Abstract
Bakgrunn
Fotodynamisk terapi (PDT) bruker en kombinasjon av photosensitizing narkotika og ufarlig lys til å forårsake selektiv skade på kreftceller. PDT er derfor en mulighet for fokal behandling av lokalisert sykdom, eller for på annen måte inoperable tumorer. I tillegg er det et økende bevis for at PDT kan indusere systemisk anti-tumor immunforsvar, som støtter kontroll av tumorceller, som ikke ble eliminert av primærbehandling. Imidlertid er effekten av ikke-dødelige PDT på atferd og malignitetspotensiale av tumorceller overlevende PDT molekylært ikke godt definert.
metodikk /hovedfunnene
Her har vi evaluert endringer i transkriptom av menneskelig glioblastom (U87, U373) og human (PC-3, DU145) og murine prostatakreftceller (TRAMP-C1, TRAMP-C2) etter ikke-dødelige PDT
in vitro Hotell og
in vivo
å bruke oligonukleotid microarray analyser. Vi fant ut at den generelle responsen var lik mellom de ulike cellelinjer og fotosensibiliserende både
in vitro Hotell og
in vivo
. De mest fremtredende oppregulert gener kodet proteiner som tilhører trasé aktiveres av cellulært stress eller er involvert i cellesyklus arrest. Denne responsen var lik til unnsetning responsen av tumorceller etter høydose PDT. I kontrast, ble tumorceller som arbeider med ikke-dødelige PDT funnet betydelig oppregulere en rekke immungener, som inkluderte chemokin genene
CXCL2
,
CXCL3 Hotell og
IL8 /CXCL8
i tillegg til genene for IL6 og dens reseptor-IL6R, som kan stimulere proinflammatoriske reaksjoner, mens IL6 og IL6R kan også øke tumorvekst.
Konklusjoner
Våre resultater tyder på at PDT kan støtte anti-tumor immunresponser og er derfor en rasjonell terapi selv om tumorceller ikke helt kan elimineres ved primære fototoksiske mekanismer alene. Imidlertid kan ikke-dødelige PDT også stimulere tumorvekst fremmende autokrine looper, som sett av oppregulering av IL6 og dens reseptor. Således kan effekten av PDT til å behandle svulster kan forbedres ved å kontrollere uønskede og potensielt skadelige vekst-stimulerende trasé
relasjon:. Kammerer R, Buchner A, Palluch P, Pongratz T, Oboukhovskij K, Beyer W, et al . (2011) Induksjon av immun Meglere i glioma og prostata kreft celler med ikke-dødelige Fotodynamisk terapi. PLoS ONE seks (6): e21834. doi: 10,1371 /journal.pone.0021834
Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center og Beckman Research Institute, USA
mottatt: 11. desember 2010. Godkjent: 13 juni 2011; Publisert: 30 juni 2011
Copyright: © 2011 Kammerer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Deutsche Krebshilfe (107320, https://www.krebshilfe.de/deutsche-krebshilfe.html). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Fotodynamisk terapi (PDT) i onkologi er basert på selektiv akkumulering av et fotosensibiliserende middel (PS) i kreftceller, etterfulgt av aktivering ved vev-inntrengende lys med lav energi. I nærvær av oksygen, frembringer den eksiterte PS reaktive oksygenarter (ROS) som singlett-oksygen, som er toksiske for levende celler [1].
Various PS eksistere som alle har sine fordeler og sine begrensninger. 5-amino-levulinsyre (5-ALA) er en naturlig forløper for heme i pattedyrceller. Celler forbrenne 5-ALA til heme, som produserer protoporfyrin IX (PpIX) som et mellomprodukt i deres mitokondriene. På grunn omdannelse av PpIX til heme er et hastighetsbegrensende trinn, PpIX akkumuleres i kreftceller som et resultat av preferanse opptak og retensjon av 5-ALA. PpIX lokaliserer intracellulært til mitokondriene og til cytoplasma [2]. Photofrin®, på den annen side, er en eksogen fotosensibilisator som også akkumuleres i kreftceller, men er plassert på forskjellige cellemembraner [3]. Generelt aktivering av PS som målrette mitokondriene føre til kreft celle apoptose, mens PS som forbinder med cellemembraner overveiende indusere celle nekrose [2].
Opprinnelig var målet for PDT i onkologi var å fullstendig eliminere lokaliserte svulster . Imidlertid har den kliniske anvendelse av PDT i behandling av kreft nå begynt å forandre seg. Nylig har behandlingsregimer blitt brukt som søker å lokke fram vaskulære-målretting eller anti-tumor immun effekter [4] – [7]. Dette indikerer at PDT kan også være en rasjonell behandlingsalternativ for ikke-overfladiske svulster som prostatakreft og glioblastom.
Prostatakreft er den tredje største årsaken til kreft dødsfall for nordamerikanske menn [8]. Den primære behandling av prostatakreft omfatter radikal prostatektomi, androgen-deprivasjon terapi, strålebehandling og transperineal brachyterapi. Alle disse behandlingene har en rekke negative effekter som har en betydelig innvirkning på pasientene [9]. På grunn av de dramatiske forbedringer i tidlig prostatakreft diagnose fokale behandlinger, for eksempel kryoterapi, høy intensitet fokusert ultralyd og PDT er fremstår som nye terapeutiske muligheter [10], [11]. Den store ulempen med fokal terapi er imidlertid usikkerheten av fullstendig tumorcelle utrydding, spesielt ettersom lite er kjent om responsen av tumorceller som unnslipper fra brenn terapi. En uønsket scenario er at disse kreftcellene få økt malignitet eller begynne å hemmelige faktorer som støtter spredning eller infiltrasjon av gjenværende kreftceller i et parakrint mote.
glioblastoma multiforme (GBM) er den vanligste og mest aggressive typen primære hjernesvulster hos mennesker. Median overlevelsestid for GBM pasienter er 14,6 måneder [12]. Et av de karakteristiske trekk ved glioblastom er deres diffus infiltrativ natur [13]. Nylig ble det observert at fluorescens-styrt reseksjon og repeterende PDT i betydelig grad kan forlenge median overlevelse hos pasienter med GBM [14], [15]. Videre ble langsiktig overlevelse av GBM pasienter etter PpIX basert PDT rapportert fra andre kliniske studier [16], [17]. Til tross for disse lovende observasjoner ulike saker må tas opp for å optimalisere PDT som en terapeutisk alternativ for GBM. For eksempel, er responsen av tumorceller som overlever PDT på grunn av deres avanserte infiltrering inn i normalt hjernevev ikke godt definert, men kan være et mål for en hjelpeterapi.
Vi har tidligere rapportert hvordan transcriptome av prostatacancercellelinje PC-3 reagerer på 5-ALA-basert PDT [18]. Overraskende PC-3-celler oppregulert ikke bare spennings og DNA-reparasjonsgener, men også gener som koder for proteiner som er involvert i regulering av immunresponser, inkludert visse kjemokiner og cytokiner. Derfor ønsket vi å vite om denne observasjonen gjelder for andre PS, for andre prostatakreftcellelinjer, for tumorceller i et annet vev opprinnelse og for svulster
in vivo
. For å oppnå dette vi forhold analysert genom-wide transkripsjons endringer etter lavt nivå, ikke-dødelig PDT i to menneskelige prostata og glioblastom cellelinjer hver, sammenlignet transkriptomet av den menneskelige prostata kreft linje PC-3 etter 5-Ala- og Photofrin -basert PDT og analysert transkripsjons endringer av murine prostata kreft celler subkutant transplantert inn albino C57BL /6 mus på PDT. Vi har observert, uavhengig av vevet opprinnelse og typen av sensibilisator, et markert transcriptional stimulering av gener som koder for proinflammatoriske cytokiner som stimulerer og tiltrekker overveiende myeloide leukocytter og, på samme tid, aktivering av gener som koder for proteiner involvert i cellesyklus-stans. Til sammen kan det uunngåelig ufullstendig ødeleggelse av svulstvevet ved PDT henhold kliniske settinger og med støtte anti-tumor immunresponser.
Resultater
sensibilisering og bestrålingsbetingelser for ikke-dødelige
in vitro
PDT
for å være i stand til reproduserbart laste tumorceller med fotosensibilisatoren vi fastslått kinetikken og 5-ALA-konsentrasjon avhengighet av PpIX dannelse i tumorcellelinjer anvendt. Vi har valgt to human prostata (PC-3, DU145) og to glioblastoma cellelinjer (U87, U373) i tillegg til muse-prostata carcinoma-cellelinjer TRAMP-C1 og TRAMP-C2, som er avledet fra tumorer i transgene mus line «transgen modell av prostata cancer «(TRAMP) [19], [20]. Oppbyggingen av fotosensibiliserende middel ble kvantifisert ved flowcytometri (figur 1E). Vi bemerket store cellelinjespesifikke forskjeller i nivåene av PpIX formasjonen etter inkubasjon med det PpIX forløperen 5-ALA (figur 1A-C, E). Dette kan skyldes forskjeller i nivåene av ATP-bindende kassett transporter ABCG2 som er kjent for å være ansvarlig for eksport av PpIX fra celler [21]. Faktisk, tilstedeværelse av ABCG2 mRNA i forskjellige cellelinjer korrelerte med lave nivåer av PpIX etter inkubering med 5-ALA med den høyeste mengder ABCG2 mRNA som blir observert for TRAMP-C1 og TRAMP-C2-celler som utviste de laveste nivåene av PpIX ( Figur S1; figur 1). I tillegg ble akkumulering av PpIX reduseres 2-3 ganger når inkubasjon med 5-ALA ble utført i nærvær av serum i mediet (figur 1 B, C). Dette var sannsynligvis på grunn av binding av PpIX til serumalbumin en gang transportert ut av cellen, og dermed forskyve PpIX steady state nivået [22], [23]. Basert på disse data ble en 16 timers inkuberingsperiode med 50 ug /ml 5-ALA i nærvær eller fravær av 5% serum som er valgt for den humane prostata (PC-3, DU145) og human glioblastom og murine prostatakreftcellelinjer (U87, U373, TRAMP-C1, TRAMP-C2), henholdsvis. En ganske lavt, men effektivt sensibiliserende Photofrin konsentrasjon (5 ug /ml) ble valgt for å unngå mulig cytotoksisitet i fravær av lys (figur 1D).
Tumorceller ble inkubert med 50 ug /ml (A, E) eller med de indikerte konsentrasjoner av 5-ALA (B, C) eller Photofrin (D) i nærvær (PC-3, U373, A, D, E og røde linjer i B, C) eller fravær av 5% serum (TRAMP -C1, TRAMP-C2, A og blå linjer i B, C). Dersom ikke annet er angitt, ble det PpIX innholdet av cellene kvantifisert etter 16 timer ved hjelp av strømningscytometri i fluorescens kanal 3 (medianverdier ± standardavvik). Representative histogrammer for 5-ALA-behandlede humane tumorcellelinjer er vist i E. Ubehandlede celler ble anvendt som kontroll; en representant kontrollprøve uten 5-ALA inkubasjon er vist (rød utfylte kurve). De fotosensibiliserende viste mettbar opphopning avhengig av inkubasjonstid og konsentrasjon. Serum i kulturmediet sterkt redusert ALA-baserte PpIX formasjonen. Vilkårene for sensitive lasting brukes for transkriptom analyser er angitt med vertikale stiplede linjer. AU, vilkårlige enheter.
Deretter lette doser for bestråling av sensitiverte cellene ble definert som ville tillate celleoverlevelse i et tidsrom på 24 timer til 48 timer under hvilken det skadede celler kan aktivere gener. Vi fant at PDT betingelser som forårsaket en reduksjon av aktivitet i cellelevedyktigheten assay med 30% 24 timer etter PDT i forhold til et ikke-bestrålte cellekultur i stedet ført til vekststans med lite eller intet tap av celler i løpet av et tidsrom på 48 timer (figur 2E). For å bestemme lys dose som induserer en 30% reduksjon av cellelevedyktigheten ved å måle mitokondrielle aktivitet, ble celler sensitivert som beskrevet ovenfor og bestrålt med økende doser av laserlys. Tap av cellelevedyktighet øket med tiden etter bestråling og lysdose og varierte mellom cellelinjer. For eksempel, en 4-ganger høyere lys dose som var nødvendig for å indusere en 30% reduksjon av cellelevedyktighet 24 timer etter PDT for DU145-celler når sammenlignet med U373 eller TRAMP-C1-celler (figur 2A-D, tabell S1). Dette forskjellig sensitivitet av de forskjellige cellelinjer korrelerte ikke med deres evne til å akkumulere PpIX i nærvær av 5-ALA. Interessant, lysdoser som fører til det samme 30% tap av cellelevedyktighet induserte et annet nivå av apoptose i de analyserte humane cellelinjer som målt ved aktiveringen av caspase 3 og caspase 7. Mens ingen eller en marginal nivå av apoptose ble observert hos de prostatakreft-cellelinjer DU145 og PC-3, henholdsvis maksimal apoptose ble observert i glioblastoma cellelinjer under de samme betingelser (figur 2F).
menneske~~POS=TRUNC (A, B, DF) eller muse-tumorceller ( C) ble sensibilisert ved inkubering med 50 ug /ml av 5-ALA (DU145: 100 ug /ml) eller med de indikerte konsentrasjoner av Photofrin i 16 timer i nærvær (A, D, E, F, PC-3, DU145 ) eller fravær av 5% serum (B, C, F, U87, U373). Celler ble bestrålt med laserlys (635 nm) som leverer de angitte lysdoser. Etter de angitte tider, ble cellenes levedyktighet og caspase3 /7 aktivering bestemmes og vises enten som en% av kontroll for hvert tidspunkt (A-D, F) eller i relative fluorescensenheter (RFU, E, F). Legg merke til forskjellig tilbøyelighet av prostata og glioma celler til å lide av apoptose ved lavdose PDT.
Den transkripsjon av en undergruppe av chemokin og cytokingener er sterkt oppregulert i tumorceller etter ikke-dødelige
in vitro
PDT
for å finne de genene som deregulerte 4 timer og 24 timer etter ikke-dødelige PDT vi utført transkriptomet analyse av bestrålte og ikke-bestrålte menneskelige og murine tumorceller sensibilisert ved inkubasjon med 5 -Ala (betingelsene er oppsummert i tabell S1). En stor andel av sondesett /gener oppregulert etter PDT ble delt mellom cellelinjer og med mellom cellelinjer avledet fra svulster i forskjellige vev sted (f.eks ~30-60% 24 timer etter PDT Tabell S2, S3 tabell). Pathway analyser ved hjelp av Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) program viste at 24 timer etter bestråling, av totalt 3479 gensettene, 208 gensettene signifikant oppregulert i glioblastom celler, 156 gensettene i prostatakreft, og 508 genet sett i de kombinerte prøvene (P 0,01) (tabell S4). Settene med genene mest fremtredende oppregulert i alle cellelinjer tilhører trasé aktivert av cellulært stress, inkludert fremgangsmåter som initieres av skade gjennom ultrafiolett lys, hypoksi og ioniserende stråling, så vel som gensettene, de kodede proteiner som hindrer spredning ( «negativ regulering av celle syklus «,» cellesyklus-stans «og» apoptose «; Tabell 1). Mest betydelig, et antall immun banene ble transkripsjonelt aktivert ved ikke-dødelig PDT, slike veier inkluderer «proinflammatoriske gener», «interferon-β pathway» og «nøytrofil aktivering ved sårheling» (tabell 1; figur 3). Den Gene ontologi gensettene mest betydelig nedregulert i alle analyserte cellelinjer ble funnet å være assosiert med mitokondrielle baner (3 av 5), som er i samsvar med de mitokondriene å være stedet for PpIX produksjon og primær skade av ROS (tabell S4) .
Gene sett anrikning analyse (GSEA) viste aktivering av et sett av gener 24 timer etter ikke-dødelig PDT av alle fire prostata og glioblastoma cellelinjer (data er vist for PC-3), som også er funnet å være karakteristisk for nøytrofil aktivering under sårtilheling [55]. Oppregulering er illustrert ved konsentrasjonen av de vertikale svarte linjer (som representerer gene sett medlems stillinger i rangert genet listen) på venstre side av genet listen ( «null cross», se «foss tomt» nederst i diagrammet) . Denne fordelingen fører til en høy og betydelig berikelse score (maksimalt avvik på den grønne linjen fra null; P 0,001 og falske funnrate (FDR) 0,001).
Bilder
Fire timer etter ikke-dødelige PDT, transkripsjoner av «tidlig responsgener» var blant de sterkest induserte og mest uttrykte gener i både menneskelige og murine tumorceller (figur 4, tabell S2, tabell S3, figur S2A-C). Denne gruppen av gener koder for transkripsjonsfaktorer som FBj murine osteosarkom viral onkogen homolog (FOS), juni, aktivere transkripsjonsfaktor 3 (ATF3), tidlig vekstrespons 1 (EGR1) og DNA-skade-induserbar transkripsjon 3 (DDIT3). Oppregulering av disse gener i sin tur fører til transkripsjon av typiske stressgener som varmesjokkprotein (HSP) gener og kan initiere G1 og apoptose (DDIT3) [24], [25]. Faktisk induserbare medlemmer av HSP genet familien, nemlig varme sjokk 70 kDa protein 6 (
HSPA6
) følges i rang av
HSPA1A Hotell og
HSPA1B
var den mest dominant indusert gener 4 timer etter PDT i de humane tumorcellelinjer (figur 4A-D). I murine TRAMP-C1 og TRAMP-C2 celler transkripsjoner av ortologer av de to sistnevnte medlemmene var utbredt fire timer etter PDT (figur S2B, C). Dominans av transkripsjoner av tidlig respons transkripsjonsfaktor og HSP gener ble tapt 24 timer etter PDT, som ble fulgt av økt aktivitet av to store grupper av gener involvert i motsatte cellulære prosesser. En sterkt stimulert og på høyt nivå uttrykt gruppe av gener koder for proteiner som viser anti-proliferative, pro-apoptotiske og anti-invasive funksjoner induserbar av gentoksisk stresset som ROS (vekst arrest og DNA-skade-induserbar beta (GADD45B), dual-spesifikke fosfatase 1 (DUSP1), ADAM metallopeptidase med thrombospondin type 1 motiv 1 (ADAMTS1), homocystein-induserbar, endoplasmatisk retikulum stress induserbar ubiquitin-lignende domene medlem 1 (HERPUD1) [26], sink finger protein 36 (ZFP36); vekst differensiering faktor 15 /NSAI-aktiverte genet 1 (GDF15 /NAG-1 [27], spermidin /spermin N1-acetyltransferase 1 (SAT-1) [28]). Den andre gruppen av gener som koder for proteiner som er kjent for eller antatt å forbedre celle overlevelse etter cellulært stress ved å hemme apoptose og cellesyklus arrest (
hjerne uttrykt X-linked to plakater (
BEX2
) [25]) eller ved å støtte avgiftning av skadelige stoffer som genereres av ROS (
aldo-keto reduktase 1C1 Twitter /
1C2 product: (
AKR1C1 Twitter /
AKR1C2
)) (figur 4A-D).
Tumor cellene ble underkastet ikke-dødelig PDT etter sensibilisering med 5-ALA (A, C-F) eller Photofrin (B). Totalt RNA ble isolert 4 og 24 timer etter PDT og analysert ved hybridisering til oligonukleotid mikromatriser. Etter normalisering ble ganger endring av genekspresjon mellom korresponderende bestrålte og ikke-irridiated prøvene beregnet og plottet mot ekspresjonsnivået etter PDT. Bare gener ( «probe-sett») er vist som var opp- og ned-regulert ≥3 ganger og til hvilken en «foreliggende anrop» ble registrert for alle bestrålte og ikke-bestrålte prøver, henholdsvis. Den mest sterkt opp-eller ned -regulated og mest høyt uttrykte gener i prøvene er identifisert ved gen-symboler. multiple fremstilling av genet symboler et resultat av tilstedeværelsen av flere probe-sett for enkeltgener. gener som koder for immunmodulerende proteiner er i tillegg markert med små sirkler. Legg merke til at de sistnevnte gener er blant de mest sterkt oppregulert gener. En fargekode ble brukt til å diskriminere grupper av gener som koder for funksjonelt beslektede proteiner (se fig eske legende). for alle prøvene bety ekspresjons-verdier fra duplikater ble anvendt. FU, fluorescensenheter.
Interessant, blant gener sterkt oppregulert ved tumorcellene etter PDT var en rekke immunresponsgener, særlig kjemokin og cytokingener, så vel som chemokin og cytokin-reseptor-gener (figur 4, figur 5). Ekspresjon av en betydelig andel av disse genene var signifikant oppregulert 24 timer etter PDT ofte i både prostata og glioblastoma cellelinjer (P 0,05, to-veis ANOVA-test). Blant de mest konsekvent oppregulert gener var chemokin genene
CXCL2
,
CXCL3 Hotell og
interleukin-8 product: (
IL8
) /
CXCL8
samt cytokingen
IL6
(figur 5A-C, H). Oppregulering av
CXCL2
,
CXCL3
gener ble observert allerede fire timer etter PDT i de fleste cellelinjer (data ikke vist). Ekspresjon analyse av nettverket av genprodukter som samvirker med IL6 avslørte en mulig autostimulatory sløyfe i PC-3-celler som involverer IL6 og dens reseptor-subenheter IL6R /IL6RA og IL6ST /IL6RB (figur 6). Av notatet uttrykk for
CCAAT /enhancer bindende protein β product: (
CEBPB
) som koder for en transkripsjonsfaktor kjent for å være involvert i reguleringen av uttrykk for
IL6
, var tre fold og 4,2-gangers indusert 4 timer og 24 timer etter PDT, henholdsvis (ikke vist). Videre gener som koder for både negative og positive regulatorer av IL6 signaliserer nemlig suppressor av cytokin signale 3 (SOCS3) og Janus kinase 1 (JAK1) /JAK2 henholdsvis ble oppregulert. For
IL6
gen Vi har tidligere vist at transkripsjonen oppregulering betyr også forhøyet sekresjon av det kodede protein av PC-3-celler etter 5-ALA-basert PDT [18]. Ingen statistisk signifikant aktivering ble observert for noen chemokin og cytokingener (f.eks
CXCL1 product: (P = 0,25),
CCL26 product: (P = 0,24, data ikke vist);
IL18
Figur 5J);
CXCL14
ble funnet å være signifikant nedregulert (figur 5E). For å validere uttrykket data innhentet av microarray oligonukleotid eksperimenter vi analyserte mRNA nivåer av et valgt sett av gener (IL6, CXCL8 og CXCL14) i total RNA fra PDT-behandlede og kontrollceller 24 timer etter bestråling. Vi fant en god avtale mellom de to sett med uttrykks verdier bestemmes av de to forskjellige kvantiteringsstandarder metoder (Figur S3, figur 5). Dette gjenspeiles av koeffisientene for bestemmelse R «sup> 2 i nærheten av 1,0 (0,947 ± 0,072) og en tilsvarende statistisk signifikant opp- (IL6, CXCL8) og nedregulering (CXCL14) som finnes ved bruk av oligonukleotid microarray datasettet.
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP ble utsatt for ikke-dødelige PDT etter sensibilisering med 5-ALA eller Photofrin og RNA ble analysert etter 24 timer utvinning fra PDT ved hybridisering til oligonukleotid mikromatriser som beskrevet i Legend Figur 4. Mean uttrykk verdier i forhold fluorescens enheter (RFU) og deres avvik for uttrykt interleukin og chemokin og interleukin og chemokin reseptor gener er vist. For
CXCL8 Hotell og
CXCL14
gener 202859_x_at og 222484_s_at probe sett ble brukt, henholdsvis. For PC-3 og U87-prøvene bety uttrykk verdier fra duplikater, for DU145 og U373 prøver enkeltmålinger ble brukt. Betydning nivåer (P) ble beregnet ved hjelp av to-veis ANOVA.
Endringene av genuttrykk 4 timer og 24 timer etter PDT målt ved oligonukleotid microarray analyser er avbildet som fold endring (fluorescens bestrålt /ikke -irradiated prøve). Omfanget av ganger endring er indikert med forskjellige farger ( 1,2-fold, hvit, ≥1.2-fold, to ganger, oransje, ≥2-fold, rød). Den sterkeste oppregulering av ekspresjon ble observert for
IL6
gen (12,3 ganger) som kunne en del av en autostimulatory sløyfe med også oppregulert IL6 reseptorsubenheter (IL6R og IL6ST). Størrelsen på ovaler angir absolutte uttrykk nivå etter PDT ( 100 FU, lite symbol, ≥100, 1000, medium symbol, ≥1000, stort symbol). Linjene mellom ovaler symboliserer forskjellige typer av interaksjon mellom proteiner eller gener.
Det er imidlertid også en brøkdel av gener (~ 25%) som ble selektivt oppregulert (≥4 ganger) i PC-3 eller U87 celle og dermed kan vise vev opprinnelsesspesifikk stimulering. De mest differensielt stimulert gener er enten allerede relativt høyt uttrykt i svarer cellelinje (for eksempel
EGR1
,
IL11
,
AKR1C1-3
i U87, CD55 i PC -3) eller sannsynligvis ikke tilhører repertoaret av uttrykk gener i den aktuelle cellelinje (
atom reseptorunderfamilien fire gruppe Et medlem 1 product: (
NR4A1
),
tumornekrosefaktor -α-indusert protein 6 product: (
TNFAIP6
),
dehydrogenase /reduktase (SDR familie) medlem 9 product: (
DHRS9
),
cyclin-avhengige kinase inhibitor 1A product: (
Kip2
) i U87) (tabell S5)
Til sammenligning bare noen få gener /probe settene ble nedregulert . 3 ganger etter PDT (Figur 4E , F og data ikke vist). De mest sterkt uttrykte gener som ble nedregulert ofte kodet cellevekst og overlevelse fremme proteiner.
ROS-induserbare gener er mer effektivt oppregulert ved 5-ALA-basert PDT enn ved Photofrin-mediert PDT
Interessant, selv om endogent fremstilt PpIX og det syntetiske oligomere porfyrin Photofrin antas å opptre i forskjellige cellulære [3], ble et lignende sett av gener oppregulert både i 4 timer og 24 timer etter ikke-dødelig PDT i PC-3-celler (figur 4A, B). Imidlertid, til tross for et tilsvarende nivå av inhibisjon av cellelevedyktigheten etter 4 timer ikke-dødelig PDT (5-ALA 15 ± 3%; Photofrin 17,5 ± 0,5%; Tabell 1) 14% (28/204) av genene /probe-sett, som var mer enn tre ganger oppregulert etter 5-ALA-basert PDT, oppviste en ≥4 ganger høyere transkripsjonelle aktivering sammenlignet med den som observeres etter Photofrin-mediert PDT (tabell S6). De fortrinnsvis oppregulert gener som nettop er på et høyt nivå omfattet blant annet gener, tidlige responsgener (
FOS
), hsp-gener (
HSPD1, HSPA6
), celleoverlevelse gener (histon klynge 1 gener), samt immunresponsgener (
IL1A
,
CCL26
). I motsetning til dette, ikke gen sterkt uttrykt etter PDT ( 1000 RFU). Ble selektivt stimulert av Photofrin-basert PDT (tabell S6)
Transkripsjonell oppregulering av proinflammatoriske gener i TRAMP-C2-tumorer etter ikke-dødelige PDT
Siden uttrykket av chemokin og cytokingener ble konsekvent oppregulert i cellelinjer etter 5-ALA-basert PDT
in vitro
, undersøkte vi om 5-ALA-baserte PDT kan også indusere uttrykk for proinflammatoriske gener i tumorer, noe som kan støtte anti-tumor immunreaksjoner. Vi har benyttet som en tumormodell murine TRAMP-C2 prostatatumorceller dyrket subkutant på albino C57BL /6 mus, som tillot transdermal bestråling av en tumor med synlig lys. Første optimaliserte vi allergiske tilstander ved å måle akkumuleringen av PpIX i huden over tumoren etter i.p. injeksjon av 5-ALA som en approksimasjon for PpIX dannelse i tumorvev. I de fleste mus ble det maksimale PpIX nivåer i huden oppnås etter 2-3 timer (figur 7A). En lignende kinetisk av PpIX akkumulering ble observert ved spektrofotometrisk bestemmelse av PpIX i tumorekstrakt (figur 7B).
kinetikk PpIX opphopning i mus vev etter i.p. injeksjon av 5-ALA ble bestemt enten ved direkte måling av PpIX fluorescens i huden som dekker tumor (A) eller ved fluorescens spektroskopisk bestemmelse av PpIX i tumorekstrakter fra en enkelt mus hver ble avlivet på det angitte tidspunkt (B). PpIX akkumulering i forskjellige vev i forhold til TRAMP-C2 tumorer 3,5 timer etter 5-ALA-injeksjon er vist i (C). I (A), er et typisk kinetisk av PpIX opphopning i huden er vist. Maksimal akkumulering av PpIX i hud og tumorvev ble observert ~180 min etter 5-ALA-injeksjon. Tumorer ble underkastet PDT (75 J /cm
2) etter sensibilisering med 5-ALA til 180 min. Legg merke til at 5-ALA-mediert PDT etter maksimal sensibilisering hadde bare en marginal (D) eller forbigående hemmende virkning på tumorvekst (E), selv etter påføring duplikat en uke fra hverandre. For transkriptomet analyse, sensitiv svulster fra et enkelt muse hvert ble behandlet eller ikke med laserlys (635 nm; 75 J /cm
2), skåret 4, 14 eller 24 timer etter bestråling. RNA ble isolert og analysert ved hybridisering til oligonukleotid mikromatriser. Etter normalisering ble ganger endring av genekspresjon mellom bestrålte og ikke-irridiated prøvene beregnet og plottet mot ekspresjonsnivået etter PDT (F). Bare gener ( «probe sett») er vist som ble oppregulert ≥3 ganger og som en «tilstede call» ble registrert i det bestrålte prøven. Den mest sterkt oppregulert og de høyt uttrykte gener i prøvene er identifisert ved gen-symboler. Multiple avbildningen av genet symboler et resultat av tilstedeværelsen av flere probe-sett for enkeltgener. Gener som koder for immunmodulerende proteiner er i tillegg merket med små sirkler. AFU; vilkår fluorescens enheter; n, antall mus testet.
I forhold til TRAMP-C2 svulster, ble relativt høye nivåer av PpIX funnet i ekstrakter av leveren, sædvæske og hud (figur 7C). Dette kan være på grunn av den sterke uttrykk for PpIX effluks transporter genet
ABCG2
i C2 svulster og C2 tumorcellelinjen (figur S1) og kunne forklare dosebegrensende bivirkninger sett i mus etter PDT. Følgelig lyset dosene som kan bli anvendt ført til en ineffektiv kontroll av tumorvekst (figur 7D, E). Transkriptomet analyser ved hjelp av RNA isolert fra bestrålt og ikke-bestrålt hele svulster 14 timer og 24 timer etter PDT viste at brøkdel av svært transcriptionally aktiverte genene etter ikke-dødelige PDT består hovedsakelig gener som koder for proinflammatoriske faktorer (figur 7F Figur S2). Som observert for PDT-behandlede tumor cellelinjer,
Cxcl2
,
Cxcl3 Hotell og
IL6
var blant de sterkest oppregulert gener, selv om vi ikke kan utelukke at disse cytokiner ble uttrykt av stromale celler i svulsten mikromiljøet eller tumor-assosierte immunceller. Interessant,
Sprr2h product: (
liten prolinrikt protein 2
) et gen kjent for å være regulert av IL6 /STAT3 signaliserer [29] er den nest mest sterkt indusert gen 14 timer etter PDT (Figur 7F). Fire timer etter PDT,
Hsp1a Hotell og
Hsp1b
tilhørte gruppen av sterkest aktivert og mest uttrykte gener (figur 7F).
Diskusjoner
Ulike grunner foreligger hvorfor ikke-dødelige PDT er ofte brukt unintendedly til kreftceller
in vivo
. En av disse grunnene er at celler i en tumor er ofte heterogene og kan variere i deres evne til å akkumulere PS så vel som i deres følsomhet for oksidativt stress. Faktisk ble det observert en slående variasjon av PpIX opphopning mellom de forskjellige tumorcellelinjer anvendt. Dette er ikke begrenset til tumorceller
in vitro
, men ble også observert i tumorceller
in vivo product: [30], [31]. I denne studien identifiserte vi gener som er oppregulert i kreftceller på ikke-dødelige PDT
in vitro Hotell og sammenlignet dem med gener som ble berørt i løpet av tumor vev
in vivo
. Viktigere, har vi funnet at kreftcellene uavhengig av deres vev opprinnelse (prostata og hjernen) av seg selv oppregulere immunrelaterte gener som et svar på PDT-indusert stress i cellene. Dette indikerer at oksidativt stress induserer tilsvarende responser i forskjellige celletyper, alle rettet mot å begrense følsomheten av cellene til ROS, for å reparere defekter påført cellen og til å koordinere immunresponser som er beregnet for å fjerne irreversibelt skadet vev fra organismen.
