Abstract
Det sterke og konsekvent sammenheng mellom stråling i ung alder og påfølgende tyreoideakreft gir en utmerket modell for å studere stråling kreftutvikling hos mennesker. Vi vurderte derfor differensial genuttrykk i skjoldbruskkjertelen vev i forhold til jod-131 (I-131) doser mottatt fra Tsjernobyl-ulykken. Sekstitre av 104 papillær skjoldbrusk kreft diagnostisert mellom 1998 og 2008 i ukrainsk-amerikanske kohort med individuelle I-131 thyroid dose estimater hadde paret RNA prøver fra Dypfryst tumor (T) og normal (N) vev levert av Tsjernobyl Tissue Bank og fornøyde kvalitetskontroll kriterier. Vi først hybridiserte 32 tilfeldig tildelte RNA prøveparene (T /N) på 64 hele genomet mikromatriser (Agilent, 4 × 44 K). Sammenslutninger av differensial genuttrykk (log
2 (T /N)) med dose ble vurdert ved hjelp Kruskall-Wallis og trend tester i lineære blandede regresjonsmodeller. Mens ingen av genene tålt korreksjon for den falske funnrate, valgte vi 75 gener med
a priori
bevis eller P kruskall /P trend 0,0005 for validering av QRT-PCR på de resterende 31 RNA prøve parene ( T /N). QRT-PCR data ble analysert ved hjelp av lineære blandede regresjonsmodeller som inkluderte stråledose som en kategorisk eller ordens variabel. Elleve av 75 QRT-PCR analysert gener (
ACVR2A
,
AJAP1
,
CA12
,
CDK12
,
FAM38A
,
GALNT7
,
LMO3
,
MTA1
,
SLC19A1
,
SLC43A3
,
ZNF493
) ble bekreftet ha en statistisk signifikant differensial dose-ekspresjon forhold. Vår studie er blant de første til å gi direkte humandata på lang sikt differensial genuttrykk i forhold til enkelt I-131 doser og for å identifisere et sett av gener potensielt viktige i stråling kreft
Citation. Abend M, Pfeiffer RM, Ruf C, Hatch M, Bogdanova TI, Tronko MD, et al. (2012) Jod-131 doseavhengig genuttrykk i Thyroid Kreft og tilsvarende normale vev Etter Tsjernobyl-ulykken. PLoS ONE syv (7): e39103. doi: 10,1371 /journal.pone.0039103
Redaktør: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle RICERCHE (CNR), Italia
mottatt: 20 mars 2012; Godkjent: 16 mai 2012; Publisert: 25.07.2012
Copyright: © 2012 Abend et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet var først og fremst støttet av den tyske forsvarsdepartementet. Ekstra midler ble bidratt med egenutført Research Program, Division of Cancer Epidemiology og genetikk, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne erklærer herved at en av medforfatterne som nylig ansatt ved NOVA Forskning selskapet endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Medforfatter jobbet på Radiation Epidemiology Branch /National Cancer Institute (REB /NCI) før hun endret til NOVA Research Company hvor hun er ansatt nå. På tidspunktet for Radiation Epidemiology Branch /National Cancer Institute (REB /NCI) gjorde hun sitt bidrag.
Innledning
En av de viktigste helsemessige konsekvensene av 1986 Tsjernobyl kjernekraftverk ulykke er en dramatisk økning i skjoldbruskkjertelen kreftforekomst blant dem som var barn eller ungdom på den tiden [1], [2]. Mange epidemiologiske studier har vist at dette er primært knyttet til jod-131 (I-131) eksponering fra ulykken til skjoldbruskkjertelen [3] – [7]. Til tross for forskjeller i studiepopulasjoner, design og dosimetriske tilnærminger, rapportert estimater for relativ risiko (RR) per enhet av absorbert stråledose i grå (Gy) for de som utsettes i løpet av barndommen er bemerkelsesverdig lik blant de fleste studier (3-6 per Gy) og kompatibel med risiko estimert for skjoldbruskkjertelkreft fra barndommen eksponering for ekstern stråling [3] – [8]
studiet av stråling karsinogenese hos mennesker kan dra nytte av tilfeller der relasjoner er sterke og konsekvent, som i. situasjon der skjoldbruskkjertelen bestråles i ung alder. Muligheten for molekylær forskning av stråling-relaterte skjoldbruskkjertelkreft er tilrettelagt av ressursene i Tsjernobyl Tissue Bank (CTB), som systematisk samler inn biologiske prøver fra pasienter med Tsjernobyl-relaterte skjoldbrusk patologi [9]. Tidligere post-Tsjernobyl studiene rapporterte genetiske forskjeller mellom strålingsrelaterte og sporadiske tumorer, inkludert spesifikke
RET /PTC
genet rearrangements [10] – [12]. Men senere analyser utnytte de CTB prøvene tilskrives assosiasjoner til den yngre alder av Tsjernobyl-utsatte pasienter i stedet for deres stråling [13], [14]. Nyere studier ved hjelp av CTB materialer og høy gjennomstrømning teknologier har identifisert nye «strålingsspesifikke gener [15] – [20]. Kanskje den mest overbevisende funn stammer fra en rapport som sammenligner eksponert og ueksponert papillær skjoldbruskkjertelkreft (PTC) tilfeller med ung debutalder fra Ukraina som fant en gevinst på kromosom bandet 7q11 basert på komparativ genomisk hybridisering, bekreftet i uavhengige tilfeller av fluorescens
in situ
hybridisering (FISH) og kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR) [20]. Men funnene på gennivå er generelt inkonsekvent på tvers av studier potensielt grunn av små utvalgsstørrelser, bruk av kontroller fra ulike populasjoner, manglende metodevalidering i uavhengige utvalg, og ulike analytiske tilnærminger. Enda viktigere er ingen av de tidligere studier hadde individuelle stråledoser forutsatt at alle utsatte tilfeller mottok den samme dose. Avhengig av den sanne dose-uttrykk forhold, kan denne antakelsen forårsake falske positive eller falske negative assosiasjoner.
For å bedre forståelsen av de molekylære konsekvensene av I-131 eksponering, vi evaluert for første gang differensial genuttrykk i skjoldbruskkjertelen vev, definert som en forskjell i genekspresjon nivåer mellom tumor og korresponderende normal tyroideavev, i forhold til individuelle i-131 thyroid doseestimater. Vi antok at dersom doserelaterte genuttrykksmønster i svulstvev virkelig gjenspeiler en viktig begivenhet i stråling kreftutvikling i stedet for en langvarig effekt av stråling, bør de skiller seg fra mønstre observert i normalt vev; dermed vår tilnærming med å analysere differensial dose-uttrykk relasjoner svulst i forhold til paret normale prøver. Vår studie brukte RNA prøvene fra CTB av pasienter som gjennomgikk skjoldbrusk kirurgi for skjoldbruskkjertelkreft i ukrainsk-amerikanske kohortstudie består av ca 13 000 ukrainske innbyggere 18 år på tidspunktet for ulykken med individuelle radioaktivitetsmålinger tatt innen to måneder etter ulykke [21].
i denne studien, må vi først gjennomført en første skjermbildet i halvparten av tilfellene å identifisere lovende genet kandidater som ble forskjellig uttrykt i tumor og normale vevsprøver i forhold til i-131 dose basert på hele genomet RNA-mikromatriser (fase i). Vi deretter validert de beste kandidatene i svulsten og prøver normale vev fra andre halvdel av tilfellene bruker QRT-PCR (fase II). For de validerte kandidatene vi i tillegg preget forholdet mellom genuttrykk separat i tumor og normalt vev.
Materialer og metoder
Pasienter og vevsprøver
Som et resultat av fire sekvensielle screening undersøkelser, ble 110 utbredte og hendelses thyroid karsinomer diagnostisert i ukrainsk-amerikanske kohort mellom 1998 og 2008 ved Laboratorium for morfologi endokrine systemet ved institutt for endokrinologi og metabolisme (IEM, Kiev, Ukraina) [3]. Det internasjonale Pathology Panel, etablert i rammen av CTB prosjektet, gjennomgått alle patologiske diagnoser. For å redusere fenotypiske heterogenitet av tilfellene, ekskluderte vi fem follikulær og 1 marg thyroid karsinomer som resulterer i 104 PTCs kvalifisert for analyse; av disse 74 (71%) hadde lagret RNA porsjoner fra tumor og /eller normalt vev i CTB. Tilfeller inkludert og ikke inkludert i genuttrykk analyser var like på mange egenskaper inkludert I-131 dose og dermed vår studie prøven er sannsynlig å være objektiv. Alle vevsprøver ble tatt intraoperativt etter pasienter signert informerte samtykke skjemaer som er godkjent av de institusjonelle gjennomgang boards (IRB) av IEM og Coordinating Center of CTB-prosjektet (Imperial College forskningsetiske komité, London, UK). Årlig gjennomgang av hele prosjektet ble også levert av IRB av National Cancer Institute i USA.
Detaljerte driftsprosedyrer for innsamling, dokumentasjon og bearbeiding av frossen svulst og prøvene normale skjoldbruskkjertelen vev er tilgjengelige fra . CTB hjemmeside [22] og ble utviklet i fellesskap med Laboratorium for morfologi endokrine systemet av IEM og Wales Cancer Bank
Dosimetri
Måle metoder har blitt beskrevet andre steder [23] – [ ,,,0],25]. Kort fortalt ble individuelle I-131 skjoldbrusk doser og deres usikkerheter estimert fra en kombinasjon av skjoldbruskkjertelen radioaktivitetsmålinger, data om kosthold og livsstil, og miljø overføre modeller ved hjelp av en Monte-Carlo prosedyre med 1000 erkjennelser per individ [23]. For analyse, brukte vi det aritmetiske gjennomsnittet av hver enkeltes 1000 erkjennelser som beste estimat på I-131 dose korrigert for skjoldbrusk massene som er typisk for den ukrainske befolkningen [3].
RNA Utvinning og kvalitetskontroll
Fullstendige opplysninger om RNA ekstraksjon kan fås fra nettsiden CTB [22]. I korte trekk er frosset tyroideavev homogenisert ved hjelp av en vev lyser (Qiagen, Hilden, Tyskland). RNA ble ekstrahert ved bruk av Qiagen kolonnebaserte systemer. RNA blir frosset ved -80 ° C i standard 5 ug aliquoter på 20 pl. Kvalitet og kvantitet av isolerte total RNA måles spektrofotometrisk (Nanodrop, PeqLab bioteknologi, Erlangen, Tyskland) og RNA integritet er vurdert av 2100 Agilent Bioanalyser (Life Science Group, Penzberg, Tyskland). For vår analyse, brukte vi bare RNA prøver med en ratio A
260 /A
280 ≥ 2,0 (Nanodrop) og RNA integritet nummer (RIN) ≥7.5 eller ≥5.5 for hele genomet microarray og QRT-PCR-analyser, henholdsvis (IMGM Laboratories, Martinsried, Tyskland).
Selv om CTB gitt 137 RNA prøver for 71 personer med PTC, var vi i stand til å bruke 126 sammenkoblede (tumor /normal) RNA prøvene som tilsvarer 63 personer (figur 1 ). Eleven RNA prøver fra åtte personer ble ekskludert på grunn av manglende utfyllende vev (n = 5) eller på grunn av sviktende våre kvalitetskriteriene som er angitt ovenfor (n = 6).
Whole Genome microarray analyse (fase I)
Genome bredt uttrykk profilering ble gjennomført ved bruk av Agilent oligo microarray (4 × 44 K-format) kombinert med en one-farge basert hybridisering protokollen på 64 sammenkoblede RNA prøver fra 32 tilfeldig utvalgte personer (halvparten av utvalget sett) . For å sikre at enkeltpersoner er valgt for microarray analyse av genuttrykk (n = 32), og de resterende for validering analyse av QRT-PCR (n = 31) var like, vi bekreftet at deres distribusjoner av kjønn, alder, bosted, og I- 131 dose var lik.
Kjemi, kits, og programvare for hele genomet microarray analyse ble gitt av Agilent Technologies, Waldbronn, Tyskland. 500 ng av total RNA pr prøve (tilsatt med en intern merking kontroll) ble innført i en RT-IVT reaksjon og cDNA ble deretter omdannet til merket cRNA ved in vitro transkripsjon trinn (en farge Hurtig-Amp merkingskit). Kvaliteten på merket ikke-fragmentert cRNA ble analysert (RNA 6000 Nano LabChip kit), og cRNA ble renset og kvantifisert (Nanodrop ND-1000 Spetralphotometer). Endelig 1,65 mikrogram av hver merket cRNA prøven var fragmentert og forberedt for en-farge basert hybridisering (genekspresjon hybridisering kit). Hybridisering skjedde ved 65 ° C i løpet av 17 timer på separate mikromatriser bestående av 41 000 målgen-spesifikke prober (~20,000 gener) og tusenvis av kontroll prober. Etter tre gangers vask med økende stringens, ble fluorescerende signal intensiteter oppdaget på Agilent DNA microarray scanner og hentet fra bilder ved hjelp av Agilent utvinning programvare. Quantile normalisering ble brukt på data
Fase I:. Statistisk analyse av mikroarray data og utvelgelse av Gene Kandidater for uavhengig validering
Vi analyserte differensial genuttrykk i tumor i forhold til normalt vev, oppnådd ved å subtrahere log
2 transformerte sondesignaler til de normale vev (N) fra det tilsvarende tumorvev (T), log
2 (T) -log
2 (N), i forhold til i-131 dose estimater. Denne tilnærmingen reduserer variabiliteten i genekspresjon. Vi brukte den ikke-parametrisk Kruskall-Wallis test (P kruskall) å sammenligne differensial genuttrykk over tre dose kategorier (≤0.30, 0,31 til 1,0, 1,0 Gy) med cut-off punkter omtrent tilsvarer de tertiles av dosefordeling blant saker, og lineære regresjonsmodeller med trend test (P lineær) for kontinuerlig dose. Bare de gentranskriptene som hadde et anrop «tilstede» i minst 50% av RNA-prøver fra tumor og normalt vev ble inkludert i analysen av differensiell genekspresjon (~15,000). Vi korrigert for multiple sammenligninger ved hjelp av falske funnraten (FDR) [26]. Som ingen av P-verdiene forble signifikant etter FDR korreksjon, vedtok vi følgende kriterier for å velge lovende kandidater for validering og kvantifisering av QRT-PCR: (P kruskall ≤0.001) eller (0,001 P kruskall ≤0.01 og P lineær ≤0.01 ) eller (0,01 P kruskall 0,05 og P lineær ≤0.001). Samlet, 106 kandidater ut av om 2500 forskjellig uttrykt genet transkripsjoner i forhold til dose fornøyde utvalgskriteriene. Vi ytterligere snevret denne listen til 41 gener som viste de laveste P-verdier (P kruskall 0,0005 eller P lineær 0,0005) og hadde minst en to-fold forskjell (hev /senk) i differensial genuttrykk mellom høyeste i forhold til laveste dose kategori. Ytterligere 34 gener med P kruskall 0.005 ble inkludert i valideringen fordi det var bevis i litteraturen for genamplifisering (kopi nummer endring, CNA 3) eller sterk opp- /ned-regulering i andre studier av skjoldbruskkjertelkreft i bestrålte populasjoner [19], [27]. Dermed ble 75 gener valgt for validering ved hjelp av QRT-PCR (tabell S1). I tillegg, for å evaluere avtale mellom hele genomet microarray og QRT-PCR-målinger, vi fors QRT-PCR (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland) for disse genene blant de 32 individer som inngår i Fase I.
Fase II: kvantitativ RT-PCR analyse
For å validere våre microarray funn, evaluert vi genuttrykk ved QRT-PCR (TaqMan primer probe-analyser) på 62 sammenkoblede RNA prøver fra de resterende 31 personer. Alle kjemikalier for QRT-PCR bruker TaqMan kjemi ble levert av Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland. På grunn av tekniske årsaker enkelte primer probe analysene var enten kjøre på en 96-brønns QRT-PCR plattform eller bruker en annen plattform kalt low density array (LDA). Tjue fire av de 75 genene ble målt i duplikater, på grunn av tilgjengelig plass på plattformene og for å forbedre statistikken. En 0,75 ug RNA porsjon av hver enkelt ble revers transkribert ved anvendelse av en to-trinns PCR-protokoll (High Capacity Kit). 50 pl cDNA (ekvivalent med ca. 0,25 ug RNA) ble blandet med 50 pl 2 x RT-PCR masterblanding og pipettert inn i to av åtte fyllportene til LDA. Kort ble sentrifugert to ganger (1200 opm, 1 min, Multifuge3S-R, Heraeus, Tyskland), forseglet og overført til 7900 QRT-PCR instrument. Den QRT-PCR ble kjørt i to timer etter QRT-PCR protokoll for 384-brønners LDA format. Taqman kjemi for den 96-brønners plattformen ble anvendt på lignende måte med unntak av volum pr reaksjonsblandingen ble justert til 20 ul. Alle tekniske prosedyrer for QRT-PCR ble utført i henhold til standard driftsprosedyrer implementert i vårt laboratorium i 2008 da Bundeswehr Institute of Strålebiologi ble akkreditert i henhold til DIN EN ISO 9001/2008.
Vi kjørte fire RNA prøver i triplikat på tre forskjellige LDAs til å etablere en øvre grense for den lineære-dynamiske området for terskel sykluser (CT). Den øvre grense av CT var 30, slik at vi brukte bare CT-verdier lt; 30 for analyse. Ct-verdier ble normalisert i forhold til median genekspresjon av de undersøkte gener. Denne fremgangsmåten viste seg å være mer robust sammenlignet med anvendelse av 18S rRNA duplikater flekket på hver LDA for normaliseringsformål. Den midlere variasjonskoeffisient (CV) av QRT-PCR-målinger var mindre enn 2,5% og 95% av triplikate målinger hadde CV 4% (figur S1). Differensial genuttrykk reflekterer fold-endring forskjeller RNA kopiantallet i svulstvev i forhold til tilsvarende normalt vev (brukt som kalibrator) ble beregnet ved å trekke de tilhørende CT verdier (delta-delta-CT-metode).
Pålitelighet og sammenligning av resultater av forskjellige teknikker i fase i og fase II
Begge metodene målt på 32 personer inkludert i fase i avslørte sammenlignbare resultater i 70,6% (figur S2A). Mean differensial genuttrykk fra hele genomet microarray undersøkt på fase I individer ble også høyt korrelert med QRT-PCR målinger undersøkt av fase II personer (sammenligning av ulike metoder på forskjellige individer, r
2 = 0,81, figur S2B). Endelig QRT-PCR målinger av enkeltpersoner inkludert og ikke inkludert i fase I ble også sterkt korrelert (r
2 = 0.98, Figur S3), som støtter påliteligheten av metodene
Fase II:. Statistisk analyse av QRT-PCR
for å bekrefte fase i-funn, analyser fase II brukes bare enkeltpersoner (n = 31) er ikke inkludert i fase I. etter strøm eller logg transformasjon og /eller fjerning av utliggere for utvalgte gener, normalisert CT verdier av alle genene ble normalfordelt. Vi først beregnet rester fra standard lineære modeller montert på genekspresjon verdier
y
justert for alder ved skjoldbruskkirurgi (3 kategorier), kjønn og oblast eller bostedsstaten (Chernigov, Zhytomyr, Kiev), (1) hvor μ er den totale midlere ekspresjonsnivået. Vi så vurdert forholdet mellom I-131 dose og genuttrykk i lineære blandede modeller med individuelle prøver som utfallet variabel. Disse modellene står for korrelasjoner av svulsten og målinger normale vev er tatt på samme individ og også ta imot like målinger på samme person for samme vevstype.
Modellene var (2) hvor r
ij betegner det gjenværende fra modellen (1) for individer i (i = 1, 2, …, 31) på j
th prøve (j = 1, 2 for tumor og normalt vev), og ε
ij er normalfordelt feil begrep som også omfatter sammenhenger fra gjentatte målinger på samme prøve. Dosen effekt i tumorprøver er kvantifisert ved dose
tumor, og dosen virkning i normalt vev er gitt ved doser
normalt. For å vurdere forskjeller i dose effekt av vevstype, testet vi nullhypotesen H
0: dose
svulst = dose
normal. Igjen ble I-131 dose brukes på to måter: i 3 uavhengige dosegruppene, noe som fører til en to frihetsgrad Wald test P-verdi for H
0, og ved hjelp av de 3 bestilte dosegruppene, svarende til en en grad av frihet test for H
0.The plott viser residualene og montert dose bakker for normal og svulstvev. Brett endringer i uttrykket forbundet med dose ble beregnet som to til makten av forskjellen i bakkene, dvs. 2 (dose
svulst – dose
normal). Parametere for blandede modeller ble estimert ved hjelp av begrenset maximum likelihood metoden innlemmet i PROC MIXED, SAS 9.1.3 [28].
Resultater
Kjennetegn på PTC Cases
Av 63 tilfeller i vår studie, 56% kvinner og 54% var beboere i Tsjernigov oblast (tabell 1). Alder på ulykkestidspunktet varierte fra 0 til 18 år (gjennomsnitts 7,9 år) og kreft ble diagnostisert 12.5-21.6 år etter ulykken (gjennomsnitt 16,5 år). Mener jeg-131 thyroid dose var 1,25 Gy, som strekker seg mellom 0,008 og 8,6 Gy. Midler for de 3 dose kategoriene var 0,11, 0,57 og 2,62 Gy, henholdsvis. Den vanligste histologisk subtype av PTC ble blandet (48%) og resten besto av follikulær (25%), klassisk papillær (19%), og faste (8%) subtyper. Gjennomsnittet av de største svulst diameter var 16,0 mm, med en rekkevidde 6,0 til 45,0 mm.
Whole Genome Microarray
Av 19,596 gen mRNA (41,079 transkripsjoner) oppdaget på hele genom microarray, i gjennomsnitt 73,4% (område: 63,3% -91,0%) var skilles fra bakgrunnen (uttrykt). Det totale antall gentranskriptene differensielt uttrykt i forhold til I-131-dosen var 2,500; av disse valgte vi 75 genet kandidater for validering av QRT-PCR (tabell S1)
QRT-PCR
Av 75 gener analyseres, 15 utviklet ingen forsterkning tomter, 5 gitt resultater i 10 personer, og 6 viste høy variasjon trolig forårsaket av en utilstrekkelig primer probe design som gjør disse 26 genene uninformative. For 11 av de gjenværende 49 genene, doserelatert uttrykk i tumorvev var statistisk signifikant forskjellig fra den doserelatert ekspresjon i normalt vev når dosen ble anvendt som en kategorisk eller ordens variable i den lineære blandingsmodeller (tabell 2). Foreninger betydelige for både kategoriske og ordens dose ble funnet for følgende 6 gener:
ACVR2A
,
CA12
,
CDK12
,
FAM38A
,
LMO3
,
MTA1 plakater (tabell 2). Tre gener (
SLC19A1
,
SLC43A3
,
ZNF493
) hadde statistisk signifikante forskjeller i differensial genuttrykk for kategorisk dose (to frihetsgradtester), men ikke for ordens dose, noe som tyder på ikke-lineær dose-uttrykk forhold; og to gener (
AJAP1
,
GALNT7
) hadde en statistisk signifikant forskjell i dose-uttrykk forhold for ordens dose, men ikke for kategoriske dose. For
SLC43A3
assosiasjoner mellom genuttrykk og dosen ble begrenset til svulstvev (2 grad av frihet test) og for
FAM38A (
2 grad av frihet og en grad av frihet tester),
SLC43A3 plakater (2 grad av frihet test),
LMO3 plakater (en grad av frihet test),
MTA1
(en grad av frihet test) til normalt vev (figur 2 og 3). For
CA12
,
GALNT7
,
LMO3
, og
SLC43A3
det er god separasjon i uttrykk mellom tumor og normalt vev ved hvert dosenivå samt som en antydning av motstridende tendenser med dose. Men i de fleste tilfeller, betydelige forskjeller i dose-respons av vevstype som syntes å være på grunn av heterogeniteten av dose-respons-mønstre i fravær av en monoton dose-respons i hver vevstype.
Merk: Mean av rest genekspresjon etter fjerning effektene av alder, oblast, og sex er plottet separat for normalt vev (venstre del av grafen) og svulstvev (høyre del av grafen) mot gjennomsnittet av tre i-131 dose kategorier (0,11, 0,57, 2,62 Gy). Sirkler med grå fyll tilsvare bety genuttrykk verdier for normalt vev og torg med svarte fyll tilsvare bety genuttrykk verdier for svulstvev. Feilfelt representerer 95% konfidensintervall. P-verdier for forbindelse med dose er basert på et to frihetsgrad test og en en frihetsgrad trend test, henholdsvis, og gitt separat for normalt og tumorvev i bunnen av hvert panel.
Merk: Mean av rest genekspresjon etter fjerning effektene av alder, oblast, og sex er plottet separat for normalt vev (venstre del av grafen) og svulstvev (høyre del av grafen) mot gjennomsnittet av tre i-131 dose kategorier (0,11, 0,57, 2,62 Gy). Sirkler med grå fyll tilsvare bety genuttrykk verdier for normalt vev og torg med svarte fyll tilsvare bety genuttrykk verdier for svulstvev. Feilfelt representerer 95% konfidensintervall. P-verdier for forbindelse med dose er basert på et to frihetsgrad test og en en frihetsgrad trend test, henholdsvis, og gitt separat for normalt og tumorvev i bunnen av hvert panel.
diskusjon
Fordi forholdet mellom bestråling i ung alder og risiko for skjoldbrusk kreft er sterk og slående konsekvent, denne svulsten gir en utmerket modell for å studere stråling kreftutvikling hos mennesker. Her benyttet vi målebaserte individuelle I-131 doser beregnet for en kohort av ukrainske beboere som var 18 på tidspunktet for Tsjernobyl-ulykken og RNA prøver fra Dypfryst tyroideavev levert av CTB. For første gang, gjennomførte vi analyser av dose-avhengig genekspresjon i papillær thyroideakarsinom i forhold til normal tyroideavev fra de samme individer over hele genomet og bekreftet resultatene for 11 gener ved QRT-PCR i RNA-prøver fra et separat sett av tilfellene .
Flere punkter bør vurderes når man sammenligner våre resultater med tidligere studier. Transkripsjonell profilering ved hjelp av mikromatriser som tillater samtidig evaluering av tusenvis av genet transkripsjoner har vært mye brukt for å få innsikt i de molekylære endringer indusert av ioniserende stråling [29] – [35]. Det ble imidlertid først og fremst brukt til forskjellige celletyper
in vitro
: cellekulturer av humane keratinocytter [31], lymfoblastoide celler [34], etc. Noen få studier, inkludert dyremodeller eller pasienter som ble behandlet med radioterapi undersøkt genekspresjon snart etter
in vivo
bestråling [32], [33], [35]. Genene som utviste doserelaterte forandringer etter eksponering for ioniserende stråling i disse studiene er mest sannsynlig å være nyttige som tidlig biologiske endepunkter og /eller biomarkører for eksponering. Deres nytten i form av langsiktig kreftrisiko hos mennesker gjenstår å bli etablert. Det var også noen mekanistiske studier som sammenlignet genekspresjon i strålings-relatert kreft med genekspresjon i sporadiske kreft eller tilsvarende normalt vev [15] – [20], men ingen av disse er involvert enkeltdoseestimater. Vår studie har forsøkt å bygge bro dette gapet. Ved hjelp av anslag individuelle I-131 dose, evaluert vi dose i tre kategorier, uten antagelser om dose-respons-form og ved å anta en lineær dose-respons. Fordi ulike strålebiologisk mekanismer kan forekomme med økende stråledoser, inkludert celledreping og induksjon av vedvarende kromosomale rearrangementer, som i seg selv er kjent for å følge ikke-lineære forhold [36], [37], et krumlinjet forhold til differensial genekspresjon er plausibel. I samsvar med denne ideen, i hvert fall noen gener (
SLC19A1
,
SLC43A3
,
ZNF493
) utviste et forslag av ikke-linearitet i differensial dose-respons.
De 11 gener som ble validert i en selvstendig sak satt av QRT-PCR i vår studie (tabell S2) er alle plassert på ulike kromosomer og tilhører ulike biologiske mekanismer, inkludert celle adhesjon (
AJAP1
,
FAM38A
), energiomsetningen (
CA12
), transkripsjon eller DNA metylering (
LMO3
,
ZNF493
,
MTA1
,
SLC19A1
), og vekst /differensiering (
CDK12
,
ACVR2A
). Alle disse banene har vært implisert i cellulære responser overfor ioniserende bestråling [31], [34]. Enda viktigere, fire spesifikke gener (
CA12
,
GALNT7
,
LMO3
, og
SLC43A3)
tidligere ble rapportert av Stein et al. å være entydig deregulert i etter Tsjernobyl skjoldbrusk kreft [19] og ett gen (
FAM38A
) ble tidligere identifisert av Ory et al. i en studie av skjoldbruskkjertelkreft etter bestråling for en første primær kreft i barndommen [27]. I tillegg til å finne disse fem genene differensielt uttrykt i et uavhengig sett av utstrålte tilfeller vi gitt bevis for at deres differensial uttrykk ser ut til å være doseavhengig. Derfor er disse genene er spesielt attraktive kandidater for videre valideringsstudier med fokus på mekanismer for stråling kreftutvikling. Ingen av de lovende gener identifisert i vår studie ble plassert i 7q11.22-11.23; gevinst i denne kromosom regionen ble rapportert i ung-utbruddet etter Tsjernobyl PTCs [20].
Flere spor dukket opp fra vår studie som kunne veilede fremtidige studier av stråling kreftutvikling. Doseavhengigheten for differensiell genekspresjon detektert år etter eksponering sannsynlig representerer en sen og /eller langvarig effekt av stråling. En mekanisme som strålingsinduserte endringer kan opprettholdes over tid er ved arv av DNA-skade [38]. Det har blitt rapportert at ioniserende stråling er i stand til å indusere en bestemt type DNA-skade, særlig kopiantall endringer (CNAS) [39]. Tallrike studier av sporadiske kreft har slått fast at CNAs kan forme vev transcriptomes og innflytelse genuttrykk [40]. Derfor, hvis strålingsinduserte CNAs opprettholdes under tumorgenese, doserelatert differensial-genekspresjon kan delvis tilskrives doserelaterte forandringer i CNAs. Denne ideen finner en viss støtte i studier som rapporterte overlapping i CNAs og gener unikt deregulert i etter Tsjernobyl svulster [19] og betydelig overekspresjon av ett gen blant flere undersøkt innenfor fått 7q11.22-7q11.23 region [20]. En annen fremvoksende mekanisme som strålingen kan indusere og bevare langvarige endringer i genuttrykk er epigenetikk [41], [42]. Epigenetiske endringene indirekte påvirke DNA ved å endre DNA metylering, kromatin remodeling, og mikroRNA (miRNA) uttrykk i stedet for DNA-strukturen. Våre funn av doseavhengig uttrykk for visse gener (
FAM38A
,
SLC43A3
,
LMO3
,
MTA1
) i normal skjoldbruskkjertelen vev kan være relatert for stråleinduserte epigenetiske forandringer. Videre kan doserelaterte uttrykk endringer i normalt vev tilby en ekstra mulighet til å vurdere individuell mottakelighet for stråling [43], [44]. Samtidig evaluering av genuttrykk, CNAs, og epigenetiske endringer kan gi ledetråder til de komplekse effekter av ioniserende stråling og stråling kreftutvikling.
Vår studie har flere unike styrker. For det første benyttes et anslag individuelle I-131 dose basert på radioaktive målinger som tas kort tid etter et uhell [3], [6]. For det andre tilfeller oppsto i en godt karakterisert kohort screenes for skjoldbruskkjertelkreft i henhold til en standardisert protokoll og uavhengig av dose, minimere virkningen av umålt forvirrende.
