Abstract
Overuttrykte av kation-gjennomtrengelig kanal TRPM8 i prostatakreft kan representere en ny mulighet for deres behandling. Hemmere av TRPM8 redusere veksten av prostata kreft celler. Vi har brukt to nylig beskrevet og svært spesifikke blokkere, AMTB og JNJ41876666, og RNAi å bestemme relevansen av TRPM8 uttrykk i spredning av ikke-tumor og kreftceller. Hemming av uttrykket eller funksjon av kanalen reduserer spredning priser og proliferativ brøkdel i alle kreftceller testet, men ikke av ikke-tumor prostata celler. Vi observerte ingen konsekvent akselerasjon av vekst etter stimulering av kanalen med mentol eller icilin, noe som indikerer at basal TRPM8 uttrykk er nok til å opprettholde veksten av prostata kreft celler
Citation. Valero ML, Mello de Queiroz F, Stühmer W , Viana F, Pardo LA (2012) TRPM8 ionekanaler Forskjellig modulere spredning og Cell Cycle Fordeling av Normal og kreft prostata celler. PLoS ONE 7 (12): e51825. doi: 10,1371 /journal.pone.0051825
Redaktør: Alexander A. Mongin, Albany Medical College, USA
mottatt: 6 juli 2012; Godkjent: 06.11.2012; Publisert: 14.12.2012
Copyright: © 2012 Valero et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Finansiert av Max-Planck Society og tilskudd SAF2010-14990 og PROMETEO2010-046 til FV. MV var mottakeren av en predoctoral fellesskap av den spanske regjeringen (F.P.I). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
TRPM8 er et kalsium-gjennomtrengelig, ikke-selektiv kation kanal av den forbigående reseptor superfamilien potensialet [1] som er nødvendig for transduksjon av moderate lave temperaturer [2], [3]. Tilstedeværelsen av TRPM8 i kaldt-responsive liten diameter nevroner i dorsale rotganglier og trigeminal ganglia og fenotypen påvist i TRPM8 – /- knockout mus støtter en rolle TRPM8 i thermosensation og nocicepsjon [4] – [6]. TRPM8 kanaler har blitt klonet fra arter i forskjellige slekter, fra amfibier til mennesker [7]. Humant TRPM8 ble først identifisert i løpet av en skjerm for oppregulert gener i prostata cancer (og derfor betegnes trp-p8 [8], men senere påvist i andre tumortyper, [9], [10]. Blant normale vev ekspresjonen av kanalen er meget begrenset til en subpopulasjon av primære sensoriske nevroner [2], [3], men det er også til stede i det mannlige reproduksjonssystemet i betydelige mengder [2], [3], [8], [9], [11], [12]
Aktivering av endogene (dvs. neuronal) eller rekombinante TRPM8 kanaler gir opphav til en signatur strøm, karakterisert ved ekstreme ytre likeretting og spenningsavhengig gating [13] -.. [15] TRPM8 kanaler kan aktiveres ved spesifikke og selektive agonister, enten naturlig (som eucalyptol og mentol) eller syntetiske forbindelser som den superkjølemiddel icilin, som er så langt den mest potente agonist av TRPM8 [2], [3], [16] – [19] . Andre agonister (linalool, geraniol, blant andre) ble identifisert ved screening av mentol derivater eller odorant-forbindelser. spesielt kan geraniol være en fysiologisk aktivator av TRPM8 fordi det er et mellomprodukt i løpet av kolesterolsyntese og den induserer proliferasjon i prostata epitel. Alle kjente TRPM8 agonister indusere en kjølende effekt, forsterkende konseptet med en rolle av TRPM8 i kaldt oppfatning [20].
TRPM8 mRNA påvist i ondartede celler, og dette er blitt grundig undersøkt i prostata kreft. TRPM8 mRNA ble sterkt overuttrykt i godt differensierte tidlig prostatakreft. I en typisk modell for androgen-avhengig prostata cancer (LNCaP-celler, epitelceller apikale celler med en sekretorisk fenotype) ekspresjon blir registrert ved både plasmamembranen og det endoplasmatiske retikulum, hvor det kan virke som en Ca
2+ frigivelse kanal [ ,,,0],18], [19], [21] – [23]. Plasmamembran TRPM8 kan utøve en beskyttende effekt, siden aktivering av TRPM8 av PSA (prostata spesifikt antigen) redusert cellemotilitet i PC3 celler [24].
TRPM8 kan være en nyttig markør for prostatakreft utfallet, siden tap av TRPM8 uttrykk synes å være knyttet til overgangen til androgen uavhengighet og dårlig prognose [19], [21], [25]. Dette kan gjenspeile effekten av androgener på TRPM8 uttrykk, siden genet viser ti antatte androgen responsive elementer [18]. Unormale nivåer av TRPM8 mRNA kan også være en indikasjon på metastatisk sykdom [26].
Canonical TRPM8 kanal funksjonen kan bli blokkert av urea forbindelser (se nedenfor), som også er kjent for å hemme TRPV1 [17], [25 ], [27]. Dette begrenser bruken av slike blokkeringer i studiet av rollen til TRPM8 i prostata kreft fordi cellene uttrykker også TRPV1 [28]. I dag er den eneste mulige måten for spesifikt å dissekere rolle av kanalen i prostata kreft ved bruk av siRNA. RNA interferens kan produsere en effektiv og spesifikk banke ned av et bestemt gen
in vivo Hotell og
in vitro product: [29], [30].
I denne studien undersøkte vi effektene som TRPM8 lyddemping har på celle overlevelse og celleproliferasjon av tre menneskelige prostata cellelinjer, LNCaP, PC3 og DU145. LNCaP er sterkt androgen-avhengige [19] mens DU145 er androgen-uavhengig [31] og PC3 ville representere en mellomstatus [32]. Vi studerte også virkemåten i denne forbindelse av et ikke-tumoral (SV40 udødelig) prostata cellelinje, PNT1A [33]. Hemming av uttrykket eller funksjon av kanal redusert spredning priser og proliferativ brøkdel i alle kreftceller testet, men ikke av ikke-tumor prostata celler.
Materialer og metoder
Cell Culture
Prostata-avledede cellelinjer PNT1A (ECACC 95012614), LNCaP (DSMZ ACC 256), PC3 (DSMZ ACC 465) og DU145 (DSMZ ACC 261) ble oppnådd fra DSMZ (Braunschweig, Tyskland) eller ECACC (Salisbury, UK) . Hver linje ble spredd og vedlikeholdt i henhold til instruksjonene fra den tilsvarende leverandør. Identitet av tumorcellelinjer ble bekreftet gjennom uttrykket av spesifikke markører (PC3 AR-, ERα +, ERβ +, PSA-, DD3-, DU145 AR-, ERα-, ERβ +, PSA-, DD3-; LNCaP AR +, ERα- , ERβ +, PSA +, DD3 +;. Paul Thelen, Department of Urology, universitetssykehus Göttingen)
siRNA transfections
Transfeksjon med sirnas (25 nm) ble utført ved hjelp av enten Lipofectamine 2000 eller Lipofectamine RNAiMAX reagenser i OptiMem medium (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Tyskland) 24 timer etter plating. Fire forskjellige sirnas ble utformet for å målrette hTRPM8 kanal med HiPerformance siRNA Design algoritme (Qiagen). Følgende hTRPM8 (NM_024080) sekvenser ble brukt: TRPM8.1, tcgaatgttctcacctattaa; TRPM8.2, aaggttagattccaataaata; TRPM8.3, cagaatgttatcatactacat og TRPM8.4, ccgggacgagatggacataga.
Alle sirnas ble syntetisert av Qiagen (Hilden, Tyskland), med unntak av den kommersielle negativ kontroll # 1 og den menneskelige GAPDH siRNA (Ambion, Darmstadt, Tyskland), som vi anvendt som negative og positive kontroller, henholdsvis. Cellene ble inkubert med siRNA og transfeksjon reagens i 6 timer og høstet for eksperimentene like etter slutten av transfeksjon. I tillegg, ble celler behandlet med kun OptiMem og den tilsvarende transfeksjon reagens ble inkludert som kontroller.
qPCR
Total RNA erholdt fra kulturer ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ble revers transkribert ( Superscript, Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) med oligo-dT og genspesifikke primere for hTRPM8 (5′-cttgggcaaaacacacaatg-3 «). Real-time PCR ble utført på malen bruker TaqMan system i en AbiPrism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, California) eller en LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Tyskland). De følgende fragmenter ble amplifisert: nt 2910-3058 fra sekvens NM_024080.4 ble påvist med den hTRPM8 sonde (5»-FAM-tcgccatgtttggctacacggtgggcacc-TAMRA-3 «) og nt 1632-1732 fra sekvens NM_003234 ble påvist med den hTFR sonde (5 «-Joe-tgaatggctagagggatacctttcgtccc- (6-TAMRA) -3»). Den humane transferrin-reseptor ble anvendt som en kontroll for RNA templat integritet og PCR-resultater. Relativ kvantifisering ble utført ved bruk av REST-programvaren (Relative Expression Software Tool; [34], [35])
flowcytometrisystemer
siRNA: Etter behandling med siRNA ble cellene sådd ut i 6-. brønns plater og ble inkubert i 24 til 120 timer før målingene. Cellene ble trypsinert, vasket to ganger med PBS og deretter holdt på is. For cellesyklus målinger ble cellene inkubert med 50 ug /ml propidiumjodid (PI), 0,3% saponine og 100 U /ml RNase. For levedyktighet målinger ble ikke-levedyktige celler detektert ved farging med 10 ug /ml PI i PBS. Prøvene ble analysert på en BD FACSAria flowcytometer (Becton Dickinson, Heidelberg, Tyskland). Propidiumjodid ble eksitert ved 488 nm og fluorescens ble oppsamlet under anvendelse av et 595 nm dikroisk speil og 610/20 nm båndpassfilter (for cellesyklus), eller 655 nm dikroisk speil og 695/40 nm båndpassfilter (for levedyktighet) . Gates for levedyktige celler ble etablert av forward- og side scatter og cellesyklus faser ble bestemt ved bruk av FlowJo programvare (Tre stjerners Inc., Ashland, USA). Alternativt kan den prosentandel av levedyktige celler ble bestemt ved direkte PI eksklusjon.
For eksperimenter i nærvær av mentol og icilin ble cellene sådd ut i 6-brønns plater og inkubert i 24 til 168 timer med 125-300 pM mentol eller 10 mm icilin før målinger. Cellene ble trypsinert, og vasket to ganger med PBS. Prøvene ble behandlet og analysert for cellesyklus og levedyktighet målinger som beskrevet tidligere.
Kalsium Imaging
kalsium bildebehandling eksperimenter ble utført med den fluorescerende indikator Fura-2. Før hvert forsøk ble cellene inkubert med 5 uM acetoxymethylester form av Fura-2 (Fura-2AM; Invitrogen) i 45 minutter ved 37 ° C. Etter dette ble 250 uM av sulfinpyrazon tilsatt i ytterligere 20 min for å blokkere anion transporter som hemmer lasting med Fura-2AM i kreftcellelinjer. Fluorescens målingene ble gjort i et Leica (Nussloch, Tyskland) DM IRE2 invertert mikroskop utstyrt en 12-bit med avkjølt CCD-kamera (Imago QE Sensicam; TILL Photonics, Graefelfing Tyskland). Fura2 ble begeistret ved 340 og 380 nm med en Polychrome IV monokromator (TILL Photonics) og slippes fluorescens ble filtrert gjennom et 510 nm lange pass filter. Kalibrerte forhold ble vist på linje ved 0,5 Hz ved hjelp TILL Vision programvare versjon 4.01 (TILL Photonics). Kalsium bildebehandling eksperimenter ble utført samtidig med temperatur opptak. Badoppløsningen, referert til som «kontrolloppløsning», inneholdt (mM): NaCl 140, KCl 3, CaCh
2 2,4, MgCl
2 1,3, Hepes 10 og glukose 10, og ble justert til pH 7,4 med NaOH.
proliferasjonsanalyser
sprednings ble estimert basert på evnen til metabolsk aktive celler til å redusere tetrazoliumsalter til farget formazan (3- (4,5-2-yl) -2 , 5-difenyltetrazoliumbromid, MTT, Sigma-Aldrich). Cellene ble trypsinisert og utplatet i flatbunnede 96-brønners plater med en tetthet som strekker seg fra 2000 til 5000 celler /brønn avhengig av cellelinjen undersøkt. For å bestemme den metabolske aktivitet, ble 10 ul av MTT-reagens tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer. Absorbansen av det produserte formazan ble bestemt i en Victor2 plateleser (Wallac) ved anvendelse av 570 nm og 630 nm eksitasjon filtre. For eksperimenter med mentol, ble mediet fornyes hver 48. time både i test- og kontrollbrønner
sårtilheling analysen
Celler ble først dyrket til samløpet ( 90%). I 6- vel retter. Et lite område ble deretter avbrutt ved å skrape den monolayer med en 1000 mL plast pipette tips. Deretter ble cellene dyrket i 12, 24 eller 48 timer under forskjellige eksperimentelle betingelser: lavt serum eller enten bærer eller legemiddelholdig medium. Celler ble inspisert mikroskopisk over tid. De resterende sår området ble beregnet ved hjelp av Coreldraw programvare og migrasjon avstand av cellene ble beregnet på grunnlag av denne beregningen
Narkotika
4- (3-klor-pyridin-2-yl). – piperazin-1-karboksylsyre (4-tert-butyl-fenyl) -amid (BCTC) var en generøs gave fra Grünenthals AG (Aachen, Tyskland). [L-arginyl] – [N- [2,4-dichlorophenethyl] glycyl] -N- (2,4-dichlorophenethyl) glycinamid (DD01050, (H-Arg-15-15 C i [36]), var en gave fra Dr. A. Ferrer-Montiel (Universidad Miguel Hernández, Spania) AMTB (N- (3-aminopropyl) -2 -. [(3-metylfenyl) metoksy] -N- (2-tienylmetyl) -benzamid-hydroklorid (1: 1) hyclate) en roman, svært selektiv TRPM8 antagonist var en sjenerøs gave av Dr. Stuart Bevan (Kings College, London) JNJ41876666 (forbindelse 5 i referanse [37].; 3-[7-Trifluoromethyl-5-(2-trifluoromethyl-phenyl)-1
H-
benzimidazol-2-yl]-1-oxa-2-aza-spiro[4.5]dec-2-ene Hydroklorid,), en potent TRPM8 antagonist, var en generøs gave fra Janssen Research .. Development, LLC (Spring House, PA) Figur 1 viser de kjemiske strukturer av legemidler som brukes
Statistiske. analyse
data er presentert som gjennomsnitt ± SEM hentet fra minst tre uavhengige eksperimenter Statistisk signifikans ble evaluert av Student t test p-verdier er angitt i figurene med stjerner nær den tilsvarende kolonnen eller symbol * p 0,05, ** p 0,01; *** p. 0,005
Resultater
Påvisning av TRPM8 Expression i prostata og prostata cellelinjer
TRPM8 uttrykk er mest tallrike i nervevev og den mannlige reproduksjonssystemet. Tidligere studier beskrevet overekspresjon av TRPM8 i prostatakreft og cellelinjer avledet fra prostatakreft, spesielt LNCaP [8]. Andre cellelinjer ble funnet negativ i disse rapportene. Mer nylig ble PC3 celler rapportert svakt positiv ved western blot [21]. Vi setter å bestemme ekspresjonsnivå av TRPM8 i prostatakreftceller LNCaP, PC3 og DU145 og den ikke-tumorcellelinje PNT1A fra ulike metoder for å ekspandere og utfylle resultatene som er angitt for [38].
Først ble TRPM8 mRNA innholdet bestemt ved revers-transkripsjon real-time PCR (QRT-PCR) ved anvendelse av TaqMan prober i normal human hjerne, prostata, og cellelinjer LNCaP, PC3, DU145 (avledet fra tumorer) og PNT1A (udødeliggjort ikke-transformerte prostatacellelinje). RNA integritet og revers transkripsjon ble kontrollert ved hjelp av menneskelig transferrin reseptor som referanse for normalisering. mRNA for TRPM8 ble påvist i hjerne og prostata, med maksimale nivåer i friske prostata (ikke vist). Meldingen ble også påvist i alle humane cellelinjer som ble testet, LNCaP, PC3, DU145 og PNT1A. Som rapportert tidligere, nivåer i den ikke-tumorlinjen PNTA1 var signifikant lavere enn i de kreftcellelinjer. Den relative mengden av TRPM8 budskap var DU145≈LNCaP PC3 PNT1A
A (figur 2A.).. mRNA overflod ble bestemt av real time PCR på cDNA avledet fra RNA fra den angitte kilden. Den humane transferrin-reseptor ble anvendt som referanse husholdningsgenet. RNA overflod er uttrykt som normaliserte verdier enn PNT1A. Stjerner indikerer statistisk signifikans med hensyn til PNT1A. B-C. DU145 cellene reagerer på kulde og mentol. B. Overført (til venstre) og pseudocolor ratiometrisk [Ca
2 +]
i bilder som viser et eksempel på responsen til DU145 cellene til kaldt (18 ° C) og mentol 500 mikrometer. C. [Ca
2 +]
i responser av en kald og mentol-sensitive celle (C1) sammenlignet med en kald-insensitive, menthol-insensitive DU145 celle (C2). D-F. Respons på kulde er redusert ved TRPM8 knockdown i DU145 cellene. Pseudocolor ratiometrisk [Ca
2 +]
i bildene i celler transfektert med kontroll siRNA (D) eller med TRPM8.4 siRNA (E) ved 37 ° C (øvre panelene) eller 18 ° C (nedre paneler). Individuell [Ca
2 +]
I svarene er representert til høyre for de tilsvarende bildene. Amplituden og fraksjonen av celler som reagerer på kalde stimuli er tydelig redusert i TRPM8 siRNA-behandlede kulturer. Denne effekten er kvantitativt avbildet i F.
Fra disse resultatene, konkluderer vi med at TRPM8 er uttrykt i alle prostatacellelinjer som ble testet. Videre synes proteinet for å danne funksjonelle kanaler. I våre hender, DU145 (fig. 2B, C), LnCap og PC3 (data ikke vist) celler viser en økning i intracellulær Ca
2 + nivåer ved stimulering av mentol (500 uM) og moderat kald (reduksjon i temperatur fra 36 ° C til 18 ° C), er kompatibel med den funksjonelle ekspresjon av TRPM8. Kald vakte reaksjoner i DU145 cellene ble sterkt redusert av siRNA rettet mot TRPM8 (Fig. 2D-F).
Effekt av TRPM8 stopper på spredning av prostatakreft cellelinjer
Forsøkene beskrevet så langt støtter forestillingen om at TRPM8 uttrykk skjer både i normale prostata og tumorceller. Spørsmålet er imidlertid om hemming av TRPM8 har lignende effekter i alle celletyper. Vårt viktigste mål var å teste om TRPM8 aktivitet er et generelt krav om spredning av ulike prostatakreftcellelinjer. . For å teste dette, brukte vi farmakologiske TRPM8 blokkere [39] og siRNA teknologi
stopper brukt (Fig. 1) var klotrimazol (EF
50 200 nM) [40]; BCTC, en blokkerende middel av TRPV1 kanaler [41] og mus, rotte og menneskelige TRPM8 kanaler (med EF
50 på ca 0,6-1 mm) [13], [17], [27], [42]; tio-BCTC, en mindre aktiv (EF
50 3,5 mikrometer) analog av BCTC; og DD01050, en roman TRPV1 kanalblokker som blokkerer også TRPM8 i nevroner og HEK293 celler (EF
50 ca 1 mm) [38]. Proliferasjon ble bestemt ved å anvende MTT-analyser (fig. 3), og effekten av disse stoffene og en mer selektiv TRPM8 antagonist (se nedenfor) på cellesyklusfordelingen og cellelevedyktigheten ble bestemt ved flow-cytometri (fig. 4).
Vekst av de angitte cellelinjer i nærvær av TRPM8 inhibitorer. MTT hydrolyse, uttrykt som tredobbel økning, er blitt normalisert til et nivå på tidspunktet 0. Klotrimazol (fylte kvadrater), BCTC (skraverte sirkler), tio-BCTC (åpne firkanter) og DD01050 (triangler) over 5 dager etter eksperimentet. Datapunkter representerer gjennomsnittet av 4 eksperimenter ± SEM. *:
p
0,05; **:
p
0,01; ***:
p
0,005. De blokkere ble anvendt i en sluttkonsentrasjon på 10 uM.
Histogrammene viser endringer i den proliferative fraksjonen i nærvær av kanalblokkere som bestemt ved flow-cytometri cellesyklusanalyse. Alle legemidler ble anvendt ved en konsentrasjon på 10 uM. Den proliferative brøkdel etter kontroll forhold (kjøretøy-behandlede celler) har vært ansett som 100% av spredning.
Clotrimazole er en veletablert inhibitor av kreft celle spredning trolig gjennom flere mål, inkludert mellom ledningsevne kalsiumaktiverte K
+ kanaler [43]. Ved en konsentrasjon som brukes (10 uM), klotrimazol inhiberte proliferasjon av alle tumorcellelinjer med 60 til 80% etter fem dager, men påvirket ikke veksten av PNT1A celler (Fig. 3). BCTC 10 mikrometer viste en lignende oppførsel til klotrimazol, siden det sterkt redusert spredning av alle cellelinjer (50-70%), men PNT1A. Virkningene av BCTC synes å forekomme, i det minste delvis (se nedenfor), gjennom sin virkning på TRPM8, ettersom tio-BCTC var klart mindre effektivt i alle linjene som ble testet. Noe overraskende, DD01050 (10 mm) induserte en signifikant hemming bare i PC3 celler til et nivå tilsvarende andre hemmere, men det viste ingen signifikant hemming på annen cellelinje (Fig. 3).
inhibering av proliferasjon korrelerte godt med den proliferative fraksjon som ble målt som prosentandelen av celler i S /G2 /M-fasene av cellesyklusen. Som vist på fig. 4, er den relative styrken på hver blocker også reflekteres i nedgangen i proliferativ brøkdel indusert. Ingen av de testede legemidler endret proliferative fraksjon av PNT1A celler. På den annen side, både klotrimazol og BCTC (begge ved 10 uM), redusert av cellene i S /G2 /M-fasene i alle tumorcellelinjer, mens 10 uM tio-BCTC var mindre potent og DD01050 var mest effektive på PC3-celler. Vi testet også effekten av AMTB og JNJ41876666, ny og meget spesifikke inhibitorer TRPM8 [37], [44], på alle cellelinjene. På 10 mikrometer, begge legemidlene reduserte proliferative brøkdel av kreft cellelinjer samtidig la PNT1A celler upåvirket. Vi observerte ikke noen cytotoksiske effekter av legemidler ved de konsentrasjonene som brukes (ikke vist). Kollektivt, resultatene oppnådd med de ulike stopper er i samsvar med det syn at hemming av TRPM8 resulterer i en redusert spredning i prostata kreft celler.
Knock Down av TRPM8 Message Reduserer Prostate Cancer Cell Proliferation
for å oppnå en mer direkte sammenheng mellom TRPM8 ekspresjon og tumorcelle-proliferasjon, anvendte vi siRNA mot TRPM8 og måles dens virkning på proliferasjon og cellesyklusfordelingen i de tre tumorprostatacellelinjer og de ikke-tumoral en. Som en positiv kontroll brukte vi siRNA rettet mot hGAPDH. Som GAPDH er et nøkkelenzym i glykolysen, er reduksjon av proteinet reflektert på metabolsk aktivitet i transfekterte celler. Dette ble demonstrert for de fire cellelinjer ved MTT-analyser (ikke vist) og flowcytometri (Fig. 5A).
Effekten av GAPDH-knockdown på den proliferative fraksjon av hver cellelinje ble bestemt. Som forventet, hemmer GAPDH knockdown proliferasjon i alle celletyper. B. Tid løpet av reduksjon i TRPM8 RNA innhold av det indikerte TRPM8 siRNA behandling. TRPM8 meldingen ble bestemt ved de angitte tider etter transfeksjon. Relativ rikelighet er referert til mengden av mRNA ved tiden 0 og korrigert for ekspresjon av transferrin-reseptoren som kontroll. C. TRPM8 protein knockdown av TRPM8.3 og TRPM8.4 siRNA 48 timer etter transfeksjon. Actin ble brukt som lasting kontroll, og densitometrisk kvantifisering i forhold til kontroll siRNA er presentert på høyre stolpediagram.
Bruk av flere funksjonelle sirnas anbefales å sikre spesifisitet av de fenotypiske effekter observert fordi sekvenser målrettet mot forskjellige deler av meldingen skal ha kvalitativt de samme effekter. Kvantitativt forskjellige sirnas rettet mot samme genet er ofte ikke like effektive på grunn av termodynamiske egenskaper, stabilitet og posisjonering av enten sirnas selv eller av målområdet av genet. Vi testet derfor fire forskjellige siRNAs rettet mot TRPM8, som har blitt utpekt TRPM8.1-4. Disse sirnas gjenkjenne forskjellige målsekvenser i TRPM8 og ulik stanse styrke i de forskjellige cellelinjer. For å redusere muligheten for off-target effekter, brukte vi en lav konsentrasjon av siRNA (25 nM) og optimalisert transfeksjon tid. For dette vi inkuberes hver celletype med ekvilibrert siRNA-transfeksjon reagensblanding for 4, 6, 8, 12 og 24 timer, og overvåket 24 og 48 timer etter den relative reduksjonen i TRPM8 fremkalt ved TRPM8.3 og TRPM8.4 ved hjelp real Time PCR; TRPM8.3 og TRPM8.4 var effektive på RNA-nivå i alle de fire testede cellelinjer (inkludert PNT1A) etter inkubasjon av 6 timer med siRNA. Vi har også optimalisert inkubasjonstiden etter siRNA transfeksjon ved å følge overflod av TRPM8 mRNA ved 12, 24, 72 og 120 timer. For PNT1A, LNCaP og PC3 maksimal reduksjon av TRPM8 melding ved hjelp av TRPM8.4 siRNA ble observert ved 72 timer, mens DU145 viste maksimal effekt allerede ved 48 timer (fig. 5B). Stanse av TRPM8 induserte en reduksjon i proliferasjon målt ved MTT-analyser i PC3 cellelinje. MTT hydrolyse i PNT1A, DU145 og LNCaP-celler ble ikke åpenbart påvirket av siRNA (ikke vist). Dette er sannsynligvis en refleksjon av de forskjellige optimale tider for RNA-knockdown, fordi man skulle forvente en forskyvning av flere timer mellom reduksjonen i TRPM8 meldingen og effekter på proliferasjon, som vil avhenge av doblingstiden og tiden som er nødvendig for proteinknockdown begge som er forskjellig for hver celletype. Reduksjonen av mRNA korrelert med en tydelig reduksjon av protein med omtrent 50% i alle cellelinjer etter 48 timer (figur 5C), men den ufullstendige knockdown kan forklare mangelen på effekter på MTT hydrolyse.
Av denne grunn utførte vi målinger av proliferativ fraksjon, som viste mer følsom. Vi har oppdaget at en reduksjon i andelen av celler i S /G2 /M-fasene av cellesyklusen i alle tumorcellelinjer, men ikke observert noen effekt på ikke-tumorceller PNT1A. Et eksempel på cellesyklus fordelingsmålinger i DU145-celler er vist i fig. 6A. En reduksjon i S og G2 /M-celler er klart sett etter siRNA behandling. Utfallet av de to effektive sirnas var forskjellig avhengig av cellelinjer; PC3 og LNCaP reagerte bare til en av de to sekvenser (TRPM8.4, fig. 6B), mens for DU145 begge sekvenser var effektive.
. Representant cellesyklusen histogram av DU145 celler transfektert med kontroll (øverst) eller hTRPM8 siRNA (nederst). Den proliferative fraksjon (S /G2 /M) er tydelig redusert etter TRPM8 knockdown. B. Proliferativ fraksjon (%) av celler transfektert med kontroll eller anti TRPM8 siRNA (sekvenser 3 og 4). Stolpene representerer gjennomsnittet av 3-5 eksperimenter. C. BCTC opprettholder sin hemmende effekt etter lyddemping av TRPM8. Normalisert vekst av DU145-celler i nærvær av 10 uM BCTC, etter transfeksjon av cellene med kontroll (hvit kolonne) eller TRPM8.4 siRNA (svart kolonne). Vekst i fravær av BCTC utgjør 100%.
effekter observert under siRNA gjort det mulig å teste hvorvidt inhibering av proliferasjon indusert av farmakologiske midler er formidlet utelukkende av deres virkninger på TRPM8. For å teste dette, vi vurdert om BCTC var i stand til å redusere veksten av DU145 cellene etter siRNA behandling. Dersom alle effektene av BCTC ble formidlet gjennom TRPM8, bør stoffet har mindre effekt på spredning etter TRPM8 knockdown av siRNA. Imidlertid BCTC (10 pM) hemmet veksten av denne cellelinje med et tilsvarende grad etter TRPM8 knockdown, hvilket indikerer at effekten av BCTC på prostatacancer celleproliferasjon er ikke helt på grunn av TRPM8 hemming (Fig. 6C).
Tidligere rapporter har vist at levedyktigheten av LNCaP-celler reduseres med inhibering av TRPM8 [19]. Vi kunne bekrefte denne observasjonen, men LNCaP var den eneste cellelinje som viste denne atferden. Levedyktighet for PNT1A1 ble også redusert etter siRNA transfeksjon, men denne effekten var ikke avhengig TRPM8, fordi det skjedde i denne cellelinjen også for kontroll sirnas (data ikke vist).
mentol og Icilin effekter i spredning og Livskraftig av prostata celler
Våre resultater bekrefter den oppfatningen at TRPM8 hemming reduserer celle spredning av prostata kreft celler. Derfor bestemte vi oss for å teste om aktivering av TRPM8 med mentol produsert en motsatt effekt, det vil si en økning i spredning. Mentol (120 eller 300 uM) eller icilin (10 pM) ble tilsatt til vekstmediet. Noe paradoksalt nok, har mentol blitt beskrevet å redusere levedyktigheten til LNCaP celler [19]. Den opprinnelige tolkningen av dette fenomen er at aktiveringen av TRPM8 fører til en vedvarende Ca
2+ tilstrømning som induserer apoptose, men mentol kan ha off-target-effekter i disse celler og [22], [45]. Vi observerte ikke en systematisk reduksjon i LNCaP celleviabilitet i nærvær av mentol, selv om det var noen økt dødelighet i noen eksperimenter. Mentol endret ikke levedyktigheten til andre cellelinjer (ikke vist). MTT og flowcytometri eksperimenter i de fire cellelinjer gitt spennende results.We oppdaget ikke noen betydelig økning indusert av mentol eller icilin under normale serumkonsentrasjon (Fig. 7A). Imidlertid, i nærvær av redusert serum, bare DU145-celler viste en moderat, men betydelig økning i proliferasjon indusert av mentol (fig. 7B).
Effekten av mentol (to forskjellige konsentrasjoner) og icilin (10 pM) på den proliferative fraksjon av hver cellelinje ble bestemt. Ingen effekt ble påvist. Data er presentert normalisert til den proliferative fraksjon i fravær av TRPM8 aktivatorer. B. I serum-belastede celler, moderate konsentrasjoner av mentol fremkalte en økning i metabolsk aktivitet av DU145-celler målt ved MTT-analyse. Effekten var svakere ved høyere konsentrasjoner.
Effekt av TRPM8 Block på sårtilheling
Nyere bevis tyder på at TRPM8 aktivitet er en relevant faktor å kontrollere migrasjon av prostatakreftceller [24], [46]. Vi har derfor besluttet å bruke en sårhelende analysen, en klassisk metode videresending på de kombinerte effekten av spredning og migrasjon [47], for å studere handlingene til TRPM8 stopper på forstyrret monolag av LNCaP, PC3, DU145 og PNT1A celler. I nærvær av normalt serum konsentrasjon, alle cellelinjer effektivt redusert sårområdet; de tumorcellelinjer som kreves kortere tider for å lukke såret i forhold til de ikke-tumorlinjer (Fig. 8A venstre, C). Sårheling ble betydelig inhibert av de spesifikke TRPM8 blokkere AMTB og JNJ41876666, i PC3, LNCaP og DU145-celler, men ikke i PNT1A (figur 8A, C). For å minimalisere virkningene av proliferasjon, utførte vi den samme analysen på alle cellelinjene 12 timer; JNJ41876666 redusert sårtilheling i alle tumorcellelinjer, men ikke i PNT1A celler (Fig. 8B).
sårtilheling analysene ble utført på PNT1A, LNCaP, PC3 og DU145 cellene i fravær eller tilstedeværelse av TRPM8 hemmere AMTB og JNJ41876666 (10 mm). A. Representative bilder av eksperimenter utføres i nærvær av normale serumkonsentrasjoner. I fravær av blocker, alle cellelinjer effektivt gjenopprette enkeltlaget etter 24 (LNCaP og DU145) eller 48 timer (PNT1A, på 24 timer, ble det ikke observert noen recovery). Tilstedeværelsen av blokkere svekker helbredelse i LNCaP, PC3 og DU145, men ikke i PNT1A celler. B. Lignende effekter ble observert på alle cellelinjer allerede 12 timer etter scratch. C. Kvantifisering av restaurert overflaten fra tre bilder som de i A, i 24 timer i alle cellelinjer, bortsett PNT1A (48 h) i nærvær av JNJ41876666 (svart) og AMTB (rød). D. Lignende eksperimenter i lave serumkonsentrasjoner avdekket at PNT1A ikke redusere scratch overflaten, mens kreftceller LNCaP og PC3 (i 3% FCS) og DU145 (i 1% FCS) gjorde. Healing ble igjen hemmet av JNJ41876666 (10 mm). E. Menthol induserte en svak akselerasjon av healing bare i DU145 cellene, mens icilin viste ingen effekt på noen av linjene som ble testet.
I lave serumkonsentrasjoner, PNT1A cellene ikke klarte å lukke såret i 48 timer mens alle tre kreftcellelinjer reduseres betraktelig sårflaten innen 24 timer; under slike betingelser, JNJ41876666 vesentlig forsinket sårheling i alle kreftcellelinjer, mens den ikke er i PNT1A (figur 8D); AMTB produsert i hovedsak de samme effektene (data ikke vist).
