Abstract
Apoptose kan utløses på to forskjellige måter, gjennom indre eller ytre vei. Den indre vei er mediert av mitokondriene via frigjøring av cytokrom C mens ytre vei er bedt av død reseptor signaler og forbigår mitokondriene. Disse to baner er nært relatert til celle-proliferasjon og overlevelse signaleringskaskader, som derved utgjør mulige mål for cancerterapi. I tidligere studier innførte vi to planteavledede isomere flavonoider, flavon A og B-flavon som induserer apoptose i høyt tumorigene cancerceller i bryst, tykktarm, bukspyttkjertel, og prostata. Flavone A vises potent cytotoksisk aktivitet mot flere differensierte karsinomer i kolon (CaCo-2) og bukspyttkjertelen (Panc28), mens flavone B cytotoksisk effekt er observert på dårlig differensierte karsinomer i tykktarmen (HCT 116) og bukspyttkjertelen (MIA Paca). Apoptose induseres ved flavon A i bedre differensiert tykktarmskreft CaCo-2 og kreft i bukspyttkjertelen Panc 28 celler via den indre reaksjonsvei ved inhibering av de aktiverte former av ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) og PS6 og påfølgende tap av fosforylering av Bcl -2 forbundet død promoter (BAD) protein, mens apoptose utløses av flavone B i dårlig differensiert tykktarmskreft HCT 116 og MIA Paca kreft i bukspyttkjertelen celler gjennom ytre vei med samtidig oppregulering av de fosforylerte formene for ERK og c-jun ved serin 73. Disse endringene i protein nivåer slutt føre til aktivering av apoptose, uten involvering av AKT
Citation. LeJeune TM, Tsui HY, Parsons LB, Miller GE, Whitted C, Lynch KE, et al. (2015) virkningsmekanisme To flavone isomerer målretting kreft celler med varierende celledifferensiering Status. PLoS ONE 10 (11): e0142928. doi: 10,1371 /journal.pone.0142928
Redaktør: Yu-Jia Chang, Taipei medisin Universitetet, TAIWAN
mottatt: 29 april 2015; Godkjent: 28 oktober 2015; Publisert: 25.11.2015
Copyright: © 2015 LeJeune et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Department of Pharmaceutical Sciences ved East Tennessee State University Gatton College of Pharmacy (https://www.etsu.edu/pharmacy/), stipend 82171 fra East Tennessee State University Research Development Committee Major Grants Program (https://www.etsu.edu/research/rdc/) og Kjemisk institutt ved Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambient (http: //www. udca.edu.co/)
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
forekomsten av kreft har økt jevnt og trutt gjennom hele det siste. tiår [1]. Mens nåværende behandlinger er effektive på forskjellige nivåer, er mange av disse behandlingene er også ikke-spesifikke med hensyn til deres virkningsmekanisme. Dette i sin tur øker de uønskede utfall oppleves av behandlede pasienter; sterke bivirkninger og lave priser av effektivitet er noen av de mange grunnene til at mer spesifikke behandlinger i onkologi har søkt. Blant disse tiltakene, har naturlige produkter [2] blitt studert mye i håp om å identifisere nye molekylære enheter med antineoplastiske egenskaper. Av disse naturlige produkter, flavonoider, en klasse av polyfenoliske forbindelser som finnes i planter, har vist seg å utøve antineoplastiske [3-9] egenskaper, så vel som antioksidant [10, 11], anti-inflammatorisk [12], antimikrobielle [13] og antivirale [14, 15] aktiviteter.
For de siste fem årene vår forskning har fokusert på planter fra Andesfjellene i stor grad kjent som
Vira Viras
. Disse plantene har blitt benyttet av de innfødte mennesker i denne regionen til medisinske formål, for eksempel i behandling av kreft, som rapportert i ulike ethnobotanical studier [16, 17]. De tilhører familien
Asteraceae
, slekter
Gnaphalium
,
Achyrocline
, og
Gamochaeta
. Vårt fokus i forhold til Vira Vira planter har blitt plassert på
Gnaphalium elegans Hotell og
Achyrocline bogotensis
som to aktive forbindelser ble isolert, 5,7-dihydroksy 3,6,8-trimetoksysalicylnitril 2-fenyl-4H-kromen-4-on (5,7-dihydroksy-3,6,8-trimethoxyflavone eller flavon A) [18], og 3,5-dihydroksy-6,7,8-trimetoksy-2- fenyl-4H-kromen-4-on henholdsvis (3,5-dihydroksy-6,7,8-trimethoxyflavone eller flavon B) [19]. Det er foreslått i vårt tidligere arbeid at disse to flavone isomerer kan være relevant for den antineoplastiske aktivitet av disse plantene [20]. Faktisk, flavoner A og B viste cytotoksisk aktivitet mot cellelinjer avledet fra tykktarm, bukspyttkjertel, bryst og prostata cancer som har blitt kategorisert som å være svært tumorgene, med de mest lovende resultatene på kreft i tykktarmen og bukspyttkjertelen. Høye nivåer av ekspresjon av aldehyddehydrogenase (ALDH) blir ansett som en meget spesifikk markør som brukes i deteksjonen av kreftceller initiere som subpopulasjoner i tumorer, og er blitt vist spesielt i cellelinjene undersøkt [21-23]. Blant disse sterkt tumorigene cellelinjer, de to isomerene flavone viser preferensiell antineoplastisk aktivitet på celler med ulik differensiering status. Flavon En indusert apoptose i de godt differensierte cellelinjer, men ikke på de dårlig differensierte cellelinjene, mens flavon B ble vist å være aktive mot dårlig differensiert, men ikke mot de bedre differensierte celler. Dessuten gjør disse to isomerer flavone ikke indusere apoptose i normale celler, og viser signifikant mindre apoptotisk aktivitet i mindre tumorigene cellelinjer [20].
Det er kjent at mitokondrie styring av apoptose kan kontrolleres ved aktiviteten av overlevelse faktorer, slik som vekstfaktorer eller cytokiner, via ekstracellulære reseptorer aktivekaskader protein hendelser som til slutt fører til Caspase-3-spalting. Disse banene ble probet ved å undersøke effekten av de to isomerene flavone på ekstracellulære signalregulerte kinaser (ERK), proteinkinase B (AKT), S6 ribosomalt protein (S6), og Bcl-2-assosiert død promotor (BAD). Fortrinns induksjon av apoptose på høyt tumorigene celler med ulik differensiering status ved flavone A og flavone B, to strukturelt lignende forbindelser, foreslår aktivering av ulike cellulære trasé ved hver forbindelse. Denne studien viser at flavone En utøver sin cytotoksiske effekt på bedre differensierte kreftcellene via en iboende apoptotiske sti mens flavone B forbigår mitokondrie vei å indusere apoptose via en ytre vei i dårlig differensierte kreftceller.
Materialer og metoder
Utvinning, Rensing, og identifikasjon av flavones
De flavones ble oppnådd som beskrevet tidligere [20]. Kort fortalt ble flavone A renset fra 1,5 kg
G
.
elegans
tørkede blomster hentet med CHC
3. Ekstrakten ble konsentrert ved tørr vakuum, oppløst i metanol, og filtrert for å fjerne fett og hydrokarboner. Den ble deretter konsentrert og oppløst i C
6 H
6 fulgt av silikagel-kromatografi ved anvendelse av C
6 H
6: Me
2CO (19: 1) som elueringsmiddel. Fra dette ble 50 mg flavonoider renset fra fraksjoner 12 til 18 ved krystalliseringer i heksan. Forbindelsen ble identifisert ved dets fysiske og spektroskopiske egenskaper som 5,7- dihydroksy-3,6,8 trimethoxyflavone, smp 170 171C, 1H NMR (300 MHz) 3,86 (3H, s), 3,97 (3H, s), 4,20 (3H, s), 7,50 7,6 (3H, m), 8,08 8,16 (2H, m). Flavone B ble renset fra 200 g friske blader av
A
.
bogotensis
. Bladene ble neddykket i CHCI
3 i 20 minutter og deretter filtrert, konsentrert og oppløst i varm metanol. For å eliminere fett og hydrokarboner ble den kalde ekstraktet filtrert og konsentrert på nytt. Det resulterende faste stoffet ble deretter oppløst i varm heksan og etterfølgende omkrystalliseringer i heksan, produserte 100 mg av renset flavonoid. Forbindelsen ble identifisert ved dets fysiske og spektroskopiske egenskaper som 3,5-dihydroksy-6,7,8-trimethoxyflavone, smeltepunkt 149 150 ° C, 1H NMR (300 MHz) 3,86 (3H, s), 3,97 (3H, s), 3,99 ( 3H, s), 4,12 (3H, s), 7,30 7,45 (3H, m), 8,70 8,82 (3H, m), 11,46 (1H, s).
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og dyrkningsbetingelser.
Colon (CaCo-2, HCT116) og bukspyttkjertel (MIA PACA-2) cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og ble dyrket i henhold til ATCC instruksjoner. Den Panc28 cellelinjen var en gave fra Dr. Paul Chiao (University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas), og ble dyrket på samme måte som i bukspyttkjertelen cellelinje MIA Paca-2. Cellene ble dyrket i medium supplert med 10% serum (Gibco, Grand Island, NY) og penicillin /streptomycin (Hyclone, Logan, UT). Alle celler ble sådd ut og tillatt å nå 75% konfluens før behandling med flavon A, B, eller vehikkel (dimetylsulfoksid) ved en sluttkonsentrasjon på maksimalt 0,27% i de behandlede brønnene (Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA).
Apoptose Påvisning av Fluorescensmikroskopi
Apoptose ble påvist ved hjelp av Annexin V-FITC kit fra Abcam (Cambridge, MA) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene sådd ut ved en densitet på 4-5×10
4 /brønn på 12-mm runde dekkglass (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), tillates å nå 75% konfluens, og ble behandlet med enten bærer, flavon A, eller flavon B ved en konsentrasjon på 40 uM. Seks timer etter dosering, ble cellene inkubert i bindingsbuffer og FITC-konjugert Annexin V i fem minutter i mørket. Cellene ble deretter fiksert med 2% p-formaldehyd og bilder ble oppnådd ved anvendelse av en EVOS fluorescens mikroskop (AMG, Bothell, WA).
Cell Cycle og apoptose Analyse ved hjelp av strømningscytometri
Celler dyrket på seks brønners plater, ble behandlet med enten oppløsnings kjøretøy, flavon A, eller flavon B. etter ni timers inkubering ble cellene løftes fra platen med trypsin, og analysert for kvantifisering av apoptose og cellesyklus elingene ved hjelp av en Annexin V- FITC kit fra Abcam (Cambridge, MA) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene suspendert i bindingsbuffer og Annexin V-FITC og propidiumjodid ble tilsatt, fulgt av en 5 minutters inkubering i mørket. Celletall ble oppnådd ved bruk av BD Accuri C6 flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, California) og analysert med CFLOW Plus (BD Biosciences).
Antistoffer og reagenser
Virkningsmekanismen ble vurdert ved hjelp av antistoffer mot ERK2 fra Santa Cruz (Dallas TX), AKT fra Millipore (Billerica, MA), c-juni og BAD fra Cell Signaling (Beverly, MA), fosforylert c-juni (T91 /93) fra Abcam (Cambridge, MA ), fosforylert c-juni (S63 /73), de fosforylerte formene for ERK, S6 ribosomalt protein (91B2), og BAD, fra Cell Signaling, fosforylert AKT S473 fra Millipore, BH3-samspill domene død agonist (Bud) fra R D Systems (Minneapolis, MN), inaktive og aktive former for caspase 3 fra Santa Cruz og R D Systems, caspase 8 og caspase 10 fra MBL (Woburn, MA), og caspase 9 fra Cell Signaling, og α-tubulin og β aktin fra Sigma (St. Louis, MO). Alle sekundære antistoffer ble affinitets-renset med ingen kryss-reaktivitet med andre arter. Konjugert sekundære antistoffer ble oppnådd fra Pierce (Rockford, IL), Promega (Madison, WI), og Jackson ImmunoResarch (West Grove, PA). Alexa Fluor 488 og 594-konjugerte sekundære antistoffer (Molecular Probes, Eugene, OR) ble brukt som spesifisert av produsenten. Tamoxifen som brukes til å oppnå et positivt styresignal for fosforylering analyse av c-Jun var fra Sigma.
PAGE og Immunoblotanalyse
Behandlede celler ble lysert med lyseringsbuffer som besto av 20 mM imidazol, 100 mM KCl, 1 mM MgCl
2, 10 mM EGTA, 0,2% Triton X-100, fosfatase, og proteasehemmere (Sigma Aldrich). Protein konsentrasjon av cellelysatene ble målt spektrofotometrisk (Cary 50; Varian, Palo Alto, CA) med en proteinanalyse fra Cytoskjelett (Denver, CO, USA). Prøvene ble kjørt på SDS-PAGE og deretter blottet på nitrocellulose eller PVDF-ark. Signalet fra den primære monoklonale eller polyklonale antistoffer ble påvist ved anvendelse av sekundær affinitetsrenset geit anti-mus eller anti-kanin immunoglobuliner koblet til peroksydase og et kjemiluminiscerende system (Pierce; Grand Island, NY) og eksponert på røntgenfilm (Kodak; Rochester, NY). Intensiteten av båndene ble beregnet ved å digitalisere bildet (J-bilde) fra røntgenfilm. Etter subtrahering av bakgrunnen, ble alle band intensiteter sammenlignes med kontroll.
Immunofluorescence
Immunofluorescens ble utført som tidligere beskrevet [24]. I korthet ble cellene fiksert med 3% p-formaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur. Etter skylling ble cellene permeabilisert med 0,2% Triton X-100 i 5 min eller 0,1% saponin gjennom hele prosedyren. Permeabilization ble etterfulgt av bråkjøling av aldehydgruppene i 50 mM NH
4Cl. Cellene ble deretter inkubert med primært antistoff fortynnet i 1% BSA i 1 time ved romtemperatur. Etter vaskinger og inkubasjon med sekundært antistoff, ble cellene montert på 10% polyvinylalkohol, 30% glycerol, 1% n-propylgallat, og langsom fading (Molecular Probes, Invitrogen) ved en fortynning på 5: 1. Fluorescens bilder ble oppnådd ved hjelp av en EVOS fluorescens mikroskop (AMG, Bothell, WA).
Resultater
flavone A og flavone B indusere apoptose og cellesyklus skift
Vår forrige data tyder på at flavoner A og B føre til DNA-fragmentering på bedre og dårlig differensierte celler henholdsvis [20]. Annexin V-analyser ble utført for å bekrefte at induksjon av apoptose i tumorgene celler status etter dosering med flavoner. Apoptose ble påvist 6 timer etter bukspyttkjertelkreft Panc-28 (Fig 1 A) og tykktarmskreft Caco-2 (figur 1B) celler ble dosert med 40 pM av flavon A. På samme måte, apoptose ble detektert 6 timer etter kreft i bukspyttkjertelen MIA Paca -2 (figur 1C) og tykktarmskreft HCT116-celler (figur 1D) ble dosert med 40 pM av flavon B. for å kvantifisere de apoptotiske endringer indusert av flavoner, celler dosert med kjøretøyet eller flavon, ble analysert med 6, 9 og 12 timer etter behandling via flowcytometri ved hjelp Annexin V /propidiumjodid. På 9 timer, Panc 28 celler behandlet med flavone A hadde 2,9 ganger økning i apoptose (figur 2A og 2C). På samme måte, ved 9 timer, HCT 116 celler behandlet med flavon B hadde en 2,3 ganger økning i apoptose (Fig 2B og 2C).
apoptotiske virkning av flavon A ved en konsentrasjon på 40 uM, på mer differensiert bukspyttkjertelen Panc28 og tykktarm Caco 2 kreftceller (figur 1A og 1B), som bestemt ved Annexin V-analyse (grønn kanal) seks timer etter behandling. DAPI (blå kanal) blir brukt til å lokalisere kjerner av cellene. Celler behandlet med bærer bare (DMSO til en sluttkonsentrasjon på 0,27%) tjente som en kontroll. Aktivering av apoptose i dårlig differensiert bukspyttkjertelen MIA PACA og tykktarm HCT116 kreftceller (figur 1C og 1D) ved flavon B i en konsentrasjon på 40 uM, som bestemmes av Annexin V-analyse (grønn kanal) seks timer etter behandling. Kontrollbetingelsene er de samme som beskrevet ovenfor, og Dapi ble brukt til å lokalisere kjerner.
A. Apoptose ble oppdaget ved hjelp Annexin V-FITC og propidiumjodid- i Panc 28 celler behandlet med 40 mikrometer flavone A, 9 timer etter behandling. B. Påvisning av apoptose i HCT 116 celler behandlet med 40 mikrometer flavone B, 9 timer etter behandling. C. Søylediagram representasjon av apoptose i Panc 28 og HCT 116-celler behandlet med flavon A og B henholdsvis. D-E. Cellesyklus bestemmelse ved hjelp propidiumjodid- i Panc 28 celler behandlet 40 mikrometer flavone A. F-G. Cellesyklus besluttsomhet i HCT 116 celler behandlet med 40 mikrometer flavone B.
For å teste om behandling med flavone A eller flavone B hadde en effekt på cellesyklus distribusjoner, flowcytometri analyser ved hjelp av propidiumjodid ble utført. Bedre differensierte bukspyttkjertelen celler Panc 28 celler ble behandlet med flavone A (Fig 2D og 2E). Etter 9 timer, er et skifte fra G0 /G1 til S og G2 faser tydelig. Dårlig differensiert tykktarm kreft celler HCT 116 ble behandlet med flavone B. En tilsvarende skifte fra G0 /G1 fase til S og G2 faser er åpen 9 timer etter behandling (Fig 2F og 2G).
flavone A har en hemmende virkning på fosforylert ERK og S6, men har ingen effekt på AKT eller c-Jun i bedre differensiert Panc28 og CaCo-2-cancerceller
for å bestemme den mekanismen som er ansvarlig for den cytotoksiske effekt på bedre differensierte kreftceller observert etter behandling med flavone A, proliferativ, overlevelse, og apoptotiske signalveier ble undersøkt. Tykktarmskreft CaCo-2 og kreft i bukspyttkjertelen Panc28 celler ble dosert med 40 mikrometer av flavone A og nivåer av aktivert AKT, ble ERK, S6, og c-juni analysert. Som vist i figur 3A og 3C, doserings Panc 28 celler med flavon A induserte en gjennomsnittlig reduksjon av den fosforylerte form av ERK til 64,27% (51,84% -74,83%; p = 0,0029) og av PS6 til 52,58% (37,90% -62,50 %; p = 0,012) sammenlignet med kontrollen. I CACO-2-celler, var gjennomsnittlig reduksjon av fosforylert ERK ved flavon A var til 42,58% (25,38% -55,64%; p = 0,0031), og 57,99% (43,84% -77,36%; p = 0,0138) til PS6, sammenlignet lignet med kontrollen. Ingen forandring ble observert i ekspresjonsnivåene for de unphosphosphorylated proteinene analysert (figur 3A). Disse Immunoblotanalyse resultatene ble bekreftet ved immunfluorescens. Fosforylerte ERK resulterer i CaCo-2-celler er vist i figur 3E. Videre er de aktiverte former av AKT på serin 473 og c-jun ved serin 73, ble også studert som disse proteinene regulere både celleoverlevelse og stress-indusert apoptose respektivt. Ingen av disse viste betydelige endringer i Panc-28 og Caco-2-cellelinjer (figur 3A og 3C)
A og B:. Påvisning av de aktiverte og ufosforylerte former av ERK, c-Jun, S6, AKT av immunoblot av totale SDS ekstrakter. Bedre differensierte Panc28 og Caco 2-celler ble behandlet med 40μM av flavon A (+ A), og dårlig differensiert MIA PACA og HCT116-celler med flavon B (+ B), eller i DMSO (-) oppløsningen kjøretøyet. Etter lysering og SDS-PAGE, ble membraner probet med det angitte antistoff. Membranene ble reprobed for aktin som en lastekontroll, og et representativt bilde tilveiebringes. Resultatene som er vist er representative for tre uavhengige eksperimenter. C og D: For kvantifisering (grafer) bandet tettheter fra behandlede /ubehandlede forhold identifisert med (+) eller (-), ble normalisert og beregnet i prosent av verdien for de ubehandlede celler (100%), og vist gjennomsnitt ± standardavvik fra tre uavhengige eksperimenter (* p 0,05). E og F:. Påvisning av fosforylert ERK etter behandling av CaCo 2 celler med flavone A og HCT116-celler med flavone B ved immunfluorescens
Økt uttrykk av fosfor-c-Jun (S73) og ERK var observert etter behandling av dårlig differensierte MIA Paca og HCT116 kreftceller med flavone B
En gjennomsnittlig økning til 190,19% aktivert ERK i bukspyttkjertelen kreft MIA Paca celler (175,32% -204,08%; p = 0,0036; n = 3 ), og 160,23% i kolon kreft HCT116-celler (144,99% -174,22%; p = 0,012, n = 3) ble observert etter behandling med flavon B (figur 3B og 3D) sammenlignet med kontroller. Ingen forandring ble observert i ekspresjonsnivåene for de unphosphosphorylated proteinene analysert (figur 3B). Disse Immunoblotanalyse resultatene ble bekreftet ved fluorescens mikroskopi og de fosforylerte ERK resultatene er vist for HCT-116-celler (figur 3F). Også observert økte nivåer av fosforylert form av c-Jun (S73) i MIA Paca på 170,83% fra kontrollnivåer (162,27% -181,90%; p = 0,0008; n = 3), og i HCT116 på 271,34% (222,95 % -312,93%; p = 0,0028; n = 3), som vist i figur 3B og 3D
flavon B har ulike effekter på PS6 i MIA PACA og HCT116-celler, men har ingen effekt på fosforylert AKT
Etter behandling av MIA PACA-celler med flavon B, de gjennomsnittlige nivåer av PS6 blir redusert til 51,68% (19,95% -77,77%; p = 0,0237; n = 3) i forhold til kontroll som vist i fig 3D. Motsatt, etter behandling av HCT116-celler, en økning på 149,88% (136,54 til 170,22; p = 0,0116; n = 3) observeres, sammenlignet med kontrollene. Uttrykket nivåer av fosfoserin 473 AKT, var uforandret etter behandlingen av MIA PACA og HCT116-celler med flavon B som vist på figur 3B og 3D.
flavon A modulerer BAD fosforylering ved serin 112, men ikke flavon B
for ytterligere å undersøke forskjellene i mobilnettet effekten av flavone A og flavone B ble fosforylering status for dårlig på serin 112 studert. Cellelinjer Panc-28 og Caco-2 dosert med flavone En utstilling en nedgang i fosforylert BAD på serin 112 (fig 4A). Denne reduksjonen hadde et gjennomsnitt på 35,91% (34,21% -37,61%; p = 0,006, n = 3) i Panc-28, og 57,03% (42,12% -71,62%; p = 0,0068; n = 3) i CaCo-2- celler (figur 4C). Disse observasjonene ble bekreftet via immunofluorescens for Panc-28 som vist i fig 4E. Omvendt, doserings MIA PACA-2 og HCT116 tumorigene celler med 40 pM av flavon B produserte ingen signifikant endring i den totale mengden av fosforylert BAD ved serin 112, som vist ved Western blot (Fig 4B og 4D) og immunofluorescens for MIA Paca-2 ( fig 4F). Selv om det ikke er noen signifikant forandring observert i ekspresjonsnivåene av ufosforylerte BAD i bedre differensierte celler (figur 4A), er en svak økning observert i dårlig differensierte celler (figur 4B)
A og B:. Påvisning av tap av fosforylering av BAD av immunoblot av totale SDS ekstrakter. Bedre differensierte Panc 28 og CaCo 2-celler ble behandlet med 40μM av flavon A (+ A), og dårlig differensiert MIA PACA og HCT116-celler med flavon B (+ B), eller i DMSO (-) oppløsningen kjøretøyet. Etter lyse og SDS-PAGE, ble membraner analysert med et antistoff spesifikt for BAD fosforylert på serin 112 eller ufosforylerte protein. Membranene ble reprobed for aktin som en lasting kontroll. Resultatene som er vist er representative for tre uavhengige eksperimenter. C og D: For kvantifisering (grafer) bandet tettheter fra behandlede /ubehandlede forhold identifisert med (+) eller (-), ble normalisert og beregnet i prosent av verdien for de ubehandlede celler (100%), og vist gjennomsnitt ± standardavvik fra tre uavhengige eksperimenter (* p 0,05). E og F: Påvisning av fosforylert BAD på serin 112 (rød kanal), etter behandling av Panc 28 celler med flavone A og MIA Paca celler med flavone B ved immunfluorescens. Dapi (blå kanal) ble brukt til å lokalisere kjerner.
flavone En kan indusere apoptose via caspase 9
For å avgjøre om caspase 9 deltar i den apoptotiske kaskade initiert av flavone A, Caco-2 og Panc28 celler ble dosert og analysert ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av immunblot for tilstedeværelsen av spaltede fragmenter av 37 og 17 kDa med et antistoff som er i stand til å detektere den aktiverte caspase. Fig 5A viser en representativ immunoblot av CaCo-2, og figur 5B for Panc28 celler av lysatene som er tatt ved forskjellige tidspunkter etter dosering med flavon A. Begge cellelinjer vil vise store fragmenter, 37 og 35 kDa, detektert av antistoffet (fig 5A og 5B). Det 37 kDa-fragmentet er tydelig i kontrollen (celler dosert med vehikkel) antyder deregulering av proteinet i disse cellelinjene. Men en progressiv reduksjon i nivået av uttrykk for procaspase 9 (47kDa) er tydelig starter 3 timer etter dosering.
Påvisning av aktivert caspase 9 av immunoblot av SDS ekstrakter av A. CaCo 2 og B. Panc 28 cellene 1,5, 3, 6, 9 og 12 timer (banene 2-6) etter behandling med flavon A eller vehikkel (DMSO) for kontrollen (C, kolonne 1) og SDS-PAGE. Membranene ble analysert med et antistoff som er i stand til å detektere både procaspase (47 kDa), og de resulterende store fragmenter etter aktivering (37 og 35 kDa). Membranene ble reprobed for aktin eller tubulin som en lasting kontroll. Resultatene som er vist er representative for tre uavhengige eksperimenter. Membranene ble reprobed for aktin eller tubulin som en lasting kontroll. Resultatene som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter.
flavone B verken phosphorylate c-juni på treoniner 91 og 93 eller aktivere caspases 8 og 10 i HCT 116 eller MIA Paca celler
for å bekrefte flavon B aktivering av apoptotiske program via den ekstrinsiske reaksjonsveien uten involvering av den indre vei, studerte vi fosforylering former av c-Jun er relevante for inngrep av mitokondriene til ved spalting av kaspase 8 [25, 26]. HCT 116 og MIA PACA-celler dosert med flavon B ikke viser aktivering av c-Jun på treoniner 91 og 93 som vist på figur 6A via immunfluorescens i HCT 116 celler. Brystkreftceller SKBR3 dosert med tamoxifen, en positiv kontroll for denne aktiveringen [27], ble behandlet på samme måte som beskrevet ovenfor (figur 6B). Dette resultatet ble bekreftet ved immunblot som vist i fig 6C. Undersøkelse av aktiveringsstatusen til caspaser 8 og 10 i disse celler etter behandling med flavon B viste ingen spaltning av dette proteinet i enten HCT 116 eller på MIA PACA-celler. Dette er tydelig ved nærværet av de uspaltede kaspasene ved forskjellige tidspunkter som strekker seg fra 1.5-12 timer. Representative immunoblot av tidsforløpseksperimenter for caspaser 8 og 10 i HCT 116-celler er vist i figur 6D og 6E hhv.
A og B. Immunfluorescens av behandlede celler viser ekspresjon av fosfo-c-Jun (T91 /T93 ) i SKBR3-celler (grønn kanal), men ikke på HCT116-celler. DAPI (blå kanal) ble anvendt for å lokalisere kjernene. C. Immunoblot av fosfo-c-Jun (T91 /T93) ved hjelp av SDS-ekstrakter av dårlig differensierte HCT116-celler behandlet med 40μM av flavon B (+ B), eller oppløsnings kjøretøy DMSO (-). SDS lysater fra SKBR3 celler behandlet med 10 uM tamoxifen (+) ble anvendt som en positiv kontroll. Etter SDS-PAGE, ble nitrocellulosemembranene probet med et antistoff spesifikt for dette fosforylert form. D. Påvisning av kaspase 8 ved immunoblot av SDS-lysater av HCT116-celler 1,5, 3, 6, 9 og 12 timer (banene 2-6) etter behandling med flavon B eller bærer (DMSO) for kontrollen (C, felt 1) og SDS-PAGE. Membranene ble analysert med et antistoff som er i stand til å detektere både procaspase (54/55 kDa) og fragmentene resulterende etter aktivering (43 og 18 kDa). Membranene ble reprobed for aktin eller tubulin som en lasting kontroll. Resultatene som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
Vi hadde tidligere vist differensial antineoplastiske effekter av flavones A og B på kreftceller i bryst (MCF7, SKBR3) , kolon (CaCo-2, HCT116), bukspyttkjertel (Panc 28, MIA Paca), og prostata (LNCaP, PC3) med ulik differensiering status. De flavones ble hentet fra
G
.
elegans Hotell og
A
.
bogotensis
, planter med som medisinske egenskaper som dermed brukes indistinctively ifølge ethnobotanical studier. Men flavones er ikke eksklusivt for disse artene. Flavone A har blitt funnet i
Ainsliaea henryi product: [28] og i
Helichrysum decumbens [29]
mens flavone B har blitt isolert fra
Helichrysum graveolens product: [30], som vel som
helichrysum odoratissimum product: [31], og
helichrysum compactum product: [32]. Flavones A og B viser en signifikant cytotoksisk effekt mot høyt tumorigene cellelinjer, skåner normale epitelceller. Spesielt flavone A demonstrerte høy cytotoksisitet mot mer differensierte Panc28 og CaCo-2-celler, mens flavone B viste en preferanse for dårlig differensiert MIA Paca, HCT 116, og SKBR3 celler [20]. Celle doblingstiden, og tilstedeværelsen av spesifikke differensiering og polaritet markører blir brukt til å bestemme cellulær differensiering status. Blant de celler som vi har testet, har Panc28 tidligere blitt beskrevet som dårlig differensiert hovedsakelig på grunn av fravær av polaritet markører som er tilstede i pankreatiske andre cellelinjer så som CAPAN-en, til tross for det faktum at den har en forholdsvis lang celle doblingstiden. Det er imidlertid generell enighet om at Panc 28 celler har en høyere differensiering status enn MIA PACA-celler [33], og våre resultater tyder på at flavoner kan være følsomme for denne forskjellen. For bedre å forstå mekanismen ved hjelp av hvilken apoptotiske programmet er initiert av flavoner A og B i sine målceller, vurderte vi effekten av hver flavon på tast ytre og indre apoptotiske pathway proteiner, slik som ERK, PS6, AKT, BAD, og c -JUN i sine aktiverte former.
Våre resultater tyder på at flavone En kan indusere apoptose i bedre differensierte bukspyttkjertel og tykktarm kreft celler, via mitokondrie indre vei. Dette er tydelig ved reduksjon i fosforylert ERK og S6 og påfølgende tap av aktivert BAD. Fosforylering holder BAD i cytoplasma, og dens tap resultater i binding og inaktivering av overlevelsesproteiner BCL-XL eller BCL-2 etter å ha krysset mitokondriemembranen [34] og dermed aktivere apoptose. En betydelig reduksjon av fosforylert BAD på serin 112 er observert i bukspyttkjertelkreft Panc 28 og tykktarmskreft Caco-2 celler etter behandling med flavone A. aktivering av BAD på serin 112 er mediert av MAPK vei, spesielt via aktivering av Ras- Raf-ERK [35]. Således er inhibering av fosforylert ERK og S6 observert etter behandling med flavon A, kan være oppstrøms for tap av aktivt BAD ved serin 112 og den etterfølgende initiering av apoptose via avbrudd av mitokondriemembranintegritet og frigjøring av cytokrom c og andre apoptotiske faktorer. Disse hendelsene kan føre til aktivering av kaspase 9 og effektor-caspaser. Imidlertid er caspases svært deregulert i kreft gjennom ulike mutasjoner eller tap av uttrykk [36]. I tilfelle av caspase 9, disse er uvanlig, og det er opphevelse av innlegget mitokondrielle funksjonelle aktiviteter som favoriserer tumorprogresjon [37]. Dette kan være tilfelle i våre caspase 9 resultater, hvor aktivert caspase er til stede i kontroll og behandlede celler, noe som kan tyde på tap av apoptotisk funksjon. Det er viktig å merke seg at svekket mitokondrie integritet kan utløse en standard caspase 9-uavhengig program av celledød [38]. Enten apoptose skjer uavhengig av kaspase 9 aktivitet eller ved dannelsen av et gunstig forhold av aktiv vs inaktiv kaspase, som vist i våre resultater presenterer vi bevis for at understøtte aktiveringen av en indre vei. I tillegg våre resultater viser også at verken AKT eller c-juni er involvert i den foreslåtte virkningsmekanismen for flavone A.
Omvendt flavone B induserer apoptose i dårlig differensierte kreftceller i bukspyttkjertelen og kolon via en ytre vei.
