Abstract
Strålebehandling er en viktig behandlingsalternativ for operabel avansert menneskelig lungekreft, og en kritisk adjuvant behandling til operasjon. Imidlertid stråling som en lungekreft behandling er fremdeles langt fra tilfredsstillende på grunn av problemene i forbindelse med stråling motstand i kreftceller og alvorlig cytotoksisitet til ikke-cancerceller, som oppstår ved doser som vanligvis administreres til pasienter. Vi har nylig identifisert en lovende ny inhibitor av β-catenin /Tcf4 interaksjon, kalt BC-23 (C
21 H
14ClN
3o
4S), som virker som en potent celledød forsterker når det brukes i kombinasjon med stråling. Sekvensiell eksponering av humant p53-null ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) H1299 celler til lave doser av røntgenstråling, fulgt en time senere av administrering av minimalt cytotoksiske konsentrasjoner av BC-23, resulterte i en sterkt synergistisk induksjon av klonogene celledød (kombinasjon index 1,0). Samtidig behandling med BC-23 ved lave konsentrasjoner hemmer effektivt Wnt /β-catenin signalering og ned-regulerer c-Myc og cyclin D1 uttrykk. S-fasen arrest og ROS generasjon er også involvert i forbedring av stråling effektiviteten mediert av BC-23. BC-23 representerer derfor en lovende ny klasse av stråling Enhancer
Citation. Zhang Q, Gao M, Luo G, Han X, Bao W, Cheng Y, et al. (2016) Forbedring av stråling følsomhet i lungekreftceller av en nye små molekyl inhibitor som er rettet mot β-catenin /Tcf4 Interaksjon. PLoS ONE 11 (3): e0152407. doi: 10,1371 /journal.pone.0152407
Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA
mottatt: 16 oktober 2015; Godkjent: 14 mars 2016; Publisert: 25 mars 2016
Copyright: © 2016 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra Connolly Endowment /Hendricks Fondet og LUNGevity Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for nylige fremskritt i levering av strålebehandling og kjemoterapi for lokalt avansert lungekreft, de fleste pasienter tilbakefall og gi etter for sin sykdom [1-3]. Dette kan skyldes, i stor grad, til tilstedeværelsen av lungekreft stamceller: en populasjon av celler som er i stand til selvfornyelse, proliferasjon og metastase og som viser merkbar radioresistance [4-6]. Cisplatin og paclitaxol er de to stoffene mest brukte i pasienter for å sensibilisere lungekreft celle til strålebehandling [7]. Men bivirkningene og motstand mot disse stoffene fortsatt til stede barrierer for å forbedre sine terapeutiske indekser.
Ikke-småcellet lungekreft (NSCLCs) står for 85% av menneskelige lungekreft tilfellene [8]. Undersøkelser pågår på flere nye klasser av små molekyl radiosensibiliserende og deres stråling fremmende effekter på NSCLCs og andre menneskelige kreft [9-12]. I dag er fortsatt et kritisk behov for oppdagelsen og utviklingen av nye stråle enhancers som viser høy effektivitet og lav toksisitet.
Avvikende aktiveringer av Wnt /β-catenin signal, noe som resulterer i oppregulering av selv- fornyelse og spredning av lungekreft celler, er avgjørende for lungekreft tumorigenesis, progresjon, og kjemo- og radioresistance [13-15]. Wnt /beta-catenin pathway er aktivert i 75% av alle kliniske NSCLC tilfeller testet og spiller en avgjørende rolle i celle spredning og overlevelse [16, 17]. Denne reaksjonsvei er over aktivert i NSCLC og mange andre kreftformer på grunn av overekspresjon av Tcf4, Wnt1, og Wnt2 og fører til en forhøyet akkumulering av β-catenin i kjerner [18-20]. β-catenin binder seg til medlemmer av TCF /Lef familie, som regulerer uttrykket av målgener som c-myc og cyclin D1 [21-23]. Hemming av overekspresjon av Wnt 1, Wnt to, og β-catenin fører til
in vitro
NSCLC celle apoptose og redusert
in vivo
tumormasse [20].
Emerging bevis impliserer Wnt /β-catenin veien i radioresistance av kreftceller [22, 24]. Nuclear β-catenin og Tcf4 ansamlinger eller Wnt /β-catenin sti hyper-aktivering er viktige årsaker til radioresistance [25]. Stanse av Tcf4 fører til en betydelig sensibilisering av kreftceller til lave doser av stråling [26]. En inhibitor av Wnt /β-catenin signalveien, GDK-100 017, har blitt rapportert å forbedre Radiosensitivity av NSCLC-celler ved å blokkere den β-catenin-Tcf /Lef interaksjonen [24].
Cancer stilk eller initierende celler som har forhøyede nivåer av kjernefysisk β-catenin kan unngå celledød normalt indusert av stråling. Dette er delvis tilskrives virkningen av β-catenin, sammen med nedstrømsgener, c-Myc og cyclin D1, som medierer den oppregulering av selvfornyelse og vedlikehold av kreft stilk /stamceller mot subletal eller letale stimuli [22, 27 ]. Inhibering av Wnt /β-catenin signale reduserer c-myc og cyclin D1-nivåer, og dermed forbedre den radiosensitiviteten til cancerceller [24, 28, 29], men de nøyaktige regulerings forholdet mellom β-catenin, c-Myc, cyclin D1, reaktiv oksygen arter (ROS) og cellesyklus arrest /progresjon krever ytterligere avklaring. Ikke desto mindre, den spesifikke forstyrrelse av samspillet mellom atom β-catenin og Tcf4 etter selektiv bestråling behandling representerer en særlig lovende strategi for å forebygge proliferasjon og overlevelse av kreftceller. Denne strategien bevarer også den reelle funksjon av β-catenin interaksjoner med andre fysiologiske ligander [30].
I denne studien rapporterer vi på en ny og potent stråling Enhancer, BC-23 (C
21H
14ClN
3O
4S), som retter seg mot β-catenin /Tcf4 samhandling og signalering. Ved 3 uM, noe som er en dose som forårsaker lite cytotoksisitet, bevirker BC-23 behandling sterk synergistisk forbedring av cancercelledød indusert av lave doser av stråling (dvs. en to log forbedring av cancercelledød etter kombinasjon med stråling). Nedregulering av c-myc ekspresjonen, oppregulering av ROS produksjon, og oppheving av G2 /M rest er de molekylære mekanismer som ligger under strålingsfremmende effekter av BC-23. Denne rapporten er den første til å beskrive at man bryter radioresistance i humane NSCLC-celler ved hjelp av et lite molekyl hemmer av β-catenin /Tcf4. Disse data antydet en potensiell nytteverdi og anvendelse av denne forbindelsen for behandling av lungekreft.
Materialer og metoder
Reagenser og cellekultur
BC-23 (NSC45382) ble oppnådd fra NCI-databasen. ICRT14, N-acetylcystein (NAC), og H
2DCFDA, ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Sigma-Aldrich, og Cayman-Chemical, henholdsvis. H1299 og H1975 celler ble kjøpt fra ATCC. Cellene ble dyrket og holdt i en fuktig 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C i RPMI1640 (Hyclone, termisk Scientific) supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin.
fluorescens polarisering baserte konkurransebindingsbestemmelse
fluorescens polarisering (FP) ble utført i henhold til våre tidligere rapporter, med mindre modifikasjoner [31]. I korthet, 20 nM sporstoff [FITC-merkede Tcf4
(8-30) probe] og 500 nM β-catenin ble blandet og inkubert med /uten BC-23 i 100 ul PBS (inneholdende 0,01% Triton X-100). Etter tre timers inkubasjon ved romtemperatur, ble FP verdier registrert ved hjelp av en Synergy 2 mikroplateleser (BioTek) på en eksitasjon /emisjon på 485 /528nm.
TOP-flash luciferasereportergenet analysen
H1299 celler på 1 x 10
4 celler /brønn ble transfektert med NT /β-catenin reporter gen TOP-blits, havner Tcf4 bindingssteder for β-catenin og PRL-CMV Renilla-luciferase kontroll reporter vektor (Promega, E2261). Fire timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av BC-23 eller ICRT14. Luciferase aktivitet ble bestemt 24 timer etter behandlingen med Dual-Luciferase® Reporter analysesystem (Promega, E1910). TOP luciferase aktiviteten ble normalisert ved kontroll PRL-CMV Renilla Luciferase aktivitet.
I silico
virtuelle screening
Vi utarbeidet reseptoren struktur fra en krystallstruktur av β-catenin /TCF4 kompleks (PDB kode 1JPW) og utført en
i silico
virtuelle screening ved hjelp Autodock4 som tidligere rapportert [30].
real-Time PCR
H1299 celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av BC-23 i 16 timer. Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av en RNeasy-sett (Qiagen). CDNA ble syntetisert ved hjelp av en høy kapasitet cDNA revers transkripsjon Kit (Invitrogen). Real-time PCR ble utført på en LightCycler
® 480 System ved hjelp LightCycler
® 480 SYBR Grønn Jeg Master (Roche). Terskelen syklusen (C
t) verdier ble normalisert til p-aktin intern referanse. Primerne anvendt i sanntid PCR var som følger: β-aktin, fremover 5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3 «; revers 5»-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3 «; c-myc, fremover 5»-TCAAGAGGCGAACACACAAC-3 «; revers 5»-GGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3 «; cyklin D1, frem til 5»-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3 «; revers 5»-GGGGATGGTCTCCTTCATCT-3 «.
Cytotoksisitet assay
H1299-celler, sådd ut i 96-brønners plater ved 1×10
3-celler /brønn ble behandlet med de ønskede konsentrasjonene av BC- 23 i 100 ul medium, og inkubert i 1 dag eller 3 dager. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved tilsetning av 20 ul CellTiter-Blue (Promega, G8081) til hver brønn. Etter en 4-timers inkubering ved 37 ° C, ble fluorescensen bestemt ved anvendelse av en Synergy to mikroplateleser (BioTek) ved en eksitasjon /emisjon på 550 nm /600 nm.
klonogene assay
H1299 cellene ble bestrålt med 0-10 Gy stråling (RS-2000 biologisk forskning irradiator, Rad Source). Én time senere ble cellene behandlet med DMSO eller 3 uM BC-23 og inkubert i ytterligere 24 timer. Cellene ble deretter sådd ut i 6-brønns plater ved 500-2000 celler per brønn, og inkubert i 12 dager for å tillate kolonidannelse. Kolonier bestående av 50 eller flere celler ble tellet under et mikroskop. Pletterings effektivitet (PE) ble beregnet ved å dividere antall kolonier av celletallet podet. Den overlevende fraksjon ble beregnet ved å dividere PE verdier av strålegrupper ved at av de tilsvarende ikke-bestrålte grupper. Virkningen av antioksidant NAC på BC-23-indusert cytotoksisitet og hemming av vekst i H1299-celler ble bestemt etter tilsetning av 1 mM NAC, sammen med forskjellige konsentrasjoner av BC-23, til cellene. Etter inkubering i 24 timer, ble cytotoksisitet og kolonidannelse bestemt som beskrevet ovenfor.
Forbigående transfeksjon med CTNNB1 siRNA
H1299-celler ble sådd ut i seks-brønns plater. Ved å nå 50% til 60% konfluens ble cellene transfektert med human validerte b-catenin (CTNNB1) siRNA eller negativ kontroll siRNA 1 (Ambion, Inc.) ved en sluttkonsentrasjon på 100 nM med JetPRIME reagens (Polyplus transfeksjon, NY USA ), i henhold til produsentens anvisninger. Etter en 24 timers transfeksjon, ble cellene delt i 2 grupper, en for Western blots og den andre for stråling sensitivitetsanalyse. For Western blot, ble kulturmediet erstattet med nylig fremstilt medium og cellene ble inkubert i ytterligere 24 timer før proteinpreparat. For stråling sensitivitetsanalyse, ble cellene behandlet med eller uten 6 Gy stråling. Etter bestråling ble cellene behandlet med 3 um BC-23 eller DMSO kjøretøy og høstet ved 48 timer etter transfeksjon for klonogene analyser.
Protein ekstraksjon og western blot analyse
Cellene ble oppsamlet og lysert i lyseringsbuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 1% deoksykolsyre, 2 mM ortovanadat, 100 mM NaF, 1% Triton X-100, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid) inneholdende en protease inhibitor og fosfatase-inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich). Proteininnholdet ble kvantifisert ved BCA-metoden. Proteinprøver (20 ug) ble underkastet elektroforese på 10% SDS-polyakrylamidgeler og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Bedford, MA, USA). Membranene ble blokkert og inkubert over natten ved 4 ℃ med et monoklonalt kanin anti-β-catenin (1: 1000, Cell Signaling Technology, MA, USA) primært antistoff, eller med et monoklonalt muse anti-β-aktin (1: 2000, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) primært antistoff som en lasting kontroll. Etter vasking, ble blottene inkubert i 1 time ved romtemperatur med tilsvarende pepperrot-peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoff (1: 5000; Santa Cruz Biotechnology, California, USA), visualisert med ECL-oppløsning (Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce, Rockford, IL, USA), og eksponert med ChemiDoc ™ MP System (Bio-Rad).
Cell syklus analyse
H1299 celler ble sådd ut i 6-brønners plater og bestrålt med 4 Gy stråling. Én time senere ble cellene behandlet med 5 uM BC-23 og inkubert i 24 timer. Etter å ha vasket med PBS, ble cellene fiksert i 70% kald etanol i 15 minutter ved -20 ° C, og deretter rehydratisert i PBS i 15 min. Cellepelletene ble resuspendert og farget med 3 uM propidiumjodid (PI, Life Technologies, P3566) i 0,5 ml buffer (100 mM Tris, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl
2, 0.5 mM MgCl
2, 0,1% Nonidet P-40) med 1 mg /ml RNase A. cellene ble inkubert i 40 minutter ved romtemperatur. Strømningscytometrisk analyse ble utført med en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm og emisjonsbølgelengde på 576 nm. Cellesyklus ble analysert ved hjelp FlowJo (versjon 9.7.5) analyse programvare.
Fastsettelse av ROS produksjon
Den generasjonen av ROS ble bestemt ved hjelp av H
2DCFDA-baserte analysen, ifølge metodene er publisert tidligere [32, 33]. I korthet ble H1299-celler sådd ut i 96-brønners plater på 2,5 x 10
4 celler /brønn og dyrket i 24 timer. Etter to ganger vasking med PBS, ble cellene inkubert med 20 uM H
2DCFDA (Cayman Chemical) ved 37 ° C i 45 minutter og deretter behandlet med BC-23, stråling, eller en kombinasjon av BC-23 pluss stråling. Fluorescens intensitet (eksitasjon /emisjon = 485/535 nm) ble registrert i 2 timer ved hjelp av en Synergy H1 mikroplateleser (BioTek).
Statistical Analysis
En statistisk analyse ble utført ved hjelp av en veis ANOVA etterfulgt av Tukey multiple sammenligningstest (Prism 5.0, GraphPad Software).
P
verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Gjennomsnittlige verdier ble uttrykt som middel ± S.D. De kombinerte kreft effekter av BC-23 og røntgenstråling ble bestemt ved anvendelse av Chou og Talalay metode: CI (kombinasjonsindeks) = [(D)
1 /(Dx)
1] + [(D)
2 /(Dx)
2] + (D)
1 (D)
2 /(Dx)
1 (Dx)
2, hvor (D)
1 og (D)
2 representerer de doser av behandlings 1 (BC-23) og to (stråling) som produserer x-effekt når de brukes i kombinasjon, (Dx)
1 og (Dx)
2 er de doser av behandlingene 1 og 2 som produserer den samme x effekt når det brukes alene.
Resultater
BC-23 hemmer bindingen mellom β-catenin og Tcf4 og Wnt /β-catenin signale
Vi bestemte de direkte hemmende effekter av utvalgte forbindelser på samspillet mellom β-catenin og Tcf4 bruke vår nylig utviklede celle-fritt konkurrerende bindingsanalyse basert på fluorescens polarisering (FP). Blant de testede forbindelser, BC-23 viste sterk aktivitet (IC
50 verdi av 1,7 mm) mot bindingen mellom β-catenin og en FITC-merket Tcf4
(8-30) probe (fig 1). BC-21, som ble rapportert av vår gruppe som en inhibitor av Wnt /β-catenin vei, ble anvendt som en positiv kontroll i FP-analyser. BC-21 behandling hemmet β-catenin /Tcf-4 interaksjoner med en IC
50 Verdien av 5 pm [31]. Luciferase-baserte TOP (husing TCF /LSF bindingssetet) reporter analysen (brukes til å teste den hemmende effekten av BC-23 på transkripsjonen aktivitet av Wnt /β-catenin banen i β-catenin overekspresjon kreftceller) viste at BC- 23 doseavhengig hemmet TOP-luciferase aktivitet i H1299 celler, med en IC
50 verdi på 2,3 mikrometer (fig 2). Dette tyder videre på at BC-23 målrettet samspillet mellom β-catenin og Tcf4 og hemmet deres formidlet transkripsjonen aktivitet. Vi brukte PRL Renilla-luciferase reporter som en intern kontroll for analysen og ICRT14 (en inhibitor av β-catenin-responsive transkripsjon) som en positiv kontroll. ICRT14 1 uM inhiberte 38% av TOP-luciferase-aktivitet.
En blanding av 500 nM β-catenin og 20 nM FITC-Tcf4
(8-30) ble inkubert i fravær eller nærvær av indikerte konsentrasjoner av BC-23. Fluorescens polariserings (FP) verdier ble målt etter 3 timer. Den relative binding ble beregnet som (MP
T-MP
f) /(MP
C-MP
f) × 100. Punktene representerer gjennomsnitt ± S.D. av 3 uavhengige eksperimenter.
H1299 celler ble ko-transfektert med reporteren TOP-blits og kontroll Renilla plasmider. Fire timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av BC-23 i 24 timer. Den øverste luciferasepreparater aktiviteter ble bestemt og normalisert til Renilla luciferasepreparater aktiviteter. BC-23 utviste doseavhengige inhiberende aktivitet på TOP luciferase i H1299-celler, med en IC
50 verdi på 2,3 uM. Kolonnene representerer gjennomsnitt ± S.D. av 3 uavhengige eksperimenter.
BC-23 blokker strukturelle samspill av β-catenin med Tcf4
Vi analyserte binding konformasjon av BC-23 og β-catenin bruker molekylære docking ( figur 3A). Samspillet mellom Tcf4 Asp16 med β-catenin Lys435 er kritisk for deres binding. Vår krystallstruktur analyse indikerte at Asp16 av Tcf4 dannet hydrogenbinding med β-catenin Lys435, mens Glu17 av Tcf4, som var ved siden av Asp16, dannet et salt bro med Lys508. Som vist i figur 3B, BC-23 inntatt en stilling ved Asp16 og Glu17, som danner en hydrogenbinding med Asn430 sidekjeden med avstand på 3,08 Å. Dette formodentlig blokkerer interaksjon mellom Tcf4 og β-catenin via Asp16 av Tcf4. I tillegg β-catenin Lys508 dannet en annen hydrogenbinding med oksygenatomet i den naftokinon gruppen av BC-23 med en avstand på 2,90 Å. Den naphthoquinone gruppe av BC-23 gjennomgikk også hydrofobe interaksjoner med de alifatiske delene av β-catenin Pro505. Dette vil blokkere interaksjonen mellom β-catenin med Tcf4 Glu17.
De bindende modellene ble generert av Autodock og PyMol.
BC-23 vesentlig bedre stråleindusert klonogene celledød i H1299 NSCLC-celler
H1299-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av BC-23 i 24-72 timer. Ved slutten av hver behandling, ble cellenes levedyktighet bestemt ved CellTiter blå analysen. BC-23 alene utstilt moderat cytotoksisitet mot H1299 celler, med IC
50-verdier på 7,6 og 4,5 mikrometer for en dag og tre dagers behandling, henholdsvis (figur 4A). Imidlertid sekvensiell behandling av H1299-celler med 2-10 Gy stråling og 3 um BC-23 resulterte i en to-log økning i klonogene død av H1299-celler sammenlignet med 10 Gy bestråling alene (figur 4B). Indeksen av kombinasjonen for klonogene celledøden var mindre enn 1. Denne betydelige forbedring av klonogene celledød i H1299 celler ved kombinasjonen av BC-23 og strålebehandlinger indikerer en strålingsForsterKingen av BC-23.
EN. H1299-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av BC-23 alene i 1 (○) og 3 (•) dager. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved CellTiter blå analysen. B. Sekvensiell eksponering av H1299-celler i 2-10 Gy stråling, fulgt 1 time senere av behandling med 3 uM BC-23 (■), økt dramatisk induksjon av klonogene celledød i forhold til strålebehandlingen alene (●). Hvert punkt representerer gjennomsnittsverdiene av tre separate forsøk.
Kombinere BC-23 med stråling øker ROS generasjon i H1299 celler
Graden av overordnede oksidativt stress ble bestemt ved å overvåke ROS hjelp H
2DCFDA. Vi undersøkte intracellulære nivåer av ROS generert over tid. ROS-nivåer ved 2 timer etter behandling var 2 ganger høyere i celler behandlet med den kombinerte administrering av 10 Gy stråling og 3 uM BC-23 enn i celler som gis hver behandling alene (figur 5A). Den potensielle rolle ROS i BC-23-mediert celledreping og inhibering av kolonidannelse ble ytterligere testet ved anvendelse av NAC (en antioksidant) for å absorbere den ROS i cellene. NAC vesentlig avskaffet den cytotoksiske og vekst-inhiberende effekter av BC-23 i H1299 celler (figur 5B-5D).
A. Ved å kombinere 3 uM BC-23 med 10 Gy stråling (x) dramatisk økt ROS generasjon, sammenlignet med de enkelte behandlinger alene: bærerkontroll (●), 3 uM BC-23 (■), og 10 Gy stråling (▲). Hver verdi er middelverdien ± SD for tre separate eksperimenter. B-D, ROS-avhengige cytotoksiske effekter av BC-23. NAC demper celledød mediert ved eksponering av H1299-celler i de angitte konsentrasjoner av BC-23 i cytotoksisitet (B) og colongenic assays (C, representative retter av klonogene analyser og D, analyser av prosentandelen av overlevende celler). *, P. 0,05 versus kontroll
BC-23 induserer S fase arrest i H1299 celler
Cell syklus arrest på S og G2 /M faser er en viktig mekanisme som forårsaker celledød sett i respons på behandling med en kombinasjon av stråling og anticancer legemidler, inkludert Wnt /p-catenin sti-inhibitorer. En 24 timers behandling med 5 uM BC-23 alene økte betydelig prosentandelen av celler (45%) i S-fasen, når sammenlignet med kontrollceller (25%). Behandling med en kombinasjon av 4 Gy stråling og 5 uM BC-23 resulterte i en tilsvarende andel av H1299-celler i S-fasen, men cellene ble også blokkert i G2 /M fasen av strålebehandling (figur 6).
H1299-celler ble behandlet med vehikkel-kontroll (A), 5 uM BC-23 (B), 4 Gy stråling (C), og 4 Gy stråling pluss 5 uM BC-23 (D). Prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen ble bestemt ved propidiumjodid (PI) farging og FACS-analyse. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
BC-23 nedregulerer ekspresjonen av c-myc og cyclin D1 og β-catenin knockdown etter CTNNB1 siRNA vesentlig blokkert radiosensitizing effekten av BC-23
Vi har utført flere tester på virkningene av BC-23 på Wnt /β-catenin /Tcf4 signalveien ved å bestemme dens effekter på uttrykk for c-myc og cyclin D1, som er to viktige spesifikke målgener av P-catenin /Tcf4 signalering. Etter en 16 timers behandling med 20 og 40 uM BC-23, de mRNA ekspresjonsnivåer av c-myc og cyclin D1 ble signifikant redusert i H1229 celler (fig 7). Vi undersøkte uttrykk for andre gener (f.eks β-aktin) som ikke var knyttet til regulering av p-catenin /Tcf4 samhandling og deres uttrykk ble ikke berørt av BC-23. Den terskel syklus Verdiene i figur 7 ble normalisert til den β-aktin intern referanse. Disse data gir ytterligere bevis på at BC-23 nedregulerer både cyclin D1 og c-Myc, som blir overuttrykt i mange kreftceller, inkludert H1229 celler. Vi har også brukt CTNNB1 siRNA å redusere β-catenin ekspresjon i H1299-celler for å bestemme hvorvidt den radiosensitizing effekten av BC-23, avhenger av β-catenin pathway. Figur 8A viser at CTNNB1 siRNA betydelig redusert β-catenin ekspresjon sammenlignet med kontroll siRNA. Stanse av komponentene i Wnt /β-catenin veien er kjent for å øke radiosensitiviteten til cancerceller. Som forventet, knockdown av β-catenin ved CTNNB1 siRNA betydelig forbedret radiosensitiviteten av H1299 celler, mens transfeksjon med kontroll siRNA ikke endret Radiosensitivity sammenlignet med 6 Gy bestråling alene, som vist i fig 8B. BC-23 økte Radiosensitivity av H1299 celler behandlet med kontroll siRNA. Imidlertid, nedregulering av β-catenin ekspresjon med CTNNB1 siRNA blokkerte radiosensitizing effekten av BC-23 sammenlignet med kontrollgruppen siRNA-gruppen, noe som tyder på at radiosensitizing effekten av BC-23 avhenger, i det minste delvis, på det Wnt /β- catenin veien.
H1299 celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av BC-23. Total RNA og cDNA ble fremstilt etter en 16 timers behandling. CDNA ble wuantified av real-time PCR og normalisert mot et kjøretøy kontroll. BC-23 behandling inhiberte signifikant ekspresjon av både Wnt /β-catenin målgener c-Myc og cyclin D1 på mRNA-nivå. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05 og **, p. 0,01 versus kontroll
H1299 celler ble behandlet med CTNNB1 eller med kontroll siRNA. Protein ble fremstilt fra en del av cellene for western blotting og de gjenværende celler ble anvendt for Radiosensitivity analyser med 6 Gy stråling med /uten BC-23. A, CTNNB1 siRNA betydelig redusert β-catenin uttrykk. B, CTNNB1 siRNA sperret radiosensitizing effekten av BC-23 betydelig. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. ****, P 0,001 versus kontroll; ###, P 0,001 versus 6 Gy + kontroll siRNA; , p 0,01 versus 6 Gy + kontroll siRNA + BC-23
Diskusjoner
Vi bestemte de direkte hemmende effekter av utvalgte forbindelser fra NCI på samspillet mellom. β-catenin og Tcf4 bruke vår nylig utviklet celle-frie konkurransebindingsanalyse basert på FP [31]. Blant de testede forbindelser, BC-23 viste sterk aktivitet (en IC
50 verdi av 1,7 mm) mot samspillet mellom β-catenin og en FITC-merket Tcf4
(8-30) probe (fig 1). Vi har også brukt en cellebasert TOP (skjuler den Tef /Lef bindingssetet) luciferase-analyse for å teste effekten av BC-23 på transkripsjonen aktivitet av Wnt /β-catenin pathway. BC-23 på en doseavhengig inhibert TOP aktivering i H1299-celler, med en IC
50 verdi på 2,3 pM (Fig 2). Disse data tyder på at BC-23 mål på β-catenin /Tcf4 interaksjon. Analyse av binding konformasjon av BC-23 ved molekylær docking avslørte at BC-23 inntatt en posisjon på Asp16 og Glu17 av Tcf4, danner to hydrogenbindinger med Asn430 og Lys508 og hydrofobe interaksjoner med Pro505 av β-catenin (Fig 3B). Dette indikerte at BC-23 blokkerer interaksjonen mellom Tcf4 og β-catenin til Asp16 og Glu17 av Tcf4 (Fig. 3A og 3B; amp)
Vi testet potensialet i BC-23 for å virke som en stråle enhancer for NSCLC H1299 celler. Høye nivåer av kjernefysisk β-catenin har blitt funnet i mange humane lungekreftceller [16]. Tilstedeværelsen av lungekreft stamceller (LCSCs) som er i stand til selvfornyelse, proliferasjon og metastase kan gi tumorresistens til stråling [4-6]. Vi antok at administrasjon av BC-23 kan forbedre virkningen av strålebehandling på lungekreft celler gjennom hemming av β-catenin /Tcf4 samhandling og signalering. Vi bestemmes først cytotoksisiteten til BC-23 alene H1299 celler ved den CellTiter-Blue-analysen. BC-23 alene oppviste moderat cytotoksisitet mot H1299-celler, med IC
50 verdier på 7,6 og 4,5 uM i 1 dag og 3 dagers behandling, henholdsvis, som vist i fig 4A. Behandling av H1975-celler (et p53 villtype NSCLC) med BC-23 for 1 og 3 dager resulterte i IC
50-verdier for BC-23 på 7,9 og 5,2 pM, henholdsvis, som var verdiene kan sammenlignes med de som oppnås for H1299 cellene . Dette tyder på at den cytotoksiske effekt av BC-23 er uavhengig av p53. Sekvensiell behandling av cellene med 2 til 10 Gy stråling, fulgt 1 time senere av administrering av 3 um BC-23, i betydelig grad forbedret den strålings-mediert klonogene celledrepende virkning i H1299 celler (figur 4B). BC-23, i kombinasjon med 10 Gy stråling, forårsaket en to-log økning i klonogene død av H1299-celler når sammenlignet med 10 Gy stråling alene.
De mulige mekanismer som BC-23 forbedrer død NSCLC-celler eksponert for stråling ble ytterligere undersøkt ved å analysere cellesyklus og ROS-produksjon i H1299 celler behandlet med BC-23 og stråling, alene eller i kombinasjon. Tidligere studie antyder at Wnt /β-catenin signalveien spiller en rolle i regulering av cellesyklus og nucleus-lokaliserte β-catenin-Tcf kompleks øker i løpet av S-G
2 [34, 35]. Den β-catenin aktivering er forbundet med overlevelse av celler med skadet DNA (forårsaket av ROS) og med DNA-reparasjons feil [36]. BC-23, alene eller i kombinasjon med stråling, arrestert H1299 celler i S-fasen (figur 6), når sammenlignet med bærerkontrollen og stråling alene. Den kombinerte behandlingen av BC23 og stråling produsert S-fasen pågripelse og en simultan stråling-indusert G2 /M cellesyklus blokk. Disse funnene tyder på at en forsinkelse i cellesyklusen overgang eller /og i DNA dobbel tråd pause behandling i H1299 celler etter samtidig behandling med BC-23 og stråling. Forsinkelsen i DNA-syntese på grunn av BC-23 kan forverre overlevelse av celler som gjennomgår G
2 /M rest (fig 6) forårsaket av eksponering for stråling, og den resulterende ROS (figur 5). BC-23 signifikant induserte ROS generasjon i H1299-celler på en doseavhengig måte (figur 5A). Den potensielle rolle ROS i BC-23-mediert celledreping og klonogene celledød ble ytterligere bekreftet ved hjelp av antioksidant NAC å skatte ROS i cellene. NAC behandling opphevet den cytotoksiske effekt av BC-23 i både cytotoksisitet og koloni-analyser (figur 5B-5D) betydelig. Den økte ROS indusert av BC-23 kan videre hemme β-catenin /Tcf4 sti fordi ROS negativt modulere Wnt /β-catenin signalveien gjennom nedregulering av β-catenin [37].
Vi har innhentet ytterligere bekreftelse av den spesifikke effekt av BC-23 på Wnt /β-catenin /Tcf4 signalisering ved å undersøke mRNA-ekspresjon av c-myc og cyclin D1, to kritiske nedstrøms gener av Wnt /β-catenin pathway. Signifikant inhibering av ekspresjonen av både c-Myc og cyclin D1 på H1299-celler ble observert etter en 16 timers behandling med 20 og 40 uM BC-23 (figur 7). Ytterligere bevis er gitt av den observasjon at CTNNB1 siRNA redusert β-catenin ekspresjon og betydelig blokkert radiosensitizing effekten av BC-23 i H1299-celler (figur 8). Tatt sammen, ligand- og sti-spesifikk celle-fri og celle-baserte analyser, så vel som
in silico molekylær
tilkoblings resultater, viste at BC-23 er en ny inhibitor av β-catenin /Tcf4 at spesifikt rettet mot β-catenin /Tcf4 samhandling og hemmer transkripsjonen aktivitet [38].
Konklusjon
Vi har identifisert og karakterisert et nytt lite molekyl BC-23 som er rettet mot samspillet av β- catenin /Tcf4 og hemmer transkripsjonen aktivitet. BC-23 regulerer ned to viktige Wnt /β-catenin pathway gener: c-myc og cyclin D1.
