Abstract
XB130, en roman adapter protein, formidler RET /PTC kromosom omorganisering relaterte skjoldbrusk kreft celle spredning og overlevelse gjennom phosphatidyl Inositol-3-kinase (PI3K) /Akt pathway. Nylig, XB130 ble funnet i forskjellige kreftceller i fravær av RET /PTC. For å avgjøre om RET /PTC kreves av XB130 relaterte kreftcelle spredning og overlevelse, WRO skjoldbruskkjertelen kreftceller (med RET /PTC-mutasjon) og A549 lungekreftceller (uten RET /PTC) ble behandlet med XB130 siRNA, og flere Akt ned -stream signalene ble undersøkt. Banket ned av XB130 inhiberte G
1-S-fasen progresjon, og induserte apoptose spontan og forbedret indre og ytre stimulus apoptotisk celledød. Banket ned av XB130 redusert fosforylering av p21Cip1 /WAF1, p27Kip1, FOXO3a og GSK3p, økt p21Cip1 /WAF1protein nivåer og splittelser av caspase-8 og-9. Imidlertid fosforyleringen av FOXO1 og protein nivåer av p53 ble ikke påvirket av XB130 siRNA. Vi har også funnet XB130 kan bli fosforylert ved multiple protein tyrosin-kinaser. Disse resultatene indikerer at XB130 er et substrat av flere protein-tyrosin-kinaser, og det kan regulere celleproliferering og overlevelse gjennom modulering av den valgte ned-strøm signaler med PI3K /Akt pathway. XB130 kunne være involvert i vekst og overlevelse av ulike kreftceller
Citation. Shiozaki A, Shen-Tu G, Bai X, Iitaka D, De Falco V, Santoro M, et al. (2012) XB130 som megler Cancer Cell Proliferation og Survival gjennom flere signalerings Hendelser nedstrøms Akt. PLoS ONE 7 (8): e43646. doi: 10,1371 /journal.pone.0043646
Redaktør: Laszlo Buday, ungarske Academy of Sciences, Ungarn
mottatt: 23. mars 2012; Godkjent: 24 juli 2012; Publisert: 23 august 2012
Copyright: © Shiozaki et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av driftstilskudd (MOP-13270 og MOP-42546) fra kanadiske Institutes of Health Research, stipendiat Awards fra Uehara Memorial Foundation og International Society of Heart og lungetransplantasjon for Dr. Atsushi Shiozaki og av Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
XB130 er en nylig oppdaget adapter protein for intracellulær signaloverføring; Det er involvert i genregulering, celleproliferasjon, celleoverlevelse, cellemigrasjon, og tumorigenesis [1]. Menneskelig
xb130
genet ble oppdaget under kloning prosessen av menneskelig
afap
genet [2], [3], [4]. Det koder for 818 aminosyrer med en tilsynelatende molekylstørrelse på omtrent 130 kDa. Den overordnede strukturen av XB130 aksjer likhet med AFAP dermed er også kjent som AFAP1 som protein 2 (AFAP1L2). Som en adapter protein, det N-terminale område av XB130 omfatter flere tyrosin-fosforyleringsseter og prolin-rik sekvens, noe som potensielt kan interagere med SH3 SH2 og domene-inneholdende proteiner, respektivt. Den midterste delen havner to pleckstrin-homologi (PH) domener som kan målrette proteiner til cellulære membraner gjennom interaksjon med spesifikke fosfolipider. Den C-terminale regionen inneholder en kveil-spiral domene, som kan være involvert i protein oligomerisering og DNA-bindings [4]. XB130 kan samhandle og aktivere c-Src tyrosinkinase, som fører til forhøyet tyrosinfosforylering av multiple proteiner, inkludert XB130, og transaktivering av AP-1 og SRE [4]. I løpet av cellemigrering, regulerer actin XB130 cytoskjelettet omordning som vist ved dets trans til celle periferien i lamellipodia. Dempe endogene XB130 kan føre til en reduksjon i prisen for sårheling, hemme Matrigel invasjonen, og redusere lamellipodial utholdenhet og cellespredning, noe som tyder på at det spiller en viktig rolle i cellen motilitet og invasjon [5].
XB130 er involvert i kreft i skjoldbruskcellevekst og overlevelse [1]. Skjoldbruskkjertelkreft er en type av endokrin malignitet, som innebærer flere genetiske og epigenetiske forandringer som fører til MAPK og PI3K /AKT-signalveien aktivering [6], [7], [8]. En vanlig mutasjon som finnes i skjoldbruskkjertelen er RET /PTC kromosomavvik rearrangements. Produktet RET /PTC er et protein som fremstilles fra kromosomal omleiring med kombinasjonen av 3′-delen av RET-genet og 5′-delen av en partner genet. Dette resulterer i en konstitutivt aktivert tyrosinkinase, RET /PTC [9]. RET /PTC utstillinger trans evne via utføring differensiering, mitogen og metastatisk potensial i skjoldbruskkjertelkreft [10], [11]. RET /PTC fører til en robust tyrosinfosforylering av XB130, som fremmer tilknytningen med p85α subenheten av fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K). Dette i sin tur aktiverer Akt. Nedregulering av XB130 i TPC1 papillære thyroid kreft celler, husing RET /PTC-kinase, sterkt redusert Akt-aktivitet, cellesyklusprogresjon og celleoverlevelse [12]. Videre er det i WRO celler, en annen skjoldbruskkjertelkreft cellelinje med RET /PTC-mutasjonen [13], celler som er stabilt transfektert med XB130 shRNA redusert tumorvekst i nakne mus. Microarray studie funnet ut at flere gener som reguleres av XB130 er relatert til celleproliferasjon eller overlevelse, inkludert mange transkripsjons regulatorer [14].
Siden XB130 er sterkt uttrykt i skjoldbruskkjertelen, har det blitt spekulert å være en skjoldbrusk-spesifikk tyrosin kinase substrat. Nylig har vi funnet uttrykk for XB130 i spiserørskreft [15], og i andre kreftcellelinjer. I foreliggende studie forsøkte vi å fastslå om XB130 spiller en rolle i cancerceller er uavhengig av tilstedeværelsen av RET /PTC. Videre, selv om PI3K /AKT-reaksjonsveien er blitt identifisert som viktige for XB130-mediert celle proliferasjon og overlevelse, nedstrømssignalene til Akt er ennå ikke fastslått. Følgelig studerte vi disse hendelsene med WRO-celler, en human thyroid kreft cellelinje med RET /PTC-omleiring, og A549, en human cellelinje adenocarcinoma lunge uten RET /PTC.
Materialer og metoder
cellelinjer, antistoffer og andre reagenser
Menneskelige follikulær skjoldbruskkjertelen carcinoma WRO celler (fastsatt av Dr GJF Juillard, University of California-Los Angeles School of Medicine, Los Angeles, CA, USA) ble opprettholdt i RPMI 1640, supplert med 10% FBS, 1 mM pyruvat og ikke-essensielle aminosyrer (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, USA) [13]. Humane lunge adenokarsinom A549-celler, oppnådd fra ATCC (CCL-185, Manassas, VA) [16], ble dyrket i DMEM-medium, supplert med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, og 1% glutamin. Celler ble dyrket i et standard fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO
2.
Ekspresjonsvektorer for RET /PTC3, aktiverte versjoner av ABL og SRC [17], eller EGFR og ErbB2 [18 ], som er aktivert ved overekspresjon er beskrevet andre steder. Monoklonalt XB130 antistoff ble generert som beskrevet tidligere [4]. Antistoffer for fosfor-Akt (Ser473), Akt, fosfor-GSK-3β (Ser9), p21Cip1 /WAF1, p27Kip1, p53, fosfor-FoxO3a (Thr32), FoxO3a, fosfor-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185), SAPK /JNK, fosfor-p38 MAPK (Thr180 /Tyr182), p38 MAPK, fosfor-P44 /42 MAPK (Thr202 /Try204), phosho-Src (Try416) var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA); monoklonale anti-fosfotyrosin antistoff fra Upstate Bioteknologi Inc. (Lake Placid, NY, USA) og anti-c-myc tag (sc-40) var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffer for GAPDH, ERK1, fosfor-p21 (Thr145), caspase-8 og caspase-9 var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Anti-PCNA antistoff var fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Anti-Ki-67, klone Ki-S5, var fra Chemicon (Temecula, CA, USA). Anti-Src (GD11) og anti-Fas mAb (klone CH11) var fra Upstate Bioteknologi Inc. (Lake Placid, NY, USA). Anti-Phospho-p27Kip1 antistoff (Thr157) var fra R D Systems Inc. (Minneapolis, Minnesota, USA). Anti-p85α av PI3K antistoff var fra BD PharMingen (San Diego, California, USA). Staurosporin var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Protein Studies
immunblotting eksperimenter ble utført i henhold til standard prosedyrer som er beskrevet tidligere [2], [3]. I korthet ble cellene lysert med modifisert Radioimmun nedbør analysebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EGTA, 2 mM EDTA og 1% Triton X-100) inneholdende 10 ug /ml hver aprotinin, leupeptin, pepstatin, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 1 mM Na
3VO
4, og 10 mM NaF. Proteinkonsentrasjonen ble målt med et modifisert Bradford assay (Bio-Rad, Munchen, Tyskland). Cellelysater inneholdende tilsvarende mengde av de totale proteiner ble separert ved SDS-PAGE og deretter overført på nitrocellulosemembraner (Schleicher 0,05 (sammenlignet med kontroll siRNA). (C) Redusert Ki67 og PCNA nivåer i XB130 siRNA behandlet WRO og A549-celler, som bestemt ved Western blotting.
n
= 3. *
p
0,05 (sammenlignet med kontroll siRNA behandlede gruppen). (D) Tilstedeværelse av RET /PTC omorganisering ble bekreftet i både TPC-en og WRO celler ved hjelp av RT-PCR. A549 celler inneholder ikke RET /PTC omorganisering.
XB130 Controls Survival of Cancer Celler
For å finne ut hvilken rolle XB130 i kreftcelleoverlevelse, behandlet vi WRO og A549 celler med XB130 siRNA og brukt flowcytometri å kvantifisere og å diskriminere mellom ytre (død reseptor mediert) apoptotiske sti, og den indre (mitokondrielle mediert) apoptotiske sti [23]. Nedregulering av XB130 indusert tidlig apoptose (Annexin V positiv /negativ PI) i WRO celler ved 48 timer etter transfeksjon av siRNA (fig. 2A). Videre XB130 siRNA forbedret extrinsic (fasab, klon CH11, 100 ng /ml) og indre (staurosporin, 200 nM) apoptotisk stimulus-fremkalt tidlig og sen apoptose (Annexin V /PI dobbel positiv) (Fig. 2A). På den annen side, i A549-celler dyrket i medium inneholdende 10% FBS, ble nedregulering av XB130 ikke forbedre spontan heller staurosporin-eller fasab-indusert celledød, selv ved 500 ng /ml fasab (fig. S1A) . Videre, kombinert bruk av fasab (500 ng /ml) og IFN-γ (100 ng /ml), en tilstand som tidligere er blitt rapportert å indusert celledød i en rekke andre celletyper [24], [25], ikke gjorde indusere apoptose i A549-celler (fig. S1B). Western blotting avslørte at ekspresjonen av endogene Fas i A549 celler er enda høyere enn i WRO-celler (fig. S1C). Men under serumfrie tilstand, XB130 siRNA behandling forbedret staurosporin-indusert apoptose tidlig i A549-celler (Fig. 2B). Disse funnene indikerer at A549 cellene er resistente mot både ytre og egen medierte apoptotiske signaler. Likevel er XB130 involvert i celleoverlevelse i begge cellelinjer i henhold til avvikende forsøksbetingelser.
(A) Nedregulering av forsterket spontan XB130 og indusert celledød av WRO celler dyrket med 10% FBS. Celler transfektert med kontroll eller XB130 siRNA ble behandlet med staurosporin (STS, 200 nM), eller Fas-antistoff (fasab, klon CH11, 100 ng /ml) i 24 timer. Apoptose ble bestemt ved flowcytometri hjelp PI /Annexin V dobbel farging. (B) Nedregulering av forsterket XB130 staurosporin-indusert apoptose i serumfritt tilstand i A549-celler. A549-celler transfektert med kontroll eller XB130 siRNA ble inkubert i serumfritt medium med eller uten 200 nM STS i 24 timer.
n
= 6. Mean ± SEM. *
p
0,05 (sammenlignet med kontroll siRNA). (C) XB130 kan fosforyleres av andre enn RET /PTC-protein-tyrosin-kinaser. Immunoutfelling med anti-myc antistoff i HEK293 celler transfektert med myc-merket XB130, sammen med RET /PTC3, EGFR, Src, Abl, eller erbB2, viste en økning i XB130 tyrosinfosforylering ved anvendelse av anti-fosfotyrosin-antistoff.
Selv om A549 cellene ikke har RET /PTC, andre endogene PTK kan fosforylere XB130. Følgelig har vi vist dramatisk protein-tyrosin-fosforylering i A549-celler, som kan effektivt reduseres ved SRC-inhibitor, PP2 [26]. For å teste om hvorvidt andre proteinkinaser kan fosforylere XB130 i tyrosin, HEK293-celler, en cellelinje som vanligvis brukes til å teste protein-protein interaksjon, ble transfektert med myc-merket XB130 sammen med RET /PTC3 som en kontroll, eller andre membran-bundet ( EGFR, ErbB2) eller cytosolic (SRC, ABL) tyrosin kinaser. Cellelysater ble immunoutfelt med anti-myc antistoffet og blottet med anti-fosfotyrosin-antistoff. Selv på ulike nivåer, alle protein tyrosin kinaser co-uttrykt med XB130 økt sin tyrosinfosforylering (Fig. 2C).
XB130 binder seg til p85α subenhet av PI3K og kontroller Akt aktivitet i kreftceller
de to kjente signalkaskade som er implisert i regulering av celleprogresjon og overlevelses via protein-fosforylering er de PI3K /Akt og p38 MAPK trasé [7]. Vi testet nøkkelsignalkomponenter i disse to reaksjonsveier, og fant at fosforyleringen Src, JNK og ERK ikke ble påvirket i XB130 siRNA behandlede celler (fig. S2). Videre fosforylering av p38 ble også signifikant økt etter XB130 Siran behandling i WRO-celler (fig. S2), noe som ytterligere utelukke muligheten for p38 som en ned-strøm-signal som formidler XB130 relaterte celle-proliferasjon og overlevelse.
Vi har tidligere vist at XB130 regulere skjoldbruskkjertelkreft cellesyklusprogresjon og overlevelses gjennom dets interaksjon med PI3K, som fører til aktivering av Akt. XB130 har en YxxM motiv i den N-terminale enden som starter ved den tyrosin 54 som kan binde til enten den N-eller C-terminale SH2 domene av p85α-subenheten av PI3K (fig. 3A), som demonstrert av GST-fusjonsprotein pull -ned-analyser, co-immunoutfellingsstudier, fosfor-peptid konkurranse, og bruk av XB130 mutanter [12]. Nylig bindingen mellom XB130 og P85 ble også rapportert av Yamanaka et al. i rotte tyroid FRTL-5-celler med Moldi-TOF-MS-analyse [27]. I begge WRO og A549 celler, ble binding mellom XB130 og p85α subenhet av PI3K vist av co-immunoprecipitation (Fig. 3A). Akt er en nedstrøms mål for PI3K, og dets fosforylering ved Ser 473 er en følsom indikator for Akt-aktivitet [28]. XB130 siRNA effektivt redusert XB130 protein nivåer; et fenomen assosiert med redusert fosforylering av Akt i både WRO og A549-celler (fig. 3B).
(A) Skjematisk fremstilling av proteinstrukturer av XB130 og p85α underenhet av PI3K. Interaksjoner av XB130 med p85α ble oppdaget av co-immunoprecipitation i WRO og A549 celler. (B) XB130 siRNA effektivt redusert XB130 protein nivåer og Akt fosforylering i WRO og A549 celler. siRNA transfekterte celler ble høstet ved 48 timer etter transfeksjon.
n
= 5. *
p
0,05 (sammenlignet med kontroll siRNA)
XB130 Controls Cancer cellecyklusprogresjonen og Survival via Multiple Akt Down Stream. molekyler
p27Kip1 og p21Cip1 /WAF1 er involvert i regulering av cellesyklusutvikling ved hemming av cyklin-avhengige kinaser CDK1 og CDK2. Den cyclin-avhengig kinase inhibitor p27Kip1 kjernetranslokasjon kan føre G1 arrest; Akt er i stand til å fosforylere p27Kip1, og dermed blokkere translokasjon og funksjon [29], [30], [31]. Cyklin-avhengig kinase inhibitor p21Cip1 /WAF1 kan negativt modulere cellesyklusprogresjon ved å hemme aktiveringen av cyclin /cdk2-komplekset [32]. Aktivering av Akt kan også phosphorylate p21Cip1 /WAF1 og holde den i cytoplasma, som kan være avgjørende for celleoverlevelse [33]. Etter XB130 siRNA behandling, ble fosforylering av p27Kip1 og p21Cip1 /WAF1 betydelig redusert i både WRO og A549 celler (fig. 4A og B).
(A og B) nedregulering av XB130 redusert fosforylering av p21 og p27, og økt ekspresjon av p21 i WRO og A549-celler. Uttrykk for p27 og p53 ble ikke påvirket av nedregulering av XB130. (C og D) nedregulering av XB130 redusert phosphorylations av FOXO3a og GSK3p i WRO og A549 celler.
n
= 4. *
p
. 0,05 (sammenlignet med kontroll siRNA)
nedregulering av XB130 også betydelig økt det totale proteinnivå p21Cip1 /WAF1 (fig. 4A og B). FOXO3a kan binde seg til og aktivere formidler av p21Cip1 /WAF1, som har gaffelhode bindende elementer i tilknytning til en SMAD bindende element. PI3K /Akt mediert FOXO3a fosforylering kan føre til sin eksport fra kjernen og deretter hindre p21Cip1 /WAF1 genuttrykk [34]. Den XB130 knockdown redusert fosforylering av FOXO3a (Thr32), uten å påvirke den totale FOXO3a nivåene (fig. 4C og D). Dette reduserte fosforylering av FOXO3a kan bidra til å øke p21Cip1 /WAF1 uttrykk. Blant FOXO familiemedlemmer, er FOXO1 kjent for å stimulere transkripsjon av p27Kip1 [35]. Den XB130 knockdown var ikke i stand til å endre fosforylering av FOXO1 (Thr24) og FOXO1 (Ser256) (data ikke vist). Sammentreffet, XB130 siRNA behandling hadde ingen virkning på p27Kip1 proteinnivåer i begge cellelinjer (Fig. 4A og B).
En annen mekanisme hvorved Akt kan fremme celleproliferasjon er til å fosforylere og inaktivere GSK3P, og dermed beskytte cyklin D1 , styrke CDK4 /CDK6 aktivitet, og lette celle inntreden i S-fasen av cellesyklusen [36]. Fosforylering av GSK3P ble redusert etter XB130 siRNA behandling (fig. 4C og D). Svulsten suppressor protein p53 er en transkripsjonsfaktor som kan indusere enten vekst arrest eller apoptose. Nivåene og aktiviteter er i hovedsak styrt av MDM2, som kan binde p53 direkte og fremme sin ubiquitinering og degradering. Akt kan fosforylere MDM2 og dermed øke p53 degradering [37]. Nedregulering av XB130 med siRNA imidlertid ikke påvirke p53-nivåer.
Akt kan hemme apoptose gjennom flere mekanismer. For eksempel, er Akt i stand til å fosforylere procaspase-9, hindrer dens spalting inn i den pro-apoptotiske caspase-9, som medierer indre signal initiert apoptose [38]. Inhibering av Akt forbedret TRAIL-indusert aktivering av kaspase-8, som medierer ytre signal initiert apoptose [39]. Nedregulering av XB130 øket spaltning av caspase-8 og caspease-9 i WRO celler (Fig. 5A og B). I A549-celler, nedregulering av XB130 redusert procaspase-8-nivå og økt spaltet caspase-9 (Fig. 5A og B). Aktivering (spalting) av caspase-8 og caspase-9 er essensielle trinn for ytre og indre trasé av celledød, henholdsvis [23]. Dette kan forklare hvorfor både ytre og indre signal indusert celledød ble forbedret ved XB130 siRNA behandling.
(A og B) spaltes fragmenter av både caspase-8 og-9 ble tydelig øket ved å slå ned av XB130 i WRO celler. I A549-celler, nedregulering av XB130 redusert procaspase-8 og økt spaltet caspase-9.
n
= 4. Mean ± SEM. *
p
. 0,05 (sammenlignet med kontroll siRNA)
Fosforylering av p21Cip1 /WAF1 av Akt kan resultere i sin cytoplasma akkumulering og fremmer celle overlevelse [40]. Gaffelhode familie transkripsjonsfaktorer kan utløse apoptose ved å indusere uttrykket av gener som er kritiske for celledød, for eksempel Bim og Fas-ligand, [41], [42]. Akt kan fosforylere FOXO3a, å blokkere trans fra cytoplasma til kjernen [41]. Således, nedregulering av XB130 med siRNA redusert fosforylering av p21Cip1 /WAF1 (Fig. 4A og B) og FOXO3a (fig. 4C og D). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at XB130 er involvert i regulering av celleproliferasjon og overlevelse via flere molekyler ned-stream av PI3K /Akt sti.
Diskusjoner
XB130 har vist seg å være en substrat og bindingspartner av RET /PTC, et onkogent protein-tyrosin-kinase [12]. Nylig har vi funnet ekspresjon av XB130 i en rekke cellelinjer avledet fra skjoldbruskkjertelen, lunge, spiserøret, bukspyttkjertel, og coloncancere. I denne studien, viste vi at XB130 er involvert i spredning og overlevelse av WRO skjoldbruskkjertelen kreftceller (med RET /PTC-mutasjon) og A549 lunge carcinoma celler (uten RET /PTC mutasjon). Nedregulering av XB130 med siRNA også redusert proliferasjon og overlevelse av esophageal kreftceller (data ikke vist). Disse resultatene tyder på at i tillegg til RET /PTC XB130 kan mediere aktivitetene til andre protein tyrosin-kinaser. Faktisk, når ko-uttrykt med XB130, flere reseptor-tyrosin-kinaser og ikke-reseptor-tyrosin-kinaser var i stand til å betydelig øke fosforylering av XB130. Det har nylig blitt vist at Src-familie-hemmere, PP1 eller PP2, avskaffet cAMP-indusert tyrosinfosforylering av XB130 og dets interaksjon med P85 PI3K [27]. Derfor er det sannsynlig at XB130 kan være et substrat av flere protein-tyrosin-kinaser, og det kan mediere celle-syklus fremgang og overlevelse i flere kreftcelletyper.
XB130 binder spesifikt p85α subenheten av PI3K, som deretter aktiverer Akt. Akt spiller en avgjørende rolle i celle spredning og overlevelse. Nedregulering av XB130 med siRNA påvirket flere molekyler ned-stream of Akt. Dette tyder på at XB130 er en viktig regulator i PI3K /Akt relaterte kreftcelle spredning og overlevelse.
I det siste tiåret har det vært et økende fokus på PI3K /Akt vei som en av de sentrale trasé for celle-proliferasjon og overlevelse [43], [44], [45].
klasse Ia
PI3Ks er heterodimerer med et regulatorisk subenhet (p85α, p85β eller p55δ) og en p110 katalytisk subenhet (p110α, p110β eller p110δ) [46]. Spesifikke fosfotyrosin rester på aktiverte vekstfaktorreseptorer eller på adapter proteiner kan bindes til SH2-domener av P85, noe som øker den enzymatiske aktiviteten til p110 katalytiske subenhet og også rekrutterer enzymet til membranen, hvor det katalyserer dannelsen av lipid andre budbringer, PIP3, ved å fosforylere phosphoatidylinositol-4,5-bifosfat (PIP2) i 3′-posisjon på sin inositol ring [47] (fig. 6). Vi har funnet en konsensus P85 bindingssete (YxxM) i den N-terminale ende av XB130 som kan binde til enten den N-eller C-terminale SH2 domene av p85α bestemt ved GST-fusjonsprotein pull-down-analyser, og som XB130 er co-immunopresipitert med p85α i menneskelig thyroideakarsinom TPC-1 celler. Fosfo-peptid inneholdende YxxM sekvensen av XB130 (men ikke dens ingen-fosforylerte form) redusert XB130 /P85 interaksjon og delesjon av N-terminalen opphevet interaksjon mellom XB130 og P85 [12]. I en fersk undersøkelse, Yamanaka et al. fant rotte XB130 ble assosiert med P85 subenhet av PI3K, og de heter det som PI3KAP. Dette samspillet er viktig for å forbedre cAMP-indusert forsterkning av IGF mitogen aktivitet i FRTL-5 skjoldbrusk celler [27]. I denne studien ble samspillet mellom XB130 og P85 finnes i både skjoldbruskkjertelen og lungekreft celler. Viktigere, nedregulering av XB130 påvirket mange down-stream proteiner av PI3K /Akt veien. Disse bevisene indikerer at XB130 er en viktig regulator av PI3K veien gjennom spesifikk binding med P85.
Aktivering av Akt er en funksjon av skjoldbrusk kreft [48], [49], [50]. Lungesvulster viser også et høyt nivå av fosforylert Akt [51]. Behandling av skjoldbruskkjertelen eller lungekreftceller med PI3K-inhibitorer, LY294002 eller Wortmannin, resulterte i redusert cellevekst eller levedyktighet [48], [49], [50], [52], [53], [54]. På grunn av sin viktige rolle i regulering av gentranskripsjon, cellesyklusprogresjon, og overlevelse, og Akt vært implisert i mange typer kreft [47], [55]. Identifikasjon av XB130 som en effektiv up-stream regulator av PI3K /Akt sti kan avsløre nye terapeutiske mål for kreftbehandling.
Oncoproteiner kan forsterke tumorvekst ved å endre cellecyklusprogresjonen og /eller moduler celledød. Nedregulering av XB130 med siRNA ikke bare redusert cellesyklusprogresjon men også forbedret celledød, noe som indikerer at XB130 er en nøkkel oppstrøms regulator av både cellulære prosesser. Våre resultater tyder på at XB130 regulerer cellesyklusprogresjon og overlevelses gjennom flere molekyler, inkludert p21Cip1 /WAF1, p27Kip1, FOXO3a, GSK3P, caspase 8 og Caspase 9 (fig. 6). Selv om vi ikke undersøke alle kjente substrater av Akt, våre resultater tyder sterkt på at XB130 utøver sin regulerende funksjon av celleproliferasjon og overlevelse gjennom PI3K /Akt veien. Videre har nedregulering av XB130 ikke påvirke nedstrøms regulatorer FOXO1 og p53 som indikerer at i tillegg til XB130 relatert Akt-aktivitet, disse molekylene kan videre reguleres av andre signaleringsmekanismer, som i sin tur sikrer spesifisitet XB130 relaterte funksjoner.
i sammendraget, viste vi at XB130 kunne regulere celledeling og overlevelse gjennom modulering av PI3K /Akt sti i skjoldbruskkjertelen og lungekreft celler. XB130 kan være en ny oncoprotein i flere krefttyper. RNA interferens har blitt et kraftig verktøy for å modulere gen-funksjon både
in vitro Hotell og
in vivo product: [56], [57]. Målrette XB130 uttrykk med denne teknikken kan være et attraktivt alternativ for kreftbehandling.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Nedregulering av XB130 med siRNA påvirket ikke apoptose i A549-celler i nærvær av 10% FBS. A549-celler ble dyrket i DMEB pluss 10% FBS. (A) nedregulering av XB130 ikke forbedre spontan og indusert celledød. A549-celler ble behandlet med 200 nM STS, eller 500 ng /ml fasab i 24 timer. (B) fasab (500 ng /ml) med IFN-γ (100 ng /ml) induserte ikke apoptose, som analysert ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av PI /Annexin V-dobbeltfarging.
n
= 3. Mean ± SEM. (C) Uttrykk for Fas ble bekreftet i A549 og WRO celler ved western blotting
doi:. 10,1371 /journal.pone.0043646.s001 plakater (TIFF)
Figur S2.
fosforylering nivåer av Src og MAPKs i WRO og A549 celler transfektert med kontroll eller XB130 siRNA. Phosphorylations av Src, ERK og JNK ble ikke påvirket av nedregulering av XB130 i WRO og A549-celler, mens phosphrylation av p38 var økningen i WRO celler.
n
= 4. Analyser ble utført av western blotting. Gjennomsnitt ± SEM. *
p
0,05 (sammenlignet med kontroll siRNA)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0043646.s002 plakater (TIFF)
