Abstract
Bakgrunn
Celastrol er en naturlig proteasominhibitor som viser lovende anti-tumor effekter i menneske maligniteter, spesielt androgen-uavhengig prostatakreft (aipc) med konstituerende NF-kB aktivering . Celastrol induserer apoptose ved hjelp av proteasomhemmingen og undertrykker prostata tumorvekst. Men den detaljerte virkningsmekanismen fortsatt ukjent. I denne studien har vi som mål å teste hypotesen om at celastrol undertrykker aipc progresjon via hemme konstituerende NF-kB aktivitet samt modulere Bcl-2 familien proteiner.
metodikk /hovedfunnene
Vi undersøkte effekten av celastrol både
in vitro Hotell og
in vivo
, og evaluert rollen som NF-kB i celastrol-mediert aipc regresjon. Vi fant at celastrol inhiberte celleproliferasjon i alle tre aipc cellelinjer (PC-3, DU145 og CL1), med IC
50 i størrelsesorden 1-2 um. Celastrol også undertrykt celle migrasjon og invasjon. Celastrol betydelig indusert apoptose som gjenspeiles av økt sub-G1 befolkningen, caspaseaktivering og PARP cleavage. Videre celastrol fremmet spalting av anti-apoptotiske protein Mcl-1 og aktiveringen av pro-apoptotiske protein Noxa. I tillegg celastrol raskt blokkert cytosolic IκBα degradering og kjernekraft translokasjon av RELA. Likeledes celastrol hemmet ekspresjon av flere NF-kB målgener som er involvert i proliferasjon, invasjon og anti-apoptose. Celastrol trykt aipc tumorprogresjon ved å hemme spredning, økt apoptose og mink angiogenese, i PC-3 xenograft modell i naken mus. ble observert Videre økt cellulær IκBα og hemmet uttrykk for ulike NF-kB målgener i tumorvev.
Konklusjon /Betydning
Våre data tyder på at, via målretting proteasome, undertrykker celastrol spredning, invasjon og angiogenese ved å fremkalle den apoptotiske maskiner og demping konstituerende NF-kB aktivitet i aipc både
in vitro Hotell og
in vivo
. Celastrol som en aktiv ingrediens i tradisjonell urtemedisin kunne dermed bli utviklet som et nytt terapeutisk middel for hormon-ildfast prostatakreft
Citation. Dai Y, DESANO J, Tang W, Meng X, Meng Y, Burstein E , et al. (2010) Natural proteasominhibitor Celastrol undertrykker androgen uavhengig prostatakreft Progresjon av Moduler apoptotiske proteiner og NF-kappaB. PLoS ONE 5 (12): e14153. doi: 10,1371 /journal.pone.0014153
Redaktør: Gen Sheng Wu, Wayne State University, USA
mottatt: 10 juli 2010; Godkjent: 10 november 2010; Publisert: 10.12.2010
Copyright: © 2010 Dai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av Department of Defense Prostate Cancer Research Program [W81XWH-06-1-0010] og National Institutes of Health (NIH) National Cancer Institute [R01 CA121830 (S1), R21 CA128220 og R01 CA134655] til LX, og ved å NIH gjennom en University of Michigan Cancer Center Support Grant [5 P30 CA46592]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
proteasome er en multikatalytiske protease kompleks ansvarlig for degradering av flere intracellulære proteiner som er involvert i ulike cellulære hendelser, inkludert DNA-reparasjon, cellesyklus, overlevelse og apoptose. For eksempel, p27, et nøkkelregulator for G1 til S overgang i cellesyklus, blir raskt nedbrutt av ubiquitinmolekyler og proteasomer fører til p27 korte halveringstid [1]. Dessuten er de fleste Bcl-2-familieproteiner forringes av ubiquitin-proteasom system (UPS) [2], [3], [4]. Nukleær faktor kappaB (NF-kB) er en viktig pro-overlevelsesfaktor som er dreibart regulert av proteasomet, siden det er vel kjent at i den klassiske NF-kB vei, IκBα, den Sequester av NF-kB, forringes av proteosomet derfor frigjørende NF-kB for aktivering [5].
Monterings bevis viser at vedvarende eller konstitutiv aktivering av NF-kB bidrar til ondartet progresjon og terapeutisk motstand i de fleste humane cancere [6]. For eksempel, i prostata cancer, konstitutivt aktiv NF-kB er blitt vist å være inverst korrelert med androgen receptor status og knyttet til androgen uavhengighet og terapi motstand [7]. Den forhøyede NF-kB overlevende signalveien i den androgen-uavhengig prostatacancer (aipc) synes å være korrelert med høy proteosomet aktivitet, noe som reflekteres ved en hurtigere omsetning av IκBα [8], [9]. Basert på dette bevis, kan målrette proteasomer redusere NF-kB aktivitet og dermed være en nyttig strategi i aipc intervensjon. Faktisk har modulering av proteasomal funksjon med spesifikke inhibitorer allerede blitt påvist som en lovende tilnærming til behandling av human prostatakreft. Bortezomib (VELCADE, PS-341), den første til å bruke en proteasominhibitor i en klinisk anvendelse, har vist anti-tumor aktivitet når det brukes som monoterapi eller i kombinasjon med konvensjonell behandling i hormon-refraktær prostata kreft [10]. I prekliniske kreft modeller, proteasomhemmere indusere prostatakreft apoptose både
in vitro Hotell og
in vivo product: [11], [12], noe som gir betydelig bevis for at de proteasomhemmere kan brukes som en terapeutisk strategi for aipc.
Celastrol er en naturlig proteasominhibitor som har blitt rapportert å vise anti-proliferative effekter og apoptose i kreft flere prekliniske modeller [12], [13]. Mekanistisk har NF-kB er vist å være et viktig mål for celastrol [14]. Nylige studier har antydet at celastrol kan forbedre apoptose og blokkere enten konstitutiv eller indusert NF-kB-aktivering med andre terapeutiske midler, slik som tumornekrosefaktor [15], temozolomid [16] og gambogic syre [17]. Videre er celastrol foreslått å undertrykke xenopodet tumorvekst via målretting angiogenese [18], [19]. I prostata kreft innstillingen, celastrol alene utløser apoptose ved hjelp av proteasomhemmingen og undertrykker prostatatumorvekst [12]. Men den direkte virkningsmekanismen fortsatt ukjent. I denne studien har vi som mål å teste hypotesen om at celastrol undertrykker aipc progresjon via hemme konstituerende NF-kB aktivitet samt modulere Bcl-2 familien proteiner. Vi bestemte effekten av celastrol både
in vitro Hotell og
in vivo
, og evaluert rollen som NF-kB i celastrol-mediert aipc regresjon.
Materialer og metoder
Reagenser og cellekultur
Celastrol (98% renhet) ble kjøpt fra Gaia Chemical (Gaylordsville, CT). Pulveret ble løst i dimetylsulfoksid (DMSO) og lagret i alikvoter (20 mM) ved -70 ° C. MG-132 ble kjøpt fra BIOMOL (Plymouth Meeting, PA). Proteasehemmer cocktail ble levert av Roche (Indianapolis, IN). Andre kjemikalier ble innkjøpt fra Sigma, med mindre annet er angitt. Menneskelige prostata kreft cellelinjer PC-3, ble DU145 og LNCaP kjøpt fra American Type Culture Collection. Androgen-uavhengig prostatakreft cellelinje CL1, utledet fra androgen-avhengige LNCaP cellelinje [20], ble vennlig levert av Dr. Arie Belldegrun (University of California, Los Angeles, California). Celler ble opprettholdt i RPMI-1640 (PC-3) eller DMEM (DU145, LNCaP og CL1) supplert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin, og inkubert i en 5% CO
2 fuktet inkubator ved 37 ° C.
celleproliferasjon og celledød
Cellene ble sådd i en 96-brønners plate og behandlet med celastrol i tre eksemplarer. Etter 4 dagers inkubering, ble levedyktige celler identifisert ved hjelp av en celletelling sett med WST-8 (Dojindo, Rockville, MD), og absorbans ble testet ved 450 nm kolorimetrisk. Cellenes levedyktighet (%) var forholdet mellom absorbans av behandlede prøve til ubehandlet kontroll [21], [22]. Alternativt kan celler ble sådd i en 24-brønns plate ved en densitet på 2 x 10
5-celler /brønn og ble behandlet med celastrol i to brønner. Festede celler ble høstet og telt ved bruk av en Coulter celleteller (Fullerton, CA) hver 24. time i 4 dager. Celledød ble testet ved trypan blå utelukkelse for både flytende og knyttet celler [21], [23]. Data ble plottet og analysert ved hjelp av GraphPad Prism 5,0 (San Diego, CA). Femti prosent hemmende konsentrasjoner (IC
50) ble beregnet ved hjelp av en sigmoidal dose-respons-lineær regresjonsanalyse (Prism 5.0) [21], [22], [24].
Cell Migration
Cellemigrering migrering~~POS=HEADCOMP ble bestemt ved en «sår-helbredende» analyse [25], [26]. Celler ble sådd ut i en 6-brønns plate og ble i 48 timer for å oppnå konfluens. Gaps ble skapt kunstig ved å skrape cellemonolaget. Cellemigrering ble fotografert 6 timer, 24 timer og 48 timer etter hver bunnen av. Celler migrerer inn i ribbet området ble scoret fra fire tilfeldige felt.
Cell Invasion
Invasion ble testet ved hjelp av Transwell (8 mikrometer pore) pre-lastet med Matrigel (BD Biosciences, San Diego, CA ). Celler ble inkubert med eller uten celastrol (1 uM) i et serumfritt medium og applisert på toppkammeret (2 x 10
4 /insert). Den komplette medium (10% FBS) ble tilsatt til det nedre kammer for å generere en chemotractant. Tjuefire timer etter celle seeding, ble innleggene tørkes av med en bomullspinne for å fjerne Matrigel, og farget med krystallfiolett (0,1%). Invaderende celler på undersiden av filteret ble bedømt fra åtte tilfeldige felt.
Cell Cycle Analysis
Celler ble fiksert i 70% etanol ved 4 ° C natten over, og deretter behandlet med propidiumjodid ( PI, 50 ug /ml) og RNase A (1 pg /ml) i 30 min. Prøvene ble analysert ved strømningscytometri (FACSCalibur, BD Biosciences). Under G1 befolkningen ble scoret fra hypodiploid DNA innhold [24], [27]. Data ble analysert ved hjelp av WinMDI 2.8 programvare (Purdue University Cytometry Laboratory).
caspaseaktivering
Celler ble homogenisert i en lyseringsbuffer (BioVision, Mountain View, CA), og helcellelysater (40 ug) ble inkubert med 20 pM av fluorogent substrat LEHD-AFC eller DEVD-AFC i en reaksjonsbuffer (BioVision) inneholdende 5 mM DTT ved 37 ° C i 1 time. Proteolytisk utgivelsen av AFC ble overvåket ved λex = 405 nm og λem = 500 nm ved hjelp av en fluorescens mikroplateleser (BMG LABTECH, Cary, NC). Aktivitet er uttrykt som «ganger økning», og beregnet som forholdet av fluorescens-signal i behandlede prøver med ubehandlede kontrollceller.
Western Blot
Hele celle lysater av celler eller tumorvev ble laget og Western blot eksperimenter ble utført som vi tidligere beskrevet [26]. Antistoffer mot poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (F-2), Mcl-1 (S-19), Bcl-2 (C-2), ubiquitin (P4D1), caspase-3 (H-277), IκBα (C-15), rela (F-6), tubulin (4G1) og GAPDH (L-20) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-Noxa antistoff ble kjøpt fra Calbiochem (Gibbstown, NJ). Anti-β-aktin (AC-74) antistoff ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO). Band tetthet ble kvantifisert ved TotalLab programvare (Durham, NC).
subcellulære fraksjonering
cytosoliske og kjernefysiske fraksjoner ble fremstilt som tidligere beskrevet [24], [25]. I korthet ble cytosolisk ekstrakt erholdt ved homogenisering av cellene i en hypotonisk buffer [10 mM HEPES, 5 mM KCl, 1,5 mM MgCl
2 og 1 mM ditiotreitol (DTT) med protease inhibitor cocktail], etterfulgt av tilsetning av Igepal CA- 630 (0,5%). Pelletene ble løst i en hypertonisk buffer (20 mM HEPES, 50 mM KCl, 300 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, og proteaseinhibitorer) for å oppnå kjerneekstrakter. Subcellulære proteiner ble kvantifisert ved Bradford assay før Western blot.
kvantitativ real-time PCR (qPCR)
qPCR ble utført for å bestemme NF-kB target genekspresjon [28]. Total RNA ble ekstrahert ved bruk av TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge produsentens instruksjoner. cDNA ble oppnådd ved revers transkripsjon med 1 pg av total RNA ved anvendelse av en TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied BioSystems). SYBR Green ble anvendt for kvantitativ PCR. Sekvenser av genet primere er oppført i tabell S1. Reaksjoner med TaqMan PCR Master Mix (Applied Biosystems) ble utført på Mastercycler
realplex
2 S system (Eppendorf, Westbury, NY). mRNA nivåer av målgener ble normalisert til GAPDH med formelen: [2∧- (C
T target-C
T Actin)] x 100%, hvor C
T er terskelen syklusen [27] . mRNA-ekspresjon er uttrykt som «ganger økning» og ble beregnet ved å dele den normaliserte mål-gen ekspresjon av den behandlede prøve med ubehandlede kontrollceller.
dyrestudie
Dame atymiske nu /nu-mus (fem uker) ble inokulert subkutant (sc) med PC-3-celler (3 x 10
6) på begge sider av den nedre rygg. Når svulster vokste til 100 mm
3, ble musene randomisert og behandlet daglig via oral sonde (peroralt) med kjøretøy kontroll [12] eller celastrol i en dose på 1 mg /kg med 5 dager per uke i 3 uker. Tumorstørrelsen ble målt på den siste dosering av celastrol (dag 18). Tumorvolumet ble beregnet som (lengde x bredde
2) /2. Tumorprøver ble fiksert i 4% paraformaldehyde og embedded med parafin. Immunhistokjemisk analyse ble utført ved Ki67, terminal deoksynukleotidyltransferase biotin-dUTP nick ende merking (TUNEL), og CD31-farging for påvisning av proliferasjon, apoptose og angiogenese, henholdsvis, som vi tidligere beskrevet [22], [23], [26] . Alle dyreforsøk ble utført i henhold til protokoller godkjent av University of Michigan Retningslinjer for bruk og stell av dyr.
Statistical Analysis
To-tailed Student
t
-test ble ansatt for å analysere både
in vitro Hotell og
in vivo
data. Alle analyser ble utført av GraphPad Prism 5.0. En terskel for
P
. 0,05 ble definert som statistisk signifikant
Resultater
Celastrol hemmer prostatakreft Cell Proliferation
Celastrol har blitt rapportert å vise anti-tumor-aktivitet i humane prostatacancerceller [12]. I vår studie, fikk vi bekreftet at celastrol redusert celle levedyktighet i begge androgen-avhengige (LNCaP) og androgen-uavhengig (PC-3, DU145, CL1) prostata kreft celler, med en IC
50 av cytotoksisitet mindre enn 2 mikrometer ( fig. 1A). For PC-3-celler, celastrol inhiberte proliferasjonen doseavhengig måte (fig. 1B), med 65% veksthemming hos IC
50 dose (~ 1 mm) på dag 3. Etter 2 uM, celastrol fullstendig hemmet cellevekst i cellelinjene testet. Disse data viser at celastrol gående avtar aipc celleproliferasjon og levedyktighet ved konsentrasjoner mindre enn 2 uM
(A): Cellene ble behandlet med forskjellige doser av celastrol og cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse.. IC
50 ble vist som beregnet av Prism 5.0. Dataene er gjennomsnitt ± SD (n = 3). (B): PC-3-celler ble behandlet med forskjellige doser av celastrol (Cel). Festede celler ble høstet og tellet daglig i 4 dager. Viste data er gjennomsnitt ± SD (n = 6).
Celastrol undertrykker migrasjon og invasjon
Som en høyere konsentrasjon av celastrol var cytotoksisk (Fig. 1), vurderte vi effekten av celastrol på celle migrasjon og invasjon ved hjelp av ikke-toksiske doser ( 1 mm). Celastrol hemmet PC-3-celle migrasjon i både en dose- og tidsavhengig måte (fig. 2A). Med konsentrasjoner (0,5 mm) som minimalt berørt spredning, celastrol forhindret cellemotilitet 24 timer etter behandling (
P
0,001, figur 2B.). Videre ble DU145 celle invasjon hemmet til 70% av en mikrometer av celastrol (
P
. 0,001, figur 2C og D). Disse dataene tyder på at celastrol undertrykker aipc cellemigrering og invasjon ved subcytotoxic konsentrasjoner
(A).: PC-3 monolag celler ble skrapet og behandlet med celastrol ved 0,5 og 1 pM. «Sårhelende» ble testet på 6 timer, 24 timer og 48 timer etter scratch. Original forstørrelse, × 100. (B): kvantifisering av celle migrasjon i A fra 4 tilfeldige felt i duplikate prøver.
Kolonner
, mener;
barer
, SD (n = 8). ***,
P
0,001. (C): DU145 celler behandlet med eller uten 1 mM av celastrol ble sådd på Matrigel-belagte Transwell innsatser (2 x 10
4 /insert) i 24 timer. Celler på undersiden av filteret var farget. Original forstørrelse, × 200. (D): invaderende celler i (C) ble bedømt fra 8 tilfeldige felt.
Kolonner
, mener;
barer
, SD (n = 8). ***,
P
. 0,001
Celastrol induserer apoptose og modulerer Mcl-en
Vi neste undersøkt om apoptose er involvert i celastrol-mediert cytotoksisitet . Celastrol faktisk indusert kromatin kondens og DNA-fragmentering i aipc celler. PC-tre behandlet med 2 mikrometer av celastrol for 24 timer produsert en 8 ganger økning i sub-G
1 befolkningen (fig. 3A). I tillegg celastrol indusert G
2 /M arrest (Fig. 3A) som var i samsvar med en tidligere rapport [29], noe som ytterligere demonstrere celastrol effekt på cellesyklus arrest. Celastrol også dramatisk forbedret enzymatisk aktivitet av både caspase-9 og caspase-3 i DU145, med den sterkeste aktivering (2,9 ± 0,4 ganger for caspase-9 og 22,3 ± 3,5 ganger for caspase-3, henholdsvis
P
. 0,001) ved 8 timer etter behandlingen (figur 3B), som angir forsterkningen av caspase kaskade i den indre apoptotiske reaksjonsvei. Celastrol indusert PARP cleavage som kan omgjøres av pan-caspase hemmer zVAD, demonstrere apoptose er caspase avhengig (Fig. 3C). Interessant nok celastrol ble vist for samtidig å samle og spalte anti-apoptotiske protein Mcl-1 på et tidlig (4 h) i stedet for et sent stadium (24 h) i PC-3 (fig. 3C). En slik observasjon var forenlig med ekspresjon av intracellulær ubiquitin (Fig. 3C), noe som tyder på en rask og komplisert regulering av Mcl-1 ved proteasom-inhibitoren. I DU145, ble et lignende fenomen observeres. Mcl-en spalting som oppstod i den tidlige fasen (4-8 h) (fig. 3D) ble korrelert med caspaseaktivering (Fig. 3B). Videre er induksjon av spaltet Mcl-1 ble reversert ved zVAD (Fig. 3C), noe som indikerer at en slik spalting formidles av caspaser. I motsetning til dette ble liten endring observert for Bcl-2 (fig. 3C), Bcl-xL eller XIAP (data ikke vist), noe som tyder på at blant de anti-apoptotiske Bcl-2-familieproteiner, vises Mcl-en for å være et viktig mål av celastrol i cellelinjene som ble testet
(A).: PC-3-celler ble behandlet med celastrol i 24 timer og cellesyklus ble testet. Cellepopulasjon i hver celle syklus fase ble numerisk avbildet. Data representerer en av tre uavhengige eksperimenter. (B): DU145-celler ble behandlet med celastrol (2 uM) til ønskede tidspunkter. Enzymatisk aktivitet av kaspase-9 og caspase-3 ble bestemt fluorometrisk.
Kolonner
, mener;
barer
, SD (n = 3). (C): PC-3-celler ble behandlet med celastrol med eller uten en time forbehandling av de pan-capsase inhibitor zVAD (2 uM) for Western blot-analyse. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. Celledød ble påvist ved trypan blå eksklusjon. (D): DU145-celler ble behandlet med celastrol (2 uM) for Western blot. Actin er en lasting kontroll.
Celastrol induserer apoptose ved å aktivere Noxa
Det har vist seg at Noxa, en BH3-bare pro-apoptotiske proteiner, kan være betydelig indusert av bortezomib [ ,,,0],30]. I denne studien undersøkte vi om Noxa kan også aktiveres ved celastrol. Faktisk celastrol indusert Noxa ekspresjon som var forenlig med caspase-3 aktivering, PARP-spaltning og ubiquitin akkumulering doseavhengig måte i CL1 celler (Fig. 4A) og PC-3-celler (fig. 4B). Videre oppstod Noxa induksjon så tidlig som 2 timer etter behandlingen, mye raskere enn kaspase-3 aktivering og PARP-spaltning i CL1 (fig. 4C). Sammen utgjør disse data tyder på at Noxa er sterkt og raskt aktiveres av celastrol, som kan være ansvarlig for den pro-apoptotiske effekt i aipc celler
(A). CL1 celler ble behandlet med celastrol i 16 timer. (B): PC-3-celler ble behandlet med celastrol (2 uM) for angitte tidspunkter. (C): CL1 celler ble behandlet med celastrol (2 uM) i 16 timer. Hele cellelysater ble analysert ved Western blot, med Actin som en lasting kontroll.
Celastrol Undertrykker Constitutive NF-kB aktivitet
Det er vel kjent at proteasomhemmere, inkludert celastrol, kan blokkere NF-kB aktivitet i ulike menneske kreft [15]. I vår studie har vi testet om et lignende resultat kan oppnås i aipc celler. I PC-3-celler, celastrol blokkert cytosolisk IκBα nedbrytning, så vel som kjernetranslokasjon av NF-kB-protein Rela /p65, som viser effekter som overskred MG132, en utbredt proteasominhibitor som er vist å blokkere NF-kB signalering [31] ( fig. 5A). Tilsvarende celastrol doseavhengig forårsaket subcellulære omfordeling av NF-kB i DU145-celler (Fig. 5B). Videre mye som MG132, celastrol hemmet ekspresjon av ulike NF-kB målgener som er involvert i flere trinn for tumorutvikling, inkludert proliferasjon (CXCL1, c-Myc og Cyclin-D1), adhesjon (ICAM-1), migrasjon ( CXCL1), invasjon (MMP-9), og anti-apoptose (BIRC2 /4/5, Bcl-2 og Bcl-xL) (tabell. 1). Den hemmende effekten av NF-kB ved celastrol ble ytterligere bekreftet av luciferase reporter-analyse (data ikke vist). Disse data viser at celastrol kan undertrykke aipc progresjon av vanskelig konstitutiv NF-kB aktivitet
(A).: PC-3-celler ble behandlet med celastrol (2 uM), eller MG132 (10 uM) i 30 minutter. (B): DU145-celler ble behandlet med celastrol (1 og 2 uM) i 30 minutter. For både (A) og (B), ble cellene behandlet for subcellulære fraksjonering. Cytosolisk ekstrakt (CE) ble undersøkt for IκBα og kjerneekstrakt (NE) ble undersøkt for RELA. Tubulin og PARP brukes som markør og lastekontroll for CE og NE, henholdsvis.
Anti-tumor effekt av Celastrol Innebærer NF-kB Demping i PC-3 xenografter
for å finne ut om NF-kB undertrykkelse ville bidra til tumorregresjon
in vivo
, evaluert vi celastrol effekt i det etablerte PC-tre xenopodet modell som beskrevet tidligere [26]. Behandling av celastrol (1 mg /kg) i 3 uker, inhiberte PC-3 tumorveksten (
P
0,05) (Fig. 6A), med en minimal systemisk toksisitet [26]. Histologisk analyse viste at celastrol redusert Ki67-positive celler og CD31-positive mikrokar, og økt TUNEL-positive celler (Fig. 6B), noe som tyder på at celastrol avtar proliferasjon og angiogenese, og induserer apoptose i tumorvevet. Videre ble samlet IκBα vist seg å ha samlet etter behandling (Fig. 6C). Også ekspresjon av NF-kB målgener som er involvert i proliferasjon (CXCL1), angiogenese (IL-8) og anti-apoptose (BIRC2 og BIRC3) ble hemmet ved celastrol i tumor (
P
0,01 for CXCL1 og BIRC2;
P
. 0,001 for andre gener) (fig 6D). Disse data indikerer at dempningen av NF-kB korrelerer med PC-3 tumorregresjon ved celastrol
in vivo
(A):. Tumorvolum ble målt etter celastrol behandling. Antall mus i hver gruppe ble vist. *,
P
0,05. (B): tumorsnitt ble behandlet med anti-Ki67, TUNEL og anti-mus CD31-farging. Original forstørrelse, × 400. (C): helcellelysater (50 ug) av tumorvev ble probet med anti-IκBα antistoff. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. Expression fold var forholdet mellom IκBα uttrykk i celastrol gruppen til kjøretøykontroll. (D): qPCR-analyse av NF-kB target-genekspresjon i tumorer. Total RNA fra tumorvev ble ekstrahert for revers transkripsjon. Gene primere ble blandet med cDNA og SyberGreen for qPCR.
Kolonner
, mener;
barer
, SD (n = 3). **
P
0,01; ***,
P
. 0,001
Diskusjoner
I denne studien har vi funnet ut at celastrol, en naturlig proteasominhibitor, undertrykker aipc progresjon av moduler to veier. Først induserer celastrol caspase-avhengig apoptose ved å regulere anti-apoptotiske proteiner Mcl-en og aktivere pro-apoptotiske proteiner Noxa. For det andre, ved å hindre IκBα degradering, demper celastrol konstitutiv NF-kB aktivitet og dermed opphever den hemmende effekten av NF-kB på apoptose, så vel som å fremme proliferasjon, angiogenese, migrering og invasjon (fig. 7). Samlet disse dataene belyse potensialet effekt og mekanisme av celastrol i behandling aipc via målretting proteasome.
Celastrol blokker proteasome funksjon, noe som resulterer i Mcl-en omsetning og noxa induksjon som utløser apoptose. Samtidig forhindrer celastrol IκBα degradering, noe som fører til NF-kB undertrykkelse. Totalt sett forstyrrer celastrol aipc celleproliferasjon, migrasjon, invasjon og angiogenese, og induserer apoptose av vesentlig vanskelig konstituerende NF-kB aktivitet.
Det er vist at feilregulert proteasome funksjon er korrelert med tumorprogresjon og terapi motstand i humane cancere [32]. Hyperaktive av NF-kB korrelerer med fenotypen av androgen uavhengighet og terapi motstand i aipc [7], [33]. I PC-3-celler, er høy konstitutiv NF-kB aktivitet, i det minste delvis, et resultat av et høyt nivå av proteasomet aktivitet [34]. I denne studien rapporterer vi at celastrol ikke bare en potent hemmer av PC-tre vekst, migrasjon, invasjon, og angiogenese, men induserer også apoptose som er assosiert med NF-kB demping både
in vitro Hotell og
in vivo
. Dette funnet tyder på at i aipc, undertrykke NF-kB ved å målrette proteasome gjelder i forstyrre tumorprogresjon, inkludert primær vekst og metastasering. Selv om flere bevis er nødvendig for å avgrense rollen som NF-kB i celastrol-mediert tumor regresjon, vår nåværende studie viser at celastrol hemmer flere NF-kB-drevet genuttrykk som er involvert i aipc vekst og metastasering. Våre funn, i samsvar med andre [35], [36], viser at NF-kB er en sentral formidler av aipc progresjon, og celastrol, fungerer som en aktiv naturlig proteasominhibitor, kan betydelig svekke aipc progresjon.
mcl-1 er et anti-apoptotiske proteiner i Bcl-2-familien som blir raskt nedbrutt av proteasomet, og derfor har en kort halveringstid ( 3 h) [37]. Et økende antall studier foreslår at proteasomhemmere er i stand til å reversere Mcl-1 funksjon via spalting av det opprinnelige molekylet med caspaser for å generere en kort form (26~28 kDa) som er pro-apoptotiske uavhengig av den direkte stabilisering av full lengde mcl-1 [38], [39]. En slik rask omsetning av Mcl-en streker rask respons ved kreftceller når de møter proteasome stress, bytter fenotype fra celle overlevelse til programmert celledød. I samsvar med bortezomib [38], [40], finner vi at i aipc, celastrol også betydelig regulerer Mcl-en på et tidlig stadium av paradoksalt akkumulere anti-apoptotiske opprinnelige form, samtidig som genererer pro-apoptotiske spaltet form. Som celler gjennomgår apoptose slutt, er det rimelig å postulere at spaltet Mcl-en kan være viktigere å kontrollere mobilnettet atferd enn tidligere rapportert [41]. Dette er fordi Mcl-en spaltning forekommer sammen med caspaseaktivering og før PARP-spaltning, mens økt intakt Mcl-1 er bare en forbigående hendelse som reaksjon på proteasomhemmingen. Induksjon av spaltet Mcl-1 kan delvis reduseres av den kaspaseinhibitor, noe som tyder på at en slik induksjons er caspase-avhengig. Interessant, spaltes Mcl-1 nivåer reduseres på et senere stadium, noe som er konsistent med intakt Mcl-en. Dette tyder på at selv etter spalting av kaspaser, er Mcl-1 fragment fremdeles er regulert av proteasomer. Samlet utgjør disse observasjonene tyder på at i aipc celler, Mcl-en er et viktig mål for celastrol som viser en kompleks reaksjon av proteasomhemmingen.
Mye som Mcl-en, er Noxa annen Bcl-2 familien protein som er sterkt økt med proteasomhemmingen i forskjellige krefttyper, inkludert melanom [30], [42] og myelomatose [39], [43]. Men i motsetning til Mcl-1, er Noxa ikke et direkte substrat av proteasomet [44]. I stedet er Noxa mRNA transkripsjonelt forsterket av en proteasominhibitor [44], [45]. Noxa er en BH3-bare pro-apoptotiske proteiner funksjon i mitokondrie apoptose [4], [22]. Ved stress, kan Noxa aktiveres i et p53-avhengig måte og samvirke med anti-apoptotiske proteiner, og dermed oppheve deres negative effekt på apoptose [46]. Våre resultater tyder på at Noxa ekspresjon oppstår selv før aktivering av initiatoren caspase-9, noe som indikerer at det er en tidlig mediator av celastrol-indusert apoptose. Intriguingly, ingen av de tre aipc cellelinjene har funksjonell p53 (PC-3 og CL1: p53 null; DU145: p53 mutant). Dermed Noxa induksjon ved celastrol er p53-uavhengig. Hvordan Noxa er positivt regulert i en p53-mangel scenario er uklart. Ikke desto mindre, som Noxa induksjons korrelerer med Mcl-1 akkumulering, og siden den Mcl-1 /Noxa kompleks er rapportert å øke med bortezomib [39], aktuelle data indikerer at den potensielle funksjon av det induserte Noxa kan være i samspill med akkumulert Mcl- 1 og nøytralisere sin anti-apoptotisk effekt. Sammen utgjør disse dataene viser at både MCL-1 og Noxa utstillingen raske og mangesidig omsetning hendelser ved proteasomhemmingen og celastrol samordning av disse to BCL-2 familiemedlemmer vil føre til apoptose gjennom initiering av caspase kaskade i aipc.
i sammendraget, våre data skissere potente anti-tumor effekter av den tradisjonelle naturlige proteasominhibitor celastrol på androgen-uavhengig prostatakreft. Den doble rollen celastrol, moduler både apoptotiske proteiner og NF-kB, garanterer at hensynet som en potensiell terapeutisk kandidat i behandling av hormon-refraktær prostatapasienter med konstitutivt aktiv NF-kB.
Hjelpemiddel Informasjon
Supplemental Tabell S1 ..
Grunning for real-time PCR (human)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0014153.s001 plakater (0,01 MB PDF)
Takk
Vi ønsker å takke Susan Harris for å få hjelp med manuskriptet; Dr. Arie Belldegrun ved University of California – Los Angeles for bes gi CL1 cellelinje; University of Michigan Comprehensive Cancer Center (UMCCC) Histologi Kjerne for å få hjelp med immunohistologi studien; UMCCC Enhet for Forsøksdyr Medicine (Ulam) for å få hjelp med dyreforsøk, og UMCCC flowcytometrisystemer Kjerne for flowcytometri analyse.
