Abstract
Tre-dimensjonale (3D)
in vitro
cellebaserte analyser for prostate Cancer (PCA) forskning er raskt blitt den foretrukne alternativ til den konvensjonelle 2D monolagkulturer. 3D-analyser mer presist etterligne mikro funnet
in vivo
, og dermed er ideell for å evaluere forbindelser og deres egnethet for progresjon i drug discovery rørledningen. For å oppnå den ønskede høye gjennomstrømning er nødvendig for de fleste screeningprogrammer, blir automatisert kvantifisering av 3D-kulturer nødvendig. Mot dette formål, dette papiret rapporter om utviklingen av en prototype analysemodul for en automatisert høy innholdsanalyse (HCA) system, som gjør det mulig for nøyaktig og rask etterforskning av
in vitro
3D cellekultur modeller for PCa . Java basert program, som vi har kalt PCaAnalyser, bruker nye algoritmer som gjør nøyaktig og rask kvantifisering av protein uttrykk i 3D cellekultur. Som konfigurert, kan PCaAnalyser kvantifisere en rekke biologiske parametere inkludert: kjerner-count, kjerner-sfæroide medlemskap prediksjon, forskjellige funksjoner basert klassifisering av perifere og ikke-perifere områder for å måle uttrykket av biomarkører og proteinbestanddeler kjent for å være assosiert med PCa progresjon, samt definere segregere cellulære objekter effektivt for et utvalg av signal-til-støy-forhold. I tillegg er PCaAnalyser arkitektur meget fleksibel, som opererer som en enkelt uavhengig analyse, så vel som i batch-modus; avgjørende for høy gjennomstrømming-Screening (HTS). Ved å benytte den PCaAnalyser, nøyaktig og rask analyse i en automatisert høy gjennomstrømning måte er gitt, og reproduserbar analyse av fordelingen og intensiteten av veletablerte markører assosiert med PCa progresjon i et utvalg av metastatiske PCA-cellelinjer (DU145 og PC3) i en 3D-modell demonstrerte
Citation. Hoque MT, Windus LCE, Lovitt CJ, Avery VM (2013) PCaAnalyser: En 2D-bildeanalyse basert modul for effektiv Fastsettelse av prostatakreft Progresjon i 3D kultur. PLoS ONE 8 (11): e79865. doi: 10,1371 /journal.pone.0079865
Redaktør: Gajendra P. S. Raghava, csir-Institutt for mikrobiologi Technology, India
mottatt: 24 mars 2013; Godkjent: 26 september 2013; Publisert: 20.11.2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Prostate Cancer Foundation of Australia tildelt VMA. TH erkjenner Louisiana styret i Regents gjennom styret i Regents Support Fund, LEQSF (2013-16) -RD-A-19 delvis for å utarbeide den endelige manuskriptet. CJL ble støttet av en australsk Postgraduate Award. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) har den høyeste forekomsten av kreft i Australia, med nesten 20.000 nye tilfeller diagnostisert hvert år [1]. Ved begynnelsen av PCa, innebærer behandling androgen ablasjon, som midlertidig bremser progresjon, men tilbakefall av kreft hos en androgen-uavhengig formen er felles [2]. På dette stadiet kan PCa ikke lenger bli styrt av standardbehandling, metastasering oppstår, som er den viktigste årsaken til dødelighet. Derfor er nye behandlingsformer som kreves for å bekjempe sykdommen før metastatisk progresjon.
Betydningen av å bruke 3D-modeller i evaluering av tumorutvikling har tidligere blitt beskrevet [3], [4]. Vi og andre har vist at 3D-kulturer ga et bedre grunnlag for studiet av faste tumormasser som tumorceller i dette mikromiljøet skjelne antigene profiler og fenotypisk oppførsel som etterligner mer presist tumorceller som finnes
in vivo product: [ ,,,0],3], [4]. 3D cellekultur muliggjør gjensidig samspill av celler av samme eller forskjellig opprinnelse i en matrise, som etterligner celle-celle og celle-matriks-interaksjoner som ligner på de som finnes
in vivo
. Videre er riktig justering og romlige organiseringen i 3D viktig for tumorprogresjon [5]. Tatt sammen tyder disse resultater på at 3D-kulturer kan tjene som et mer biologisk relevant modell i drug discovery rørledningen.
Antigeniske profiler av tumorer skåret ut fra avanserte PCA-pasienter har identifisert endringer i ekspresjonen av mange proteiner. Av disse androgen reseptor (AR) [6], α6 [7], [8] og ß1 inte subenheter [9], og mer nylig chemokin reseptor CXCR4 [10] Uttrykket har vært knyttet til økt Gleason grad og metastatisk spredning i PCa. Pasient tumorer stadig viser en opp-regulering av β1 integrin-underenheten [11] og kjemokinreseptoren CXCR4 [12], ledsaget av en omfordeling og nedregulering av integrin α6 [7], [8].
Tungt innblandet i PCa benmetastaser utvikling og progresjon er inte β1 subenheten [13] – [15]. Uttrykk for α5β1 og α2β1 på PCA celler har blitt rapportert å forenkle samhandling med bein stromale celler [15] og å aktivt fremme invasjon og etterlevelse av PCA celler til beinet stroma
in vitro product: [14] og eksperimentelle benmetastaser
in vivo product: [13]. På lignende måte er laminin-bindende integrin α6β1 har vist seg å muliggjøre ekstravasering av humane PCA-celler fra sirkulasjonen til benet stroma
in vivo product: [16] -. [18]
Tilsvarende studier har indikert at kjemokinet, CXCL12, spiller en rolle i kjøring av PCA-celler til benet. CXCL12 uttrykkes av stromale celler i målorganet for PCa metastase (ben, hjerne, lymfe), men ikke på andre vev [19] og dets reseptor, CXCR4, er sterkt uttrykt ved beinmetastatiske PCA-celler [20], [21]. Det var målet for nåværende studie for å evaluere og analysere uttrykk mønstre og fordelingen av disse veletablerte markører assosiert med PCa progresjon, ved å benytte en 3D-modell i forbindelse med høy gjennomstrømning bildeanalyse.
En annen svært innflytelsesrik protein som bidrar til utviklingen av PCa er AR [6]. AR tilhører en superfamilie av nukleære reseptorer og formidler virkningen av androgener så som 5-α-dihydrotestosteron (DHT). AR og dets aktiverende ligander spiller en viktig rolle i progresjon av PCa medierer responser av androgener og aktivere gentranskripsjon. Selv om mange av de godt karakteriserte virkninger av AR i PCA-cellene er avhengige av de genomiske virkninger som innebærer transkripsjon av målgener, ikke-genomiske effektene av androgener påvirker også celleadferd. Disse inkluderer aktivering av kinasekaskader og cytoskeletal omleiring som kan stimulere celle motilitet [22] – [24]
Tidligere har vi rapportert at PCa PC3 metastatiske celler gjen uttrykker ikke-transkripsjonelt aktive AR som er igjen. delvis mediert av Src-reaksjonsveien [4]. Utnytte en 3D-modell i forbindelse med høy gjennomstrømning bildeanalyse, det var et av formålene med gjeldende papir å vurdere potensialet funksjonelle relevansen av endogen AR oppregulering i denne cellelinjen og hvordan det kan påvirke andre viktige proteinbestanddeler kjent for å mekle PCa progresjon inkludert β1 inte.
evnen til å nøyaktig analysere flere bildeparametere hentet fra 3D cellekultur er oppdatert avhengige av høyt spesialiserte programmer som er på ingen måte automatiserte. Den eksisterende bildebehandlingsprogrammer lider i stor grad fra den iboende problemet med manglende evne til å raskt tilpasse og imøtekomme endrede krav effektivt [25]. Her har vi utviklet et automatisk bildeanalyse basert programvare kalt «PCaAnalyser» som er i stand til å analysere en rekke parametre målt i 3D cellekultur basert på 2D-bilder.
PCaAnalyser har blitt utviklet som en ImageJ [26 ] – [28] plugin, har derfor evnen til å dele og forbedre flere grunnleggende funksjonene som tilbys i ImageJ. Analysen utføres ved PCaAnalyser er en sammensetning av to store algoritmiske-grensesnitt. I det første trinn blir grensen for den cellulære 3D sfæroide detekteres og de nødvendige maskene er generert. I det andre trinn blir detektert kjerner og sfæroide-medlemskap er da forutsies ved hjelp av de masker og grensene. Lignende tilnærminger blir fulgt for å oppdage og studere cytoplasmatiske områder ved å segregere dem fra kritisk støy.
paradigme PCaAnalyser, inkludert rapportering komponent, har blitt designet for å være fleksibel slik at brukeren kan lett manipulere relatert analyse i et rekke måter, i tillegg til standardvalgene.
med hensyn til effektiviteten av PCaAnalyser, har vi innarbeidet en kandidat-medlemskap basert algoritme for å sette fart på kjernen-spheroid deteksjonsprosessen, noe som gjør den totale behandlingstiden betydelig raskere. Tid kompleksitet analysen er gitt i denne artikkelen, for å hjelpe til med beregninger av behandlingstiden, som er basert på de tilgjengelige data-parametere, slik som antall sfæroider per bilde, antallet kjerner pr kuleformet og omkretsen av kjernen. Denne funksjonen gir også et grunnlag for sammenligning av PCaAnalyser med andre publiserte algoritmer.
I denne studien, benyttet vi en Perkin Elmer Opera ™ [29], en høy gjennomstrømming confocal imaging system, for å generere output fra PCA 3D cellekultur modell i mikrotiterplate format som passer for HTS. Komplett rekonstruksjon av kulene i 3D var hukommelse og tidkrevende, og dermed 2D-bilde oppkjøpet av 3D-objekter, langs
xy
-planet, ble brukt som et alternativ. I denne populasjonen av sfæroider, 2D-bilde av 3D-objekter variert i oppløsning og skarphet på grunn av de forskjellige fokalplanene, og dermed fysiske dybder, samt sammensetningen av de forskjellige cellulære komponenter av 3D-objekter, som samlet laget segmentering og deteksjon utfordrende. Påvisning av ulike co-lokalisert og flere kontekstuelle objekter innenfor samme kanal-bilde også stilt betydelige utfordringer. PCaAnalyser har blitt designet for å kunne håndtere slike utfordringer. Dermed PCaAnalyser presenteres her gir en verdifull ressurs for undersøkelser ved hjelp av 3D-celle baserte modeller, spesielt for bruk i høy gjennomstrømning automatiserte systemer.
Utnyttelse PCaAnalyser, vi rapporterer her en vellykket analyse av fordeling og intensitet av godt etablerte markører assosiert med PCa progresjon i et utvalg av metastatiske PCA-cellelinjer (DU145 og PC3) i en 3D-modell. Nærmere bestemt har vi vist at som respons på liganden, SDF-1α, CXCR4 fordeling og uttrykk forandret, en indikasjon på en funksjonell reseptor. Videre presenterer vi her nye data vedrørende nedregulering av integrin β1 etter behandling med DHT. Disse resultater antyder at i PC3-celler, kan ikke-transkripsjonelt aktive AR mediere andre viktige proteiner forbundet med PCa progresjon. Disse resultatene har vidtrekkende implikasjoner vedrørende AR målrettet terapi i sent stadium PCa behandling.
Materialer og metoder
1. Cancer Cell Lines
DU145, PC3 og MDA-MB-231 cellelinjer ble kjøpt fra
American Tissue Culture Centre plakater (ATCC). PCA Du145 og PC3 cellelinjene ble holdt i RPMI-1640 (Invitrogen), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco). Breast Cancer (BCA) cellelinje MDA-MB-231 ble opprettholdt i DMEM-F12 (Invitrogen), supplert med 10% FBS. Alle celler ble formert ved 37 ° C i cellekulturbetingelser standard (5% CO
2, 37 ° C) i T75 Parfyme. Media var etterfylles hver 3. dag. Når cellene hadde nådd 80-90% konfluens de ble replated (1/10) i T75 kolber. Etter 10-12 passasjer ble cellene avviklet.
2. Miniaturised 3D-cellekulturer
For PCA-cellelinjer, ble cellene sådd ut på toppen av en 3D-matrise gellaget (Matrigel: BD Bioscience) i glassbunn 96-brønners plater (Matrical: PerkinElmer). For miniatyriserte 3D-kulturer, ble brønnene fylt med 60 ul Matrigel ™ /kulturmedium (70%) og polymerisert ved 37 ° C med 5% CO
2 i 1 time. Cellene ble deretter sådd ut på ~5000 celler per brønn og vedlikeholdt som tidligere beskrevet ovenfor. Media var nøye fjernet og etterfylles hver tredje dag. Kulturer ble opprettholdt i opptil 12 dager. For BCA cellelinjen MDA-MB-231, ble 1000 celler per brønn platet på toppen av 15 ul Growth Factor Redusert Matrigel (GFR Matrigel) i et 384-brønners CellCarrier plate (PerkinElmer).
3. Ligand and Drug Treatment Analyser
Ved hjelp av en 96-brønns plate format PC3 cellene ble dyrket i 3D Matrigel kulturer som beskrevet ovenfor. Etter 9 dager i kultur, ble 3D-celler behandlet med en naturlig androgen dihydrotestosteron (DHT, Sigma-Aldrich) i 30 timer i serumfritt medium ved 0, 1, 5 og 10 nM konsentrasjoner. Alternativt 3D-kulturer ble serum sultet i 16 timer og deretter behandlet med en CXCR4 ligand: SDF-1α: (30 ng /ml, R men vi har utvidet det videre til å bli brukt i
batch-modus
å utfylle
single-mode
alternativet. ImageJ er oppdatert tilsvarende og dermed til å bruke vår PCaAnalyser som et minimum, ImageJ versjon 1.44d er nødvendig.
En av de fem merkede delene knyttet til «maske-generasjonen» er synlig.
Totalt algoritmer for PCaAnalyser kan deles inn i følgende sekvenser:
i
) samlet spheroid deteksjon og maske generasjon,
ii
) kjernen og medlemsregistrering,
iii
) deteksjon og cytoplasma lese og
iv
) rapportering.
2,1 spheroid Detection og Mask Generation
Ch-en har bildet av kjerner, gruppert per spheroid . Ch-en til segmentet blir behandlet for å detektere komplett sfæroide området og grenser, slik at dannelsen av grense-masken ved hjelp av en algoritme (figur 2) og de tilsvarende store skritt er vist i figur 3. grensemaske benyttes for behandling bilder av Ch-2 for: (a) støyfjerning og (b) å lese intensiteter av cytoplasma og membranområder, som strekker seg fra null til høye verdier. Ch-2 har meget ujevn intensitet, inkludert verdier så lave som null for membranen og cytoplasma område av den sfæroide, og innbefatter mange høyere intensitet og lavere nivåer av SNR også. Derfor kan Ch-2 ikke benyttes til grense deteksjon av den sfæroide en pålitelig måte.
vanlige trinn i den sfæroide algoritme. Variabler med eksempelverdier er plassert i vinkelparenteser (dvs. … ).
De viktigste trinnene involvert i spheroid deteksjon er illustrert
Under behandling av Ch. -1, vanskelighetene forbundet med signaler som følge av ujevn belysning er erfarne. Ved hjelp av bakgrunnen subtraksjon med en passende radius av rullende ball-algoritmen, var vi i stand til å eliminere dette bildet beslektet gjenstanden. Forutsatt, gir høyden som en tredje dimensjon på en 2D overflaten av et bakgrunnsbilde, piksel intensitet proporsjonalt med det bildet. Med hensikten med å ha en jevn bakgrunn, kan den rullende ball algoritme anta en ball av valgt radius er rullet over 2D overflaten og skroget på volum nås med ballen er forventet smoothened bakgrunnen. For å oppnå dette, først den sfæroide-grensen ble påvist ved å øke kontrasten betraktelig (6 ganger) for å separere de lave signalene fra bakgrunnen. I det neste trinn ble to mulige måter anordnet for at brukeren kan gå videre: (a) auto eller (b) manuell for å identifisere den riktige kontur basert på dybden av det opprinnelige signal-gradient av 3D-objekter og andre morfologiske parametere, såsom sirkularitet og størrelse (område). Alternativer for å konvertere bilder til lavere bitrater nivåer ble også gitt, noe som bidrar til å skille den uønskede fragment i bildet som følge av ujevn belysning forårsaket av forsøksoppsettet.
Med de forhånds behandlet og gitt parametre, den ParticleAnalyzer var utplassert for å detektere sfæroidene – algoritmen ble påført på omtrent 1000 bilder, og den resulterende påvisning ble utført med mer enn 90% nøyaktighet, sammenlignet med manuell mikroskopi-analyse og enkle objektgjenkjenningsprogram. Per bilde, var det vanligvis 10 kuler i gjennomsnitt
2,2 Nucleus og medlemskap Detection
Signalet fra Ch-en ble brukt til kjernen deteksjon.; men den tilsvarende bilde hadde ujevn belysning som påvirket på effektiviteten av analyseprogrammet (se «originalbilde» i figur 3). Således var det nødvendig å bygge og innlemme minst 10 tilleggsparametere for å muliggjøre nøyaktig og pålitelig kjerne-deteksjon. Den endelige kjernen algoritme (Algoritme 2) utviklet har blitt beskrevet i detalj i figur 4.
De store skritt som kreves for kjernen algoritme. Variabler med eksempelverdier er plassert innenfor vinkelparenteser (dvs. … ).
Kjernen-image, tilgjengelig i Ch-en har også blitt brukt for spheroid deteksjon. Som vist i Algorithm 2, i det første tilfellet ble bakgrunns subtraksjon brukes til å redusere ujevn belysning, og bildeoppløsningen ble deretter slipt (trinn 3). Innenfor et gitt bilde, ikke alle kjernene ble funnet å ha den samme høyde langs z-aksen, resulterer i noen av dem være ute av fokus som de oppholdt seg i en alternativ fokalplanet i 3D sfæroide. Bruk av modulen «forbedring av skarphet «(ImageJ funksjon), var vi i stand til å redusere antall piksler, og dermed forbedre gjenkjenning av gitt signal. Vi har også brukt den «jevn drift «(ImageJ funksjon) modulen for å unngå ikke-glatt eller sikksakk typen grense påvisning av kjernen. En egnet terskel-algoritmen (trinn 5) ble deretter påført for segmentering og påvisning av kjernen. I tillegg ble den morfologiske filteret som ble brukt til å filtrere ut uønsket støy. Trinnene i denne analysen er vist i figur 5.
De kritiske trinnene involvert i nucleus-gjenkjenning, i tillegg til å utføre oppgaven med innkopiering tidligere genererte tilsvar sfæroide grenser.
I tillegg til de store skritt i å oppdage spheroid-medlemskap av en kjerne kvalitativt (figur 5), har vi samtidig kvantitativt oppdaget medlemskap. For dette har vi utviklet og distribuert algoritme 3 (figur 6). For å utføre den kandidaten-innsjekking Algoritme 3, ansatt vi bounder-box tilnærming for å oppdage om objektet Y er muligens inne objekt X eller ikke (figur 7).
De store skritt i å oppdage spheroid-medlemskap i en kjernen vises.
for å utføre kandidaten-innsjekking algoritme 3 primært oppdage om objektet Y er muligens inne objekt X eller ikke, ved hjelp av bounder-box tilnærming. I tilfelle av (A), er objektet Y inne objekt X, derfor må i det minste ett hjørne av bounder-boks av Y være innsiden av bounder-boks av X. Men selv om noen av hjørnene av bounder -box av Y er inne X-Y kan faktisk ikke være inne i X, for eksempel, sak (B).
2,3 deteksjon og måling av intensiteter av membran og Cytoplasm Områder
den informasjon som er tilgjengelig gjennom Ch-2 er forventet å ha forskjellige intensitetsnivåer (signaler) rundt membranen og cytoplasmiske område av den sfæroide. Aktuelle områder ble segmentert ved å generere grensen-maske av spheroid i de forrige trinnene (seksjon 2.1). Dermed kunne vi lese pålitelig lavere intensitet av den ikke-bakgrunnen området og for å unngå støyende områder.
Et mål var å analysere cellene ikke bare basert på gjennomsnittlig intensitet, men også om fordeling av gitte proteiner. Å fastslå om ekspresjonen av proteiner som befinner seg hovedsakelig på celle-celle kryss, eller i cytoplasma, vil bidra til å bekrefte både basal uttrykk nivåer i kreft og ikke-kreftceller, og i hvilken grad visse behandlinger har på proteinekspresjon. Algoritmen er involvert i å måle intensitet og klassifisere intensitetsfordeling gir 4 mulige store kombinasjoner (figur 8) som muliggjør en grad av frihet til å studere ulike mønstre av intensitetsfordeling, spesielt viktige for klassifisering perifer og ikke-periferiområdet. Vi definerer segregering av de områdene i en automatisert og reproduserbar måte i fire mulige måter. De beskrives som:.
Måling intensiteter og klassifisering av intensitetsfordelingen
i) Definer fast bredde fra grensen og område definert av grense maske. Denne kombinasjonen vil lese hele området innenfor masken og vil klassifisere det målte området i to forskjellige områder: «perifer-område «av bredde
x plakater (variable) piksler inne fra grensen og den gjenværende ikke-periferiområdet (Figur 9).
Store trinnene involvert i å generere klassifisert lese-kartet.
ii) Definer fast bredde fra grensen og felles området av masken og over terskelen. Disse kombinasjonene er lik den ovennevnte alternativet, som er
antall
– (
i
), med unntak av stedet for å lese hele området inne i masken, vil det ta hensyn til disse intensitetene som er over den tildelte terskelverdi. De viktigste trinn er vist i figur 10. Terskelen kan tilordnes automatisk, så vel som manuelt ved hjelp av dialogen vist i figur 11. Det er også mulig å kontrollere effekten visuelt. En tilsvarende dialog er tilgjengelig i ImageJ, er imidlertid ImageJ versjonen av dialogboksen begrenset i går valgte terskelverdier i de tilpassede plug-ins av PCaAnalyser. Derfor har vi utviklet en lignende, men utvidet dialog (figur 11) for PCaAnalyser.
De viktigste trinnene involvert i å generere klassifisert lese-kart via grense maske og terskel-maske. Bilder skildre en DU145 spheroid vokst i en 3D-matrise følgende immuno-merking for α6 inte subenheten. Paneler i denne figuren refererer til intensiteten av antistoffet og fordeling av den α6 integrin-underenheten. Merking var til stede hovedsakelig i det perifere området av den sfæroide struktur.
iii) Proporsjonal bredde fra midten av den sfæroide (objekt) med en faktor y (hvor,) og området som defineres av grense-maske. I motsetning til fast bredde, dette alternativet bestemmer først midt på objektet og gjelder deretter proporsjonal bredde for å klassifisere en piksel basert på om den tilhører perifer eller til ikke-periferiområdet. Denne prosessen er vist i figur 12A.
A) trinn er involvert i behandlingen lese-kart klassifikasjoner med alternativer som er angitt for proporsjonal bredde og grense maske. Bilder skildre en DU145 spheroid i en 3D-matrise følgende immuno-merking for β1 inte subenhet. Paneler i denne figuren refererer til intensiteten av antistoffet og fordeling av den β1 integrin subenheten. Fordelingen av β1 forble hovedsakelig rundt den ytre membran /periferiparti av den sfæroide. B) Originalbilde av DU145 spheroid B «) Anvendelse av PCaAnalyser utnytte klumpbrytende funksjoner, etter forstørrelses signalet programvaren finnes ikke-null signaler i mellom de to kulene som massene og oppdaget det som en enkelt spheroid.
det perifere versus ikke-perifer funksjon (figur. 12A) var spesielt nyttig for å undersøke kjemokinreseptoren, CXCR4, uttrykk og distribusjon i respons til ligand behandling. Vårt mål var å vurdere om det var forskjeller i uttrykk i både fravær og nærvær av sin ligand, SDF-1α. I fravær av SDF1α ble CXCR4-proteinet bare uttrykt på de perifere områder av sfæroidene. Etter behandling, men de CXCR4 uttrykk endringer og migrerer videre inn i midten av den sfæroide, og ble funnet i de ikke-randområdene. Derfor gjør denne analysen validering om hvorvidt eller ikke et protein som er funksjonelt i 3D-cellekulturmodellsystem, eller ikke.
iv) Proporsjonal bredde fra midten av den sfæroide (objekt) med en faktor y (der ,) og området som defineres av grense-maske og den terskel-maske. Dette er det samme som den umiddelbare foregående kombinasjonen (
antall
– (
iii
)), med unntak av at skrivekartet ekskluderer de bildeelementer som er under den (øvre) verdien av tildelte terskel-maske.
Visuelt bildet vist i figur 12A kunne sees på som to separate kuler i umiddelbar nærhet av hverandre. Imidlertid er det kjent at over tid i kultur, kan sfæroidene slå sammen og smelter sammen til større masser [3]. Det var derfor viktig å formulere en prosess som kan bekrefte en enkelt vs smeltet objekt. Vi oppnådd dette via en funksjon kalt «false klump-breaking» kandidat. Denne funksjonen hjelper PCaAnalyser programvaren for å fastslå hvorvidt kuler virkelig er tilkoblet eller ikke. Den falske klumpe-breaking er vanskelig å oppdage visuelt, men PCaAnalyser løser dette problemet ved å forsterke signalet som mer tydelig definere den situasjon hvor lavt signal foreligger (dvs. falsk klumpe bryt kandidat) versus intet signal foreligger (dvs. sann clump- bryte kandidat). Prinsippet er at forsterkningen av «no signal «vil forbli null.
