibitor (p 0,05) (figur 3C). Kombinere GDC0941 og AZD6244 også betydelig økt apoptose raten i CAPAN-2 celler til 41,3%, sammenlignet med 12,2% uten behandling eller med monoterapi alene (p 0,05). (Figur 3D)
Bukspyttkjertelkreft celle linjer ble behandlet med GDC0941 alene, AZD6244 alene eller GDC0941-AZD6244 i kombinasjon i 72 timer. Celle apoptose ble detektert ved strømningscytometri. A, B: kombinasjoner vs. ubehandlede grupper (* P-verdiene 0,05), kombinasjoner vs. enkle midler (* P-verdiene 0,05), enkle midler vs. ubehandlede grupper (* p-verdier og lt; 0,05). C, D: kombinasjoner vs. ubehandlede grupper (* p-verdi 0,05) og kombinasjoner vs. enkle midler (* p-verdi 0,05)
Effekter av PI3K og MEK hemninger på cellesignalering.
for å vurdere effekten av både narkotika på nedstrøms effektorer av PI3K og MEK trasé, brukte vi Western blot analyse for å observere total protein uttrykk og fosforylering status. De totale protein nivåer av ERK, S6 og 4E-BP1 forble uendret etter behandling med GDC0941 og AZD6244 i hver cellelinjer (figur 4). p-ERK, p-S6 og p-4E-BP1 syntes å være undertrykt av GDC0941 og AZD6244 kombinasjonsbehandling. Imidlertid observerte vi forandringer i AKT uttrykk følgende kombinasjon medikamentell behandling, og densitometrisk analyse ble brukt for å kvantifisere de ekspresjonsnivåene. Vi brukte forholdet mellom p-AKT /AKT produseres fra hver dose for sammenligning. Etter at p-AKT /AKT nivåer av behandlingsgruppene var normalisert til forholdet mellom den ubehandlede gruppen ble kombinasjonsbehandling observert å undertrykke p-AKT nivåer med 90% i BxPC-3 cellelinjen, med 6% i MIAPaCa-2- cellelinje, med 29% i PANC-1 cellelinjen, og med 8% i CAPAN-2-cellelinjen. Kombinasjonen av begge legemidler redusert p-ERK (T202 /Y204), p-AKT (S473), p-S6 (S240 /244) og p-4E-BP1 (S65) ekspresjon sammenlignet med grunnlinjen i alle cellelinjene som ble testet. Selv om p-AKT og p-ERK-nivåer ble uttrykt forskjellig i de fire cellelinjer, vår studie viste at utgangsnivået av p-AKT ikke forutsi respons til PI3K-inhibitor, heller ikke baseline p-ERK nivåer forutsi respons til MEK inhibitor.
Alle fire bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble behandlet med den GDC0941-AZD6244 kombinasjon for 24 timer, ble Cellelysater deretter høstet for å påvise p-AKT (S473) /AKT, p-ERK (T202 /Y204) /ERK, p-S6 (S240 /244) /S6 og p-4E-BP1 (S65) /4E-BP1.
For å forstå de fenotypiske forskjeller sett i MIA PACA-2 (sensitive til GDC0491 og AZD6244) og PANC-en (motstandsdyktig mot GDC0491 og AZD6244) cellelinjer, som begge er bærere av KRAS-mutasjon, undersøkte vi forskjellene i sine nedstrøms effektorer følgende GDC0941 og AZD6244 administrasjon (figur 5). I begge cellelinjer, GDC0941 trykkes fosforylering av AKT, redusert AZD6244 p-ERK nivåer, og kombinasjonen av de to medikamenter undertrykte både p-AKT og p-ERK nivåer. GDC0941 og AZD6244 hadde en lignende virkning på AKT og ERK i de to cellelinjene. Interessant, effekten fra begge hemmere på p-S6 og p-4E-BP1 nivåer var alternativt cellelinje bestemt. For eksempel, GDC0941 og AZD6244 alene og i kombinasjon markert inhibert p-S6 og p-4E-BP1expression nivået i MIA PACA-2-celler, sammenlignet med den minimale suppresjon observert i PANC-1 celler (figur 5). Verken GDC0941 eller AZD6244 alene trykt p-S6 og p-4E-BP1 i Panc-1 celler, noe som tyder på at begge effektbokser kan tjene som biomarkører knyttet til behandlingsrespons. Uttrykket nivåer av p-S6 og p-4E-BP1 ble signifikant undertrykt av kombinasjonsbehandlingen på MIA PACA-2-celler, og dette var i samsvar med den cellelinje er fenotypiske responser mot kombinasjonsbehandling.
Både MIA PACA -2 og PANC-1-celler ble behandlet med 400 nm GDC0941, 200 nM AZD6244 eller en kombinasjon ved disse dosene i 24 timer. Celle proteiner ble deretter høstet for å påvise p-AKT (S473) /AKT, p-ERK (T202 /Y204) /ERK, p-S6 (S240 /244) /S6 og p-4E-BP1 (S65) /4E-BP -1.
Anti-tumor Effekter av PI3K og MEK hemninger
in vivo.
for å påvise effekten av GDC0941 og AZD6244 på tumorvekst
in vivo
, brukte vi GDC0941, AZD6244, og en kombinasjon av GDC0941and AZD6244 for å behandle BxPC-3-xenograft mus i 18 dager. Sammenlignet med kontrollen (bærer) gruppe, tumorvolumer signifikant redusert i AZD6244 og kombinasjons gruppene (p = 0,037 og p = 0,032, respektivt), men ikke i den GDC0941group sammenlignet med kontroll (figur 6A). Basert på Kaplan-Meier-kurver (figur 6B), var det en statistisk signifikans forskjell i overlevelse mellom de fire gruppene (p = 0,005)
A.: 1 x 10
6 BxPC-3 kreft i bukspyttkjertelen celler ble injisert sc inn i den høyre flanken av kvinnelige nakne mus. Mus mottok bærer (0,5% metylcellulose /0.2% Tween-20), 50 mg /kg GDC0941 QD, 25 mg /kg AZD6244 ganger daglig, eller 50 mg /kg GDC0941 QD pluss 25 mg /kg AZD6244 ganger daglig oralt i 18 dager. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. * P-verdiene ble bestemt ved uparet t-test. B:. Kaplan-Meier overlevelseskurver av xenografter mottar kjøretøy, GDC0941 alene, AZD6244 alene og GDC0941-AZD6244 i kombinasjon
Diskusjoner
Selv om målrettet terapi er blitt en mainstream tilnærming for kreft behandling, har den kliniske utviklingen av målrettede agenter i kreft i bukspyttkjertelen ikke vært vellykket. På grunn av den høye frekvensen av KRAS mutasjoner i kreft i bukspyttkjertelen, har KRAS vært direkte målrettet i prekliniske og kliniske studier, men resultatene har vært skuffende. I lys av disse utfordringene, har forskningsinnsats refocused på målretting Kras nedstrøms trasé, PI3K og MEK. Fordelen med å blokkere et enkelt reaksjonsvei er i stor grad begrenset ved tilstedeværelsen av en kompenserende tilbakekoblingssløyfe mellom PI3K og MEK. For eksempel kan inhibering av MEK-reaksjonsveien resulterer i aktivering av PI3K veien [11], og PI3K aktivering formidler resistens overfor inhibering MEK [22]. For å omgå dette kompenserende tilbakemeldinger, har samtidig blokade av de to veier blitt testet, og synergi i anti-tumor effekter ble påvist, og gir begrunnelsen for fase I kliniske studier. Dessuten har tidlige tegn på klinisk fordel blitt rapportert ved avansert kreft ved en retrospektiv analyse på pasienter som får midler som er rettet mot begge veier [23].
I motsetning til å arbeide i andre typer svulster, prekliniske evalueringer av downregulating både trasé i bukspyttkjertelkreft har vært begrenset [19,24]. Vår studie er viktig i flere aspekter. Først har vi vist at sensitiviteten av bukspyttkjertelkreft cellelinjer mot enten PI3K eller MEK-hemmere er ikke KRAS avhengig. Mens ulik i KRAS-status, BxPC-3 og MIA PACA-2 celler har villtype PI3K og PTEN, og begge var følsomme for både hemmere, som er konsistent med tidligere publiserte rapporter [22,25]. For det andre, vår studie viste at PI3K og MEK-hemning, enten alene eller i kombinasjon kan indusere apoptose. I det siste, var narkotika målretting PI3K eller MEK tenkt å ha mer av en cytostatisk effekt, men fersk rapport tyder på at denne effekten er apoptotisk [26] For det tredje har vår studie vist synergi i undertrykkelse av cellevekst og induksjon av apoptose i to sensitive cellelinjer (BxPC-3 og MIA Paca-2) med kombinasjonsregimet. Videre ble mild inhibering i cellevekst og induksjon av apoptose observeres med medikamentkombinasjonen i resistente cellelinjer (PANC-1 og CAPAN-2). Selv om graden av nytte av kombinasjonsbehandlingen var beskjeden for begge resistente cellelinjer, er ytterligere forståelse av denne fordelen garantert for denne ødeleggende sykdommen. Vår undersøkelse støtter en lignende studie i preklinisk kreft i bukspyttkjertelen som viste at fordelen med behandling av en MEK-inhibitor ble forbedret med en AKT-inhibitor [24].
Et avgjørende element i målrettet terapi utvikling er å bestemme molekylære markører som forutsier behandlingsrespons. PI3K pathway endringer inkludert HER2 amplifikasjon PI3KCA mutasjoner eller PTEN tap har blitt funnet å være assosiert med følsomhet for GDC0941 i brystkreft cellelinjer
in vitro Hotell og
in vivo product: [27]; imidlertid de ovennevnte genetiske vekslingene er sjelden tilstede i pankreatiske tumorer [21]. Vår studie tyder på at nedstrøms p-AKT trykt av GDC0941 ikke forutsi celle følsomhet, og heller ikke downregulated p-ERK forutsi følsomhet for AZD6244. Denne observasjonen er i samsvar med tidligere rapporter [27].
For ytterligere å forstå de molekylære hendelser etter samtidig blokade i begge KRAS muterte cellelinjer, sammenlignet vi protein uttrykk i PANC-en (resistent) og MIA PaCa- 2 (sensitive) cellelinjer. Disse to cellelinjer ulik fenotypisk respons på PI3K og ERK-hemmere, til tross for husing lignende store genetiske alter. Begge cellelinjene er rapportert å inneholde KRAS mutasjoner, p53-mutasjoner, villtype-P16 og villtype DPC-4 [21]. Mens i vårt studium vi demonstrert at suppresjon av p-AKT av PI3K-inhibitor og p-ERK ved MEK-inhibitor ble oppnådd i begge cellelinjer, PANC-1-celler opplevde bare en minimal undertrykkelse av p-S6 og p-4E-BP1 ved behandling med enten PI3K eller MEK-inhibitor alene. Disse funnene tyder på at PI3K eller MEK-hemmere alene er i stand til å undertrykke sin umiddelbare tilsvar nedstrøms meklere (AKT og ERK) i Panc-1 celler, men er ikke i stand til å nedregulere de videre nedstrøms formidlere (p-S6 og p-4E-BP1 ). Begge markører, derfor er nært forbundet med følsomhet for både PI3K og MEK-hemmere. I et komplekst signaleringsnett, en målrettet middel evne til å hemme fosforyleringen prosessen med nedstrøms mål ofte ikke overs til fenotypiske forandringer. For eksempel, Serra et al har rapportert identifisering av noen gener som kan fremme cellulær overlevelse i sammenheng med PI3K blokade, og blant disse genene, kinaser ribosomal S6 RPS6KA2 (RSK3) og RPS6KA6 (RSK4) er videre er validert for å bidra til PI3K motstand
in vitro Hotell og
in vivo
gjennom demping av apoptotiske prosessen og oppregulering av protein oversettelse [28]. Vår observasjon resonerer med nye bevis på at nedstrøms cap-avhengige oversettelse kan være en bedre indikator på svar på disse målrettede midler [29,30].
4E-BP1 spiller en stor rolle i cap-avhengige oversettelse. Det binder seg til elF4E-mRNA cap komplisert å hemme cap-avhengige oversettelse, og fosforylert 4E-BP1 faller deretter ut av oversettelsen komplekse, så initiering av oversettelse kan begynne [31]. mTORC1, en effektor nedstrøms av PI3K vei, kan fosforylere 4E-BP1 å initiere oversettelsesprosessen [32]. Det avgjørende rolle 4E-BP1 som en nøkkel effektor av AKT og ERK signalveier i svulster er elegant studert ved Hun et al [29]. Dessuten har høye ekspresjonsnivåer av 4E-BP1 blitt funnet å ha prognostisk verdi i flere tumortyper [33-37]. Derfor bør videre utforskning av målretting 4E-BP1 bli utforsket i fremtiden for flere krefttyper, inkludert, og spesielt, kreft i bukspyttkjertelen.
I sammendraget, har vi utforsket nytte av samtidige vei blokade av PI3K og MEK hemmere alene og i kombinasjon for kreft i bukspyttkjertelen. Synergy i avtagende cellevekst ble observert og effekten var ikke KRAS avhengig. Vedvarende fosforylering av S6 og 4E-BP1 så ut til å være assosiert med resistens overfor de PI3K og MEK-inhibitorer. Fremtidige undersøkelser i de alternative mekanismer for 4E-BP1 fosforylering og målretting av 4E-BP1 i bukspyttkjertelkreft er garantert.
