Abstract
Til tross bemerkelsesverdige fremskritt i behandling og forebygging av prostatakreft er det fortsatt den andre årsaken til død av kreft i industrialiserte land. Mange behandlinger i utgangspunktet vist seg å være fordelaktig for pasienter ble forlatt på grunn av den høye medikamentresistens og utviklingen hastigheten av tumorer. En av de potensielle terapeutiske midler også anvendes i det første trinn kliniske studier, 1,25-dihydroksyvitamin D3, ble vist å være enten uforutsigbar eller lite effektive i mange tilfeller. Vi har allerede vist at TRPV6 kalsiumkanal, som er det direkte mål for 1,25-dihydroksyvitamin D3-reseptoren, styrer positivt prostatakreft proliferasjon og apoptose motstand (
Lehen’kyi et al.
, Oncogene, 2007). Men hvordan kjente 1,25-dihydroksyvitamin D3 antiproliferative effekter kan være forenlig med oppregulering av pro-onkogen TRPV6 kanal er fortsatt et mysterium. Her viser vi at i lav steroid tilstander 1,25-dihydroksyvitamin D3 oppregulerer ekspresjonen av TRPV6, enchances spredning ved å øke antall celler går inn i S-fasen. Vi viser at disse pro-proliferative effekter av 1,25-dihydroksyvitamin D3 er direkte medieres via overekspresjon av TRPV6 kanal som øker kalsiumopptak i LNCaP-celler. Den apoptose motstand av androgen-avhengige LNCaP-celler som er tillagt av TRPV6 kanal er drastisk når invers 1,25-dihydroksyvitamin D3 effekter ble kombinert med den vellykkede TRPV6 knockdown. I tillegg til bruken av androgen-manglende DU-145 og androgen-insensitive LNCaP c4-2 cellelinjer tillates tyder på at evnen av 1,25-dihydroksyvitamin D3 for å indusere ekspresjon av TRPV6 kanal er en avgjørende faktor for suksess eller svikt i 1,25-dihydroksyvitamin D3-baserte terapier
Citation. Lehen’kyi V, Raphaël M, Oulidi A, Flourakis M, Khalimonchyk S, Kondratskyi A, et al. (2011) TRPV6 Bestemmer effekten av vitamin D3 på prostatakreft cellevekst. PLoS ONE 6 (2): e16856. doi: 10,1371 /journal.pone.0016856
Redaktør: Janine Santos, medisinske og odontologiske av New Jersey, USA
mottatt: 15 september 2010; Godkjent: 16 januar 2011; Publisert: 11 februar 2011
Copyright: © 2011 Lehen’kyi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE (INSERM), Ministère de l’Education Nationale et Ligue Nationale Contre le Cancer. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er fortsatt den vanligste noncutaneous menneskelig malignitet og den nest mest dødelige tumor blant menn med høyest forekomst i industrialiserte land [1]. Androgen-reseptoren og andre steroider regulere viktige aspekter ved prostata cellevekst og funksjon som proliferasjon, differensiering, apoptose, lipidmetabolisme, og sekretoriske virkning [2]. Androgen undertrykkelse har vært den ledende behandling og for tiden den mest suksessfulle [3]. Men prostata karsinom slutt bli androgen-irresponsive, og kreften er upåvirkelig for hormonbehandling -. Den viktigste årsaken til prostatakreft dødelighet [4]
Ulike kjernereseptorer har vært målrettet for terapi og blant dem en, 25-dihydroksyvitamin D3 som utøver en mengde av anti-tumoraktiviteter mot dyrkede prostatakreftceller og transplantater [5]. Normale og maligne prostata epitelceller uttrykker vitamin D3-reseptor (VDR), og aktivering av VDR av 1,25-dihydroksyvitamin D3 vanligvis resulterer i hemming av proliferasjon og cellesyklus-stans [6]. Men for å forebygge eller behandle prostatakreft, interaksjoner av andre kjernereseptorer og signalveien må vurderes [7].
Funksjonen til ionekanaler har vært diskutert i forhold til spredning og apoptose. Mer nylig butikken drives Ca
2 + kanaler og Ca
2+ basseng i endoplasmatisk retikulum har også vært knyttet til utvikling av prostatakreft [8]. Spredning av prostatakreftcellelinjer LNCaP og PC3 ble hemmet av TH-1177, et stoff som blokkerer Ca
2 + oppføring [9]. Endringer i Ca
2+ basseng og cytosoliske Ca
2+ ikke bare har blitt beskrevet for å øke spredning og sarcoendoplasmatic Ca
2 + -ATPase (SERCA) ekspresjon i LNCaP-celler [10], men også til å indusere apoptose [11]. Dermed Ca
2 + homeostase er kritisk involvert i kreftutvikling og progresjon.
Vår oppmerksomhet er blitt trukket av den observasjon at en forbigående reseptor potensial svært Ca
2 + selektiv kanal underfamilie V medlem 6, er TRPV6 sterkt uttrykt i avansert prostatakreft og betydelig korrelerer med Gleason 7 gradering som representerer en sterk markør inn i friskt vev [12], [13] for tumorprogresjon og påfølgende invasjonen. Vi har tidligere vist at TRPV6 former høyt kalsium selektive kanaler i prostataceller, hvis strøm amplitude og inaktive oppførsel er tett regulert av den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen [10], [14]. Dessuten har vi allerede vist at TRPV6 kanal er involvert i kontrollen av prostatakreft proliferasjon og apoptose motstand [15]. Men den nøyaktige rollen TRPV6 i prostata patofysiologi forblir illusorisk, og regulering av androgen – contradictive [16]. Videre VDR være en direkte aktivator av
trpv6
promoter [17], og 1,25-dihydroksyvitamin D3 et mye brukt anticancer behandling har gjennomført en spennende hypotese for TRPV6 regulering og betydning i prostatakreft. Våre studier var basert på det faktum at 1,25-dihydroksyvitamin D3, som allerede anvendes i det første trinn av kliniske forsøk ble vist å være enten uforutsigbar eller lite effektive i mange tilfeller, og det faktum at TRPV6 som positivt styrer prostatakreft proliferasjon og apoptose motstand [15] er et direkte mål av 1,25-dihydroksyvitamin D3 [17]. Spørsmålet hvordan kjente 1,25-dihydroksyvitamin D3 antiproliferative effekter kan være forenlig med oppregulering av pro-onkogen TRPV6 kanalen var målet for vår studie.
Materialer og metoder
Cell kultur
Humant LNCaP (lymfeknute kreft i prostata), LNCaP c4-2, og DU-145-cellelinjer ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i RPMI-medium (Gibco-BRL, CergyPontoise, Frankrike ) supplert med 10 eller 2% føtalt kalveserum (FCS) og inneholdende kanamycin (100 ug /ml) og L-glutamin (2 mM). Celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2 i luft. Mediet ble skiftet tre ganger i uken, og kulturene ble splittet ved å behandle cellene med 0,25% trypsin (i PBS) i 5 minutter ved 37 ° C før de nådde konfluens. For eksperimentene ble cellene sådd ut i 6-brønns plater for PCR og western-blotting og inn på dekkglass for immunocytokjemi og kalsium avbildning. For det 1,25-dihydroksyvitamin D3-studier-celler ble behandlet med EtOH som en kontroll for 1,25-dihydroksyvitamin D3. Trekull-stripet føtalt kalveserum (2%) ble tilsatt til fenol rød fri RPMI-medium sammen med kanamycin og L-Glutamin som ovenfor for å inkubere cellene til å lage steroid-belastede tilstander.
RT-PCR
Total RNA ble isolert ved anvendelse av guanidium-tiocyanat-fenol-kloroform-ekstraksjon prosedyre. Etter DNase I (Life Technologies) behandling for å eliminere genomisk DNA, ble 2 ug av total-RNA reverstranskribert inn i cDNA ved 42 ° C ved anvendelse av tilfeldige heksamerprimere (Perkin Eimer) og MuLV revers transkriptase (Perkin Eimer) i et 40 ul sluttvolum, etterfulgt av sanntids kvantitativ PCR.
kvantitativ real-time PCR
kvantitativ real-time PCR av TRPV6 og HPRT mRNA transkripter ble gjort ved hjelp av MESA GREEN qPCR MasterMix Plus for SYBR analyse (Eurogentec, Frankrike ) på Biorad CFX96 real-Time PCR Detection System. Sekvensene til primerne er angitt i tabell 1. Den HPRT-genet ble anvendt som en endogen kontroll for å normalisere variasjoner i RNA-ekstraksjoner, graden av RNA-degradering, og variasjon i RT effektivitet. For å kvantifisere resultatene vi brukte den komparative terskelen syklus metode ΔΔC (t)
Western-blotting
Semiconfluent LNCaP celler ble behandlet med en iskald lysebuffer som inneholder:. 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl, 1 mM PMSF, 1% Nonidet P-40, og protease-inhibitor cocktail fra Sigma. Lysatene ble sentrifugert 15000 x g ved 4 ° C i 20 minutter, blandet med en prøvebuffer inneholdende: 125 mM Tris-HCl pH 6,8, 4% SDS, 5% β-merkaptoetanol, 20% glycerol, 0,01% bromfenol-blått, og kokt i 5 minutter ved 95 ° C. Total proteinprøver ble utsatt for 8, 10, og 15% SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran ved semi-tørr Western-blotting (Bio-Rad Laboratories). Membranen ble blokkert i 5% melk som inneholder TNT-buffer (Tris-HCl, pH 7,5, 140 mM NaCl og 0,05% Tween 20) over natten og deretter probet ved bruk av spesifikke kanin polyklonalt anti TRPV6 antistoff (Alomone Labs Ltd., 1/200) , anti-PCNA (i Santa-Cruz, 1/1000), anti-β-aktin (Lab Vision Co, 1/1000) antistoffer. Båndene på membranen ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence metode (Pierce Bioteknologi Inc.). Densitometrisk analyse ble utført ved anvendelse av en Bio-Rad bilde-innhentingssystem (Bio-Rad Laboratories).
Immunocytochemistry
Cellene dyrket på dekkglass ble vasket en gang med PBS og, hvis det passer, inkubert med koleratoksin, subenhet B Alexa Fluor® 488 konjugat (Molecular Probes, 1/2000) i 15 min, deretter vasket en gang med PBS og fiksert i 3,5% paraformaldehyd i PBS. PBS-glycin (30 mM) ble anvendt for å stanse reaksjonen med den etterfølgende permeabiliseringen med 0,1% Triton X-100. Cellene ble vasket på nytt i PBS og underkastet konvensjonell immunofarging prosedyre. Alexa Fluor® 546 geit-anti-kanin-IgG (Molecular Probes, 1/4000) ble anvendt som et sekundært antistoff for TRPV6 farging. Fluorescens analyse ble utført med Carl Zeiss Laser Scanning Systems LSM 510 koblet til en Zeiss Axiovert 200 M med 63 × 1,4 numerisk apertur olje nedsenking objektivet ved romtemperatur. Begge kanalene var spent, samles separat og deretter slått sammen ved hjelp av programvare Carl Zeiss LSM Bilde Examiner.
Celleproliferering
Celleproliferering ble målt ved hjelp av CellTiter 96 vandige løsning celleproliferasjonsanalyse (Promega, Madison , WI), på basis av den cellulære omdannelse av den kolorimetriske reagens MTS [3,4- (5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium salt] inn løselig formazan av dehydrogenase enzymer finnes bare i metabolsk aktive, prolifererende celler. Etter hver behandling, ble 20 ul av fargestoff oppløsning tilsatt til hver brønn i 96-brønners platen og inkubert i 2 timer. Deretter absorbans ble registrert ved 490 nm bølgelengde ved hjelp av en ELISA-plateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Cellular spredning hemming rente er beregnet som: (
A
control-
A
sample)/(
A
control-
A
blank)×100%.
Cell syklus og apoptose analyser
flowcytometri analysene ble utført på cellepopulasjoner dyrket i tre eksemplarer 25-cm
2 kolber som opprinnelig beskrevet [18]. Omtrent 10
6-celler ble fiksert med 1 ml iskald 70% metanol i 30 min. Etter fiksering ble cellene pelletert ved sentrifugering for å fjerne bindemiddel, vasket tre ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) ved 4 ° C, resuspendert i 100 ul PBS, ble behandlet med 100 ul RNase A (1 mg /ml, Sigma), og farget med propidiumjodid (PI, Sigma) til en sluttkonsentrasjon på 50 ug /ml. De fargede celler ble lagret ved 4 ° C i mørke og analyseres i løpet av 2 timer. De fargede prøvene ble målt på et FACScan strømningscytometer (Becton Dickinson, San Jose, California). Data ble kjøpt for 7000 arrangementer med en variasjonskoeffisient på mindre enn 5%, og rød fluorescens ble målt ved hjelp av en fluorescens detektor 3 (FL3) på
X
-aksen. Data ble lagret og analysert ved hjelp av Cellquest-programvare for å vurdere cellesyklus-fordelingsmønster (subG1 (apoptotiske), G0 /G1, S og G2 /M-faser).
Kalsium Avbildnings
Celler ble utsådd på dekkglass og ble fylt med 4 uM Fura-2 AM ved romtemperatur i 45 min i vekstmediet. Registreringer ble utført i HBSS inneholdende (i mM): 140 NaCl, 5 KCI, 2 MgCl
2, 0,3 Na
2HPO
3, 0,4 KH
2PO
4, 4 NaHCO
3, 5 glukose og 10 HEPES justert til pH 7,4 med NaOH. CaCl
2 ble justert til 0,07 mm eller 1,8 mm, avhengig av forsøket. Objektglassene ble deretter plassert i en perfusjon kammer på scenen av mikroskopet. Fluorescens bilder av cellene ble registrert med et videobilde analysesystem (Quanticell). Den Fura-2 fluorescens, ved emisjonsbølgelengde på 510 nm, ble målt ved å eksitere sonden alternativt ved 340 og 380 nm. Signalet Andelen ved 340/380 nm ble omdannet til [Ca
2 +]
i nivå ved hjelp av en
in vitro
kalibrering.
siRNA celle transfeksjon
LNCaP-celler ble transfektert over natten med 200 nM av siRNA-TRPV6 1 og 2 per brønn av en seks-brønns plate ved anvendelse av «Gene porter 2» (Gene Therapy Systems, Inc.) i et sluttvolum på 1 ml. Klar til bruk siRNA-TRPV6s (prosessering alternativ: A4) ble syntetisert ved Dharmacon Forskning Inc (Lafayette, USA) (se tabell 1)
Reagenser
Alle reagenser ble kjøpt fra Sigma. (Sigma, L’Isle d’Abeau Chesnes, Frankrike) med mindre annet er spesifisert.
statistikker
data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Students uparede
t
-UNDERSØKELSER. * – P 0,05 eller ** – P 0,01 indikerer statistisk signifikans
Resultater
Effekten av 1,25-dihydroksyvitamin D3 på prostatakreft cellevekst har blitt studert i to eksperimentelle forhold. : 2% og 10% føtalt kalveserum (FCS) -supplemented RPMI-medium. Veksten av androgen-avhengige LNCaP-cellelinjen ble overraskende økt med 100 nM 1,25-dihydroksyvitamin D3 i 2% FCS-supplert medium og undertrykket i 10% FCS (Fig. 1A). Vi har allerede demonstrert rolle TRPV6 kanal i spredning av prostata kreft celler [15], og derfor har vi søkt å undersøke regulering av TRPV6 kanal uttrykk ved 1,25-dihydroksyvitamin D3. Siden det er blitt vist at
trpv6
er en VDR-regulert gen [17] har vi studert regulering av TRPV6 ekspresjon av 1,25-dihydroksyvitamin D3 i LNCaP-celler i forskjellige steroid innhold av mediet (Fig . 1B, C). 1,25-dihydroksyvitamin D3 ser ut til å direkte aktivere
trpv6
genet i LNCaP celler, men i 10% FCS medium dens effekter var ikke så betydelig (Fig. 1B) enn i 2% FCS (Fig. 1C) . 1,25-dihydroksyvitamin D3 signifikant doseavhengig øket TRPV6 mRNA-ekspresjon i 2% FCS-holdig RPMI medium (Fig. 1C). For å kontrollere om den reduserte effekter av 1,25-dihydroksyvitamin D3 skyldtes FCS innhold og ikke til den optimale effekten tid vi utførte tidskurven ved hjelp av maksimal konsentrasjon på 100 nM i løpet av tre dager ved forskjellige tidsintervaller (Fig. 1D). For å bekrefte signifikant induksjon av TRPV6 protein ved 1,25-dihydroksyvitamin D3 i 2% FCS inneholder RPMI medium innhentet av sanntids kvantitativ PCR en western-blotting ble utført. Den viste en betydelig økning i TRPV6 proteinnivå ved aktivering med 100 nM 1,25-dihydroksyvitamin D3 (fig. 1E). Immunocytokjemi ved hjelp TRPV6 spesifikt antistoff viste ekspresjon av TRPV6 kanaler i LNCaP-celler (fig. 1F) så vel som dens lokalisering på plasmamembranen ved hjelp av koleratoksin (CTX) konjugert med FITC merking spesielt G2M lipider i membranen. Derfor ble virkningene av 1,25-dihydroksyvitamin D3 på veksten av androgen-avhengige LNCaP-celler er avhengig av den relative steroid innhold. Dessuten 1,25-dihydroksyvitamin D3 øker betydelig uttrykk for TRPV6 kanal i lav-steroid forhold.
A, 1,25-dihydroksyvitamin D3 effekter på formeringshastigheten målt ved MTS analysen av LNCaP celler inkubert enten med to % eller 10% FCS-holdig RPMI medium, * – P 0,05, ** – P 0,01, sammenlignet med deres respektive kontroller (DMSO), n = 3. B, for oppregulering av TRPV6 mRNA ekspresjon ved 1,25- dihydroksyvitamin D3 i LNCaP-celler dyrket i 10% FCS-holdig RPMI medium; * – P 0,05, sammenlignet med kontroll (DMSO), n = 3 C, for oppregulering av TRPV6 mRNA ekspresjon av 1,25-dihydroksyvitamin D3 i LNCaP-celler dyrket i 2% FCS-holdig RPMI medium; * – P 0,05, ** – P 0,01, sammenlignet med kontroll (DMSO) n = 3 D, Den tidsavhengighet av TRPV6 til uttrykk under 100 uM 1,25-dihydroksyvitamin D3 behandling i LNCaP-celler inkubert i 10 % FCS-holdig RPMI medium. * – P 0,05, ** – P 0,01, sammenlignet med kontroll (DMSO) n = 3. E, en western-blotting av TRPV6 proteinnivåer fremkalt av 1,25-dihydroksyvitamin D3 behandling i 3 dager i LNCaP-celler inkubert i 2% FCS-holdig RPMI medium. F, A konfokal mikroskopi som viser et mønster av TRPV6 proteinekspresjon og lokalisering på plasmamembranen av LNCaP-celler dyrket i 2% FCS-holdig RPMI medium. Koleratoksin konjugert til FITC (CTX, grønn) brukes til å farge plasmamembranen samt TRPV6 kanal (TRPV6, rød), og deres respektive merge (CTX + TRPV6) er vist.
TRPV6 er involvert in1,25-dihydroxyvitamin D3-indusert spredning av LNCaP celler
Ifølge data innhentet over virkningene av 1,25-dihydroksyvitamin D3 i 2% FCS ble videre undersøkt. Siden vi har allerede demonstrert rolle TRPV6 kanal i proliferasjon av prostata kreftceller [15], og vel vitende om at det ikke er noen kjemisk forbindelse som er tilgjengelig så langt for selektivt å blokkere TRPV6, brukte vi siRNA tilnærming til selektivt knockdown TRPV6. Tre ulike metodiske tilnærminger ble benyttet for å vurdere spredning av LNCaP celler i 2% FCS-holdig medium (Fig. 2A-C). Antall levedyktige prolifererende celler ble målt ved hjelp av MTS-analyse. siRNA-TRPV6 betydelig redusert antall prolifererende celler fra dag 2 til 4 etter transfeksjon (D0) (Fig. 2A). 100 nM 1,25-dihydroksyvitamin D3 var i stand til å øke proliferasjonen av LNCaP-celler, mens TRPV6 knockdown invers denne stimuleringen til nivået enda lavere enn i kontrollen. siRNA mot androgenreseptoren (AR), kjent for å være avgjørende for prostata vekst og utvikling, ble anvendt som en positiv kontroll for å oppnå sterke og pålitelige virkninger på prostata cellelevedyktighet.
a, LNCaP-celler spredning i 2% FCS -holdig RPMI-medium ble behandlet med 1,25-dihydroksyvitamin D3 (100 nM, anvendt ved D1), siRNA-TRPV6 (siTRPV6, 80 nM, transfektert ved D0), den kombinerte behandling av 1,25-dihydroksyvitamin D3 og siTRPV6 angitt ovenfor, og siRNA-AR (Siar, 80 nM, transfektert ved D0) som en positiv kontroll. * – P 0,05, ** – P 0,01, sammenlignet med kontroll, n = 4; B, en cellesyklusanalyse av LNCaP-celler (inkubert med 2% FCS-holdig RPMI-medium) for de samme betingelser som i MTS-analyse (A) (D3 lik 100 nM 1,25-dihydroksyvitamin D3), utføres ved flowcytometri av cellene farget med propidiumjodid. * – P 0,05, ** – P 0,01, § – P 0,05 vs. Vitamin D3; n = 3 C, en western-blotting av prolifererende cell nuclear antigen (PCNA) i de betingelser som er angitt ovenfor, sammenlignet med p-aktin. D, en apoptose-analyse utført ved flowcytometri som en subG1 populasjon av LNCaP-celler dyrket i 2% FCS-holdig RPMI medium farget med propidiumjodid. * – P 0,01 vs. kontroll; n = 3.
A cellesyklusanalyse ved hjelp av propidiumjodidfarging ble utført for å nøyaktig virkningen av TRPV6 knockdown, så vel som 1,25-dihydroksyvitamin D3 effekter og rollen til TRPV6 deri, på cellesyklus fasefordeling av LNCaP-celler dyrket i 2% FCS inneholdende RPMI-medium (fig. 2B). Faktisk fikk vi bekreftet at siRNA-TRPV6 redusert antall celler inngått S-fasen. Prosentandelen av cellene gikk inn i S-fasen var signifikant høyere i 100 nM 1,25-dihydroksyvitamin D3 behandlede celler enn i kontrollen. Pretransfection av LNCaP celler med siRNA-TRPV6 svekket 1,25-dihydroksyvitamin D3 økt spredning, men ikke i den grad. siRNA-AR som ovenfor, ble anvendt som en positiv kontroll og viste en betydelig nedgang i% av cellene gikk inn i S-fasen.
overvåkes også et protein nivå av prolifererende cell nuclear antigen (PCNA) ved hjelp av samme betingelser. PCNA syntes å bli betydelig redusert ved siRNA-TRPV6 knockdown. 1,25-dihydroksyvitamin D3-behandlede cellene uttrykte to ganger mindre PCNA som ble også observert av den kombinerte behandlingen av siRNA-TRPV6 og 100 nM 1,25-dihydroksyvitamin D3. Nivået av PCNA i siRNA-AR-behandlede celler var detekterbar (Fig. 2C).
A cellesyklusanalyse også tillater å måle en rekke av apoptotiske celler som en subG1 populasjon ble benyttet. 100 nM 1,25-dihydroksyvitamin D3 ikke hadde noen innflytelse på apoptose i seg selv, mens siRNA-TRPV6 hadde signifikant effekt på apoptose hastighet (fig. 2D). Imidlertid, ved å kombinere behandlingen av 100 nM 1,25-dihydroksyvitamin D3 ved transfeksjon av siRNA-TRPV6 økt antall av apoptotiske celler mye mer enn siRNA-TRPV6 forbehandling alene (figur 2D.) I betydelig grad. Således blir TRPV6 involvert i både proliferasjon og apoptose motstand i LNCaP-celler og virkningen av 1,25-dihydroksyvitamin D3 er sterkt avhengig av TRPV6 uttrykk.
TRPV6 medierer 1,25-dihydroksyvitamin D3-indusert Ca
2 + -uptake i LNCaP-celler
for å undersøke bidraget av TRPV6 som et høyt Ca
2 + -selektiv kanal til Ca
2 + -uptake i LNCaP-celler, målte vi intracellulær kalsiumnivå ([Ca
2 +]
i) i LNCaP celler dyrket i 2% FCS inneholder RPMI medium etter påfølgende endringer i ekstracellulære kalsiumnivået ([Ca
2 +]
o). I kontrollceller behandlet med EtOH (CTRL) variasjonen i [Ca
2 +]
o produsert betydelige endringer i [Ca
2 +]
i (Fig. 3A). siRNA-TRPV6 knockdown redusert amplitude på 2 mM for [Ca
2 +]
o-fremkalt økning i [Ca
2 +]
i (fig. 3A og C). 100 nM 1,25-dihydroksyvitamin D3 økt med seg basal [Ca
2 +]
i betydelig samt økt [Ca
2 +]
i respons på anvendelse av 2 mM [Ca
2 +]
o som ble fullstendig reversert ved forbehandling med siRNA-TRPV6 (fig. 3C). Disse dataene indikerer at TRPV6 konstitutivt formidler Ca
2 + -uptake i LNCaP celler og TRPV6 står også for 1,25-dihydroksyvitamin D3-mediert forbedret Ca
2 + -uptake.
A, TRPV6 engasjement i Ca
2+ opptak i LNCaP celler dyrket i 2% FCS-holdig RPMI medium og behandlet enten med SICT (CTRL) eller siRNA-TRPV6 (begge 80 nM, 24 timer). B, Ca
2+ opptak i LNCaP celler dyrket i 2% FCS-holdig RPMI medium og under 1,25-dihydroksyvitamin D3 (100 nM, 3 dager) behandlet enten med SICT (CTRL) eller siRNA-TRPV6 (begge 80 nM, 24 timer). C, en tilsvarende histogram som viser relative [Ca
2 +]
i nivåer etter påfølgende [Ca
2 +]
o brytere i betingelsene som er angitt ovenfor. * – P 0,05 (sammenlignet med kontroll); ** – P 0,01, n = 140.
Virkningene av 1,25-dihydroksyvitamin D3 på forskjellige androgen-uavhengig cellelinjer
To forskjellige androgen-uavhengig cellelinjer var brukt: en androgen reseptor-mangel DU-145 og androgen-insensitive LNCaP c4-2 cellelinjer. Celler ble dyrket under de samme betingelser av 2 eller 10% FCS supplementert RPMI-medium og virkningene av 1,25-dihydroksyvitamin D3 ble undersøkt (fig. 4). Virkningene av 1,25-dihydroksyvitamin D3 for androgen reseptor mangelfull DU-145-cellelinjen var sannsynlig å være serumavhengig siden i 2% FCS de proproliferative virkningene av 1,25-dihydroksyvitamin D3 var konserverte (fig 4A), mens det i 10 % FCS effektene ble opphevet (fig. 4B). Den andre cellelinjen ufølsom for steroider, men likevel uttrykker androgen reseptor, LNCaP c4-2 ble anvendt, hvor virkningene av 1,25-dihydroksyvitamin D3 ble vist å være FCS-uavhengig og 100 nM 1,25-dihydroksyvitamin D3 utøvet sin sterke anti-proliferative effekter (fig. 4C-D). En sanntids kvantitativ PCR ble utført som viser reguleringen av TRPV6 ekspresjon i DU-145-celler ved 100 uM 1,25-dihydroksyvitamin D3 i både 2 og 10% FCS inneholdende medium (fig. 4E). Steroid-belastede forhold i tilfelle av LNCaP-celler (LNCaP-ST) ble også anvendt for å bekrefte at induksjon av TRPV6 ekspresjon avhenger sterkt av steroidet innholdet i dyrkingsmediet (fig. 4F). Dermed pro-proliferative effekter av 1,25-dihydroksyvitamin D3 på veksten av PCA-celler blir bestemt ved dens evne til å indusere ekspresjon av TRPV6 kanal og dens induksjon ser ut til å være sterkt steroidavhengig.
, B, virkningene av 1,25-dihydroksyvitamin D3 på androgen reseptor-manglende DU-145-cellelinjen i både 2 og 10% FCS-holdig RPMI medium (A og B, henholdsvis), * – P 0,05 (sammenlignet med kontroll ), n = 3. C, D, virkningene av 1,25-dihydroksyvitamin D3 på androgen-insensitive LNCaP c4-2-cellelinje i både 2 og 10% FCS-holdig RPMI-medium (C og D, henholdsvis), * – P 0,05 (sammenlignet med kontroll), n = 3. E, de relative ekspresjonsnivåer av TRPV6 kanal i DU-145-celler ble behandlet med 100 uM 1,25-dihydroksyvitamin D3 i 3 dager i 2 og 10% FCS-holdig RPMI medium, * – P 0,05 (sammenlignet med kontroll), n = 3. F, ekspresjonen av TRPV6 kanal indusert ved 100 nM 1,25-dihydroksyvitamin D3 i 3 dager i LNCaP-celler i steroid-belastede RPMI medium (LNCaP- ST), n = 3.
Diskusjoner
en av de viktigste funn av dette arbeidet er at 1,25-dihydroksyvitamin D3 kan forbedre spredning av LNCaP celler. Vi har klart vist at både formeringshastigheten og antallet celler som inngår i S-fasen er øket ved 1,25-dihydroksyvitamin D3 behandling. Disse effektene helt avhengig av ekspresjon og funksjon av TRPV6 kanal som tidligere er blitt vist å være innblandet i prostata cancer vekst og apoptose-motstand [15]. En tidligere rapportert 1,25-dihydroksyvitamin D3 antiproliferativ aktivitet i prostata kreft kan bli svekket av TRPV6 oppregulering.
En rekke arbeider har allerede publisert TRPV6 induksjon av 1,25-dihydroksyvitamin D3 i tarmen [19], nyre [20], halvsirkelformet kanalen [21], og selv prostata kreft celler [22]. Fem VDR-responsive bestanddeler ble funnet i det humane genet som koder for det epiteliale kalsiumkanal TRPV6 noe som tyder på sin direkte regulering av 1,25-dihydroksyvitamin D3 via dens antatte reseptor [17]. Vi har bekreftet i vår modell celle at ekspresjon av TRPV6 er direkte oppregulert av 1,25-dihydroksyvitamin D3 i dose- og tidsavhengig måte. Våre resultater tyder på at innholdet i denne oppregulering er steroid-avhengige siden i steroid-belastede forhold effekten av 25-dihydroksyvitamin D3 er avskaffet. Dette funnet er i samsvar med de data som aktivitetene av 1,25-dihydroksyvitamin D3 i LNCaP-celler er avhengig av steroid co-regulering, og som, for eksempel, androgen receptor oppregulering av 1,25-dihydroksyvitamin D3 bidrar sannsynligvis til de synergistiske virkningene av ett , 25-dihydroksyvitamin D3 og DHT i disse celler [23]. Dataene fra laboratoriet av Feldman viser at tilsetningen av DHT ved 1 nM til mediet gjenopprettet den antiproliferative aktiviteten av 1,25-dihydroksyvitamin D3, mens et antiandrogen, Casodex, fullstendig blokkert 1,25-dihydroksyvitamin D3 og antiproliferative aktiviteter PSA stimulerings når cellene ble dyrket i FBS medium [23].
evnen til 1,25-dihydroksyvitamin D3 å hemme prostata vekst har blitt vist i primære dyrkede celler fra normalt vev, benign prostatahyperplasi (BPH) og prostatakreft og flere xenograft-modeller av prostatakreft [5], men ingen relasjon til TRPV6 respons er vist hittil. Mekanismen for 1,25-dihydroksyvitamin D3-aktivitet er ikke helt klarlagt, men er relatert til ulike aktiviteter med hensyn til pre-reseptor forskjeller i farmakokinetikk, så vel som forskjeller i funksjonell konformasjon av den ligand-bundne VDR kompleks som kan forandre egenskapene til retinoid X reseptor hybridisering, DNA-binding og co-aktivator rekruttering [24]. Mekanismen for vekstinhibering av 1,25-dihydroksyvitamin D3 synes å være mutifactorial men induksjon av p21
WAF1 /CIP1 og /eller p27
Kip1 synes å være et stort reaksjonsvei [25].
Vi er de første til å rapportere at effekten av 1,25-dihydroksyvitamin D3 kan være pro-proliferativ når mediert av direkte induksjon av
trpv6
genuttrykk i menneskets svært kreft androgen-avhengige LNCaP cellelinje. Spørsmålet er fortsatt åpent om 1,25-dihydroksyvitamin D3 behandling er gjennomførbart i kreft stadier og metastase å være tydelig i høy TRPV6 uttrykk, eller på annen måte, i prostatakreftceller biopsier likevel responsive til 1,25-dihydroksyvitamin D3 behandling av overekspresjon TRPV6.
Dermed oppregulerer 1,25-dihydroksyvitamin D3 TRPV6 som betydelig øker [Ca
2 +]
i gir økt Ca
2 + -uptake av LNCaP celler. Dette 1,25-dihydroksyvitamin D3-indusert Ca
2 + -uptake øker dramatisk formeringshastigheten og et antall av cellene som kommer inn i S-fasen, og bidrar til økt apoptose motstand også. Intriguingly, forblir upåvirket ved apoptose 1,25-dihydroksyvitamin D3 behandling som kan forklares ved respons fra LNCaP-cellelinje for 1,25-dihydroksyvitamin D3 via øke ekspresjonen av TRPV6 kanal, og derfor styrke motstanden mot apoptose. Men når LNCaP-celler er behandlet med 1,25-dihydroksyvitamin D3, men pretransfected med siRNA-TRPV6 og derfor blottet for denne kanalen er de mye mer utsatt for apoptose at det blir sammenlignes med virkningen av siRNA mot AR benyttes en positiv kontroll. Dette innebærer at kalsium tilføres i kreftcellen via TRPV6 kanal blir brukt til å motvirke effektene av 1,25-dihydroksyvitamin D3 som må være antiproliferativ i fravær eller i nærvær av lav denne kanalen. Vi konkluderer med at TRPV6 er en alvorlig determinant for 1,25-dihydroksyvitamin D3 pro- eller antiproliferativ aktivitet.
Våre data er ikke motstridende til de tidligere publiserte arbeider og er konsistent med hypotesen om at veksthemmende effekten av en , 25-dihydroksyvitamin D3 er delvis mediert gjennom sin evne til å modulere ekspresjon PCNA [26]. En PCNA proteinnivået være to ganger nedsatt på 1,25-dihydroksyvitamin D3 behandling blir ytterligere redusert i LNCaP-celler transfektert med siRNA-TRPV6, med eller uten 1,25-dihydroksyvitamin D3.
