Abstract
Bakgrunn
Effekten av cisplatin-basert kjemoterapi i ikke-små-celle lungekreft er begrenset av den ervervede medikamentresistens. Identifikasjon av RNA knyttet til cisplatin resistens kan bidra til å forbedre kliniske responsen.
Metoder
Microarray uttrykk profilering av mRNA, lncRNA og miRNA ble gjennomført i A549 celler og cisplatin motstandsdyktig A549 /CDDP celler . Forskjellig uttrykt mRNA, lncRNAs og mirnas, verifisert av realtime RT-PCR, ble utsatt for skoleveien analyse. Uttrykk for NKD2 og β-catenin ble vurdert av realtime RT-PCR og Western blot analyse. Effekten av lncRNA AK126698 på cisplatin-indusert apoptose ble undersøkt av annexin-V /PI flowcytometri.
Resultater
I alt 1471 mRNA, 1380 lncRNAs og 25 mirnas forskjellig uttrykt i A549 /CDDP og A549 celler. Blant dem, ble 8 mRNA, 8 lncRNAs og 5 mirnas forskjellig uttrykt i genet chip analyse validert. Høy berikelse pathway analyse avdekket at noen klassiske trasé deltatt i spredning, differensiering, unngåelse av apoptose, og legemiddelmetabolisme ble annerledes uttrykt i disse cellelinjer. Gene co-uttrykk nettverk identifisert mange gener som FN1, CTSB, EGFR, og NKD2; lncRNAs inkludert BX648420, ENST00000366408, og AK126698; og mirnas som MIR-26a og la 7i potensielt spilt en nøkkelrolle i cisplatin motstand. Blant annet, ble den kanoniske Wnt veien undersøkt fordi det har vist seg å bli målrettet av både lncRNAs og mirnas inkludert lncRNA AK126698. Knockdown lncRNA AK126698 ikke bare sterkt redusert NKD2 som kan negativt regulerer Wnt /β-catenin signal men også økt akkumulering og kjernekraft translokasjon av β-catenin, og betydelig deprimert apoptose rente indusert av cisplatin i A549 celler.
Konklusjon
Cisplatin motstand i ikke-småcellet lungekreft celler kan forholde seg til endringer i ikke-kodende RNA. Blant disse, synes AK126698 å gi cisplatin motstand ved å målrette den Wnt veien
Citation. Yang Y, Li H, Hou S, Hu B, Liu J, Wang J (2013) Den ikke-kodende RNA Expression profil og effekt av lncRNA AK126698 på Cisplatin Resistance in Non-småcellet lungekreft Cell. PLoS ONE 8 (5): e65309. doi: 10,1371 /journal.pone.0065309
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 7 august 2012; Godkjent: 29 april 2013; Publisert: 31. mai 2013
Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av stiftelsen Natural Science of China (No. 81071910, 81070042). LncRNA microarray eksperimenter ble utført ved KangChen Bio-tech, Shanghai, Kina. MiRNA microarray eksperimenter ble utført av Genminix informatikk Ltd, Shanghai, Kina. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. LncRNA microarray eksperimenter ble utført ved KangChen Bio-tech, Shanghai, Kina. MiRNA microarray eksperimenter ble utført av Genminix informatikk Ltd, Shanghai, Kina. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Lungekreft er en av de vanligste kreft hos mennesker over hele verden og fortsetter å være assosiert med høyest forekomst og dødelighet av alle kreft [1], [2]. Ifølge WHO GLOBOCAN prosjektet, 1,6 millioner nye tilfeller av lungekreft, sto for 12,7% av verdens totale forekomsten av kreft, ble diagnostisert i 2008 [3]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for ca 85% av alle lungekreft tilfeller [4]. Den mest effektive terapi for NSCLC er fullført lunge reseksjon. Men overlevelsen etter fullstendig lunge reseksjon er langt fra tilfredsstillende, og de fleste pasientene tilbys kjemoterapi som et alternativ, spesielt cisplatin (CDDP; cis-diamminedichloroplatinum II) -baserte kjemoterapi
Cisplatin primært virker ved å forårsake DNA. skade [5]. Imidlertid er evnen av kreftceller til å bli resistente mot CDDP fortsatt en betydelig hindring for vellykket kjemoterapi. Tidligere studier har foreslått en rekke potensielle mekanismer for cisplatin motstand [6]. Men, det er en pågående behov for å finne de nøyaktige mekanismene som er involvert for å finne nye mål å hindre resistens.
Den raske utviklingen av molekylærbiologi gjør det mulig å oppdage molekylære forskjeller mellom ulike celler. Denne tilnærmingen kan gi viktige ledetråder om legemiddelresistens. Å forstå forholdet mellom cisplatin motstand og molekylære endringer vil bidra til å forutsi cisplatin motstand på forhånd og for å forbedre effektiviteten ved terapeutisk intervensjon.
humane transkriptomet omfatter et stort antall protein-kodende messenger RNA (mRNA), sammen med et stort sett med nonprotein koding transkripsjoner inkludert lange ikke-kodende RNA og mikroRNA som har strukturelle, regulatoriske, eller ukjente funksjoner [7], [8]. Lange kodende RNA (lncRNAs) som er preget av kompleksiteten og mangfoldet av sine sekvenser og virkningsmekanismer er forskjellige fra små RNA eller strukturelle RNA og er tenkt å fungere som enten primære eller skjøtes transkripsjoner [9]. Endrede lncRNA nivåer har vist seg å resultere i avvikende ekspresjon av genprodukter som kan bidra til forskjellige sykdomstilstander omfattende kreft [10], [11]. Imidlertid gjenstår det generelle patofysiologiske bidrag lncRNAs til cisplatin motstand i stor grad ukjent.
microRNAs (mirnas) er en familie av ~22nt små, ikke-koding, endogene, single-strandet RNA som regulerer genuttrykk. Moden mirnas og argonaute (siden) proteiner danner RNA-induced Slå kompleks (RISC), som formidler post-transcriptional gene silencing gjennom induksjon av mRNA degradering eller translasjonsforskning hemming [12]. Noen mirnas hadde blitt funnet spiller viktig rolle i cisplatin motstand [13], [14], men mer forskning er nødvendig for å utforske relasjonene mellom mirnas, lncRNAs og mRNA i kreft biologi prosessen.
Wnt /β -catenin kanoniske signalveien ble tidligere ansett som spiller en sentral roll i å bestemme celle skjebne [15]. Wnt svei er nå blitt funnet som skal endres i mange typer kreft [16]. Etter binding av Wnt til sin reseptor, Dishevelled proteiner (Dsh /dvl) blir aktivert, som fører til inaktivering av Axin /adenomatøs polypose coli (APC) /glykogen syntase kinase (GSK) 3β kompleks som hindrer degradering av β-catenin [ ,,,0],17]. Dette resulterer i stabiliserte β-catenin som blir translokert til kjernen, hvor det binder til medlemmer av T-celle-faktor /lymfoid enhancer-bindende faktor (TCF /LEF) familie av transkripsjonsfaktorer, og er i stand til å modulere ekspresjonen av et bredt spekter av målgener for å regulere celle skjebner.
Wnt-β-catenin veien [18] blir nøyaktig kontrollert av et antall regulatorer. Blant dem, omfatter det blotte skjellaget (NKD) familie Drosophila naken hårstråene og dens to virveldyr ortologer NKD1 og NKD2 har vist seg å ha negativ regulere kanonisk Wnt signalering ved binding til Dvl. Men om Wnt veien er involvert i cisplatin motstand eller regulering er fortsatt ukjent.
I denne studien ble lncRNA, miRNA og mRNA uttrykk profiler sammenlignet i villtype A549 og cisplatin motstand cellelinjer A549 /CDDP hjelp Gene Chip teknologi. En integrerende analyse som kombinerer endringer i de tre gruppene av RNA innenfor ulike genetiske nettverk ble brukt til å identifisere gener og stier som kan være relatert til cisplatin motstand i NSCLC. Eksperimenter med lncRNA AK126698 knockdown
Materialer og metoder
Cell kultur
adenokarsinom cellelinje Menneskelig lunge ble brukt til å observere dens innvirkning på de kanoniske Wnt sti og celle reaksjoner på cisplatin. A549 og cisplatin-resistent variant cellelinje A549 /CDDP ble kjøpt fra Peking Union Medical College, Beijing, Kina. A549 og A549 /CDDP-celler ble holdt i RPMI-1640-medium (Life Technologies) supplementert med 10% føtalt kalveserum (Gibco, Grand Island, NY, USA) i en fuktig atmosfære inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C . Den A549 /CDDP celle medium tillegg inneholdt 2 mg /l cisplatin for å opprettholde sin medikamentresistent fenotype. Celler i den logaritmiske vekstfase ble anvendt for alle forsøk.
LncRNA microarray
I korthet ble A549 og A549 /CDDP-celler anvendes for å syntetisere dobbeltkjedet komplementært DNA (cDNA). Dobbeltkjedet cDNA ble merket og hybridisert til 8 x 60 K LncRNA Expression Microarray (Arraystar, Rockville, MD). Den lncRNA uttrykk microarray brukt i denne studien klassifiserer i hovedsak sine sonder som følgende subtype: 1). Enhancer LncRNAs: Inneholder profilering data av alle LncRNAs med enhancer-lignende funksjon [19]. 2). Rinn lincRNAs: Inneholder profilering data av alle lincRNAs basert på John Rinn papirer [20], [21]. 3). HOX klynge: Inneholder profilering data av alle sonder i fire HOX loci, målretting 407 diskrete transkriberte regioner, lncRNAs og koding transkripsjoner [22]. 4). LincRNAs nærheten koding genet: Inneholder forskjellig uttrykt lincRNAs og nærliggende koding genpar (avstand 300 kB). 5). Enhancer LncRNAs nærheten koding genet: Inneholder forskjellig uttrykt forsterkerlignende LncRNAs og deres nærliggende gener (avstand 300 kb). Etter hybridisering og vasking ble behandlet lysbilder skannet med Agilent DNA microarray Scanner (delenummer G2505B). Agilent Feature Extraction (versjon 10.7.3.1) ble brukt til å analysere ervervede array-bilder. Quantile normalisering og påfølgende databehandling ble utført med hjelp av GeneSpring GX v11.5.1 programvarepakke (Agilent Technologies). Hver cellelinje utført lncRNA microarray i tre paralleller.
miRNA microarray
Microarray profilering for miRNA ble utført med Affymetrix Genechip miRNA arrays (Santa Clara, CA, USA) i henhold til produsentens anbefalte protokoll. Kort fortalt ble en mikrogram total RNA fra cellene merket med polyA polymerase bruke Genisphere FlashTag HSR kit følge produsentens anbefalinger (Genisphere, Hatfield, PA). RNA ble hybridisert til Affymetrix miRNA matrise som anbefalt av leverandøren. Standard Affymetrix rekke kassett farging, vasking og scanning ble utført ved hjelp av post-hybridisering kit (# 900720; Affymetrix) og Genechip Scanner 3000. Feature ekstraksjon ble utført med Affymetrix Command Console-programvaren. Rådata ble behandlet i følgende rekkefølge: bakgrunn påvisning ble etterfulgt av RMA global bakgrunn korrelasjon, quantile normalisering, median estimering og log2-transformasjon ved hjelp av miRNA QC verktøy (Affymetrix). Hver cellelinje utført miRNA microarray i triplikater.
In vitro-medikamentsensitivitet assay
Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 5 x 10
3 celler /brønn og inkubert over natten ved 37 ° C. Cellene ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin i 48 timer ved 37 ° C. Etter tilsetning av 20 ul av CellTiter 96R vandige oppløsning (Promega) til hver brønn, platene ble inkubert i 2,5 timer ved 37 ° C. Absorbansen av hver brønn ved 490 nm (A490) ble lest ved hjelp av et spektrofotometer. Konsentrasjonen ved hvilken hvert medikament produserte 50% inhibering av vekst (IC50) ble beregnet fra relative overlevelseskurver. Tre uavhengige eksperimenter ble utført i seks to brønner.
Realtime RT-PCR
Real-time RT-PCR ble brukt til å bekrefte differensial uttrykk av 16 gener som ble oppdaget av LncRNA Expression Microarray. CDNA ble syntetisert ved anvendelse av revers transkriptase (Takara), oligo (dT) primere med 1 ug RNA fra de samme prøvene som de som anvendes i mikromatrise. Primere som brukes er oppført i tabell S1. Hver real-time RT-PCR-reaksjon (i 20 mL) inneholdt 2,5 × SYBR Grønn Realtime PCR Master Mix (TIANGEN), 0,5 mikrometer primere og 0,5 mL av malen cDNA. Sykkel betingelser bestod av en innledende, én syklus av 2 min ved 94 ° C, etterfulgt av 40 sykluser på 15 sek ved 94 ° C, 20 s ved 63 ° C og 30 s ved 68 ° C. PCR-amplifikasjoner ble utført i tre duplikater for hver prøve. Genuttrykk nivåer ble kvantifisert i forhold til uttrykk av 18S bruker en optimalisert komparativ Ct (ΔΔCt) metoden. Forskjellene i genuttrykk nivåer mellom gruppene ble sammenliknet med t-test. P-verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
QRT-PCR av miRNA
Bulge-loop ™ miRNA QRT-PCR Primer Setter (en RT primer og et par qPCR primere for hver. angitt) spesifikk for MIR-17, MIR-21, MIR-138, MIR-194, og MIR-la-7i ble designet av RiboBio (Guangzhou, Kina). I korte trekk ble det totale RNA ekstrahert ved anvendelse av en MiRNeasy Mini Kit (QIAGEN). Den miRNA bule-loop ble revers transkribert med Quantscript RT Kit (TIANGEN). Hver real-time RT-PCR-reaksjon (i 25 mL) inneholdt 2 × SuperReal premiks (TIANGEN), 10 mikrometer primere, og en pl mal cDNA. Sykkel betingelser bestod av en innledende, én syklus på 3 minutter ved 95 ° C, etterfulgt av 40 sykluser på 10 sek ved 95 ° C, 20 s ved 60 ° C og 30 s ved 70 ° C. PCR-amplifikasjoner ble utført i tre duplikater for hver prøve. Den relative mengde av mirnas ble normalisert mot U6 snRNA, og folden endring for hver miRNA ble beregnet ved 2
-ΔΔCt metode. P-verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Små interfering RNA (siRNA)
For å estimere hemming av AK126698, 50 nM AK126698 siRNA (Shanghai Genepharma, Kina) ble transfektert inn i A549. celler ved hjelp Lipofectamine 2000 reagens i henhold til produsentens instruksjoner. Celler transfektert med transfeksjon middel og krafse-kontroll siRNA (negativ kontroll) ble anvendt som kontroller. Cellene ble høstet 48 timer etter transfeksjon. Fire par av siRNA ble kåret siRNA AK126698-291, siRNA AK126698-341, siRNA AK126698-424 og siRNA AK126698-1492 hhv. Sammenlignet med kontrollen, bare siRNA siRNA AK126698-291 og AK126698-424 kunne redusere uttrykket nivået av lncRNA AK126698. Sekvensene til AK126698 siRNA og krafse kontroll siRNA er oppført i Tabell S2.
Western blot-analyse
A549-celler ble sådd ut i 6-brønns plater (2 x 10
5-celler /brønn ). 48 timer etter transfeksjon av AK126698 siRNA eller negativ kontroll, ble cellene høstet og homogenisert med lyseringsbuffer. Totalt protein ble separert ved denaturering av 10% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese. Deteksjon ble utført med Odyssey system (Gene Company Limited, USA). De primære antistoffer for β-catenin, fosfor-β-catenin (Ser675) og β-aktin ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Cell Signaling Technology og Sigma-Aldrich, henholdsvis. De primære antistoffer for cellesyklus sti fosfo-cdc2 (Tyr15), fosfo-Rb (ser807), fosfo-Chk2 (Thr68) og fosfo-p53 (ser15) og for den MAPK signalveien fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) og fosfor-P44 /42 MAPK (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204) ble kjøpt fra Cellesignalering signale~~POS=TRUNC Technology. Antistoff fortynninger var 1:2000 for β-catenin, 1:1000 for fosfor-β-catenin, 1:1000 for fosfor-Rb (ser807), 1:1000 for fosfor-Chk2 (Thr68), 1:1000 for fosfor-cdc2 (Tyr15), 1:200 for fosfo-p53 (ser15), 1:200 for fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185), 1:200 for fosfo-P44 /42 MAPK (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204) og 1:5000 for β-aktin. Proteinnivåer ble normalisert til p-aktin og endringer ble bestemt.
flowcytometri
Celler ble sådd ut i 6-brønns plater (2 x 10
5 celler /brønn). 24 timer etter transfeksjon av siRNA AK126698 som beskrevet ovenfor, ble A549-celler behandlet med CDDP ved en sluttkonsentrasjon på 10 mg /l. 24 timer etter behandling med CDDP, flowcytometri ble anvendt for å detektere apoptose av de transfekterte A549-celler ved å bestemme den relative mengde av Annexin V-FITC-positiv-PI-negative celler.
Data Analysis
Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger. Numeriske data ble presentert som gjennomsnitt og standardfeil (± SEM). Forskjeller mellom midler ble analysert ved hjelp av Student t-test. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp SPSS11.0 programvare (Chicago, IL).
Betydelig Differential Gene Analysis.
Den tilfeldige variansen modellen (RVM) t-test ble brukt til å identifisere differensielt uttrykte gener for kontroll og eksperimentgruppen. Denne modellen har mer makt enn vanlige tester for å plukke opp store endringer i uttrykk, uten å øke frekvensen av falske positiver [23]. Etter en grundig analyse og falske funnrate (FDR) analyse, valgte vi de differensielt uttrykte gener i henhold til forhåndsdefinerte P-verdi terskler ( 0,05) [23], [24], [25]. Resultatene av forskjellig uttrykt gener ble utsatt for unsupervised hierarkisk clustering (Cluster 3.0) og Utforsker analyse (Stanford University, Stanford, CA, USA).
mikroRNA mål prediksjon.
Targets mRNA av miRNAs ble spådd basert på TargetScan (https://www.targetscan.org/) versjon 5.2. TargetScan spår biologiske mål av mirnas ved å søke etter tilstedeværelsen av konserverte 8MER og 7mer nettsteder som samsvarer frøet regionen hver miRNA [26]. Også identifisert er områder med uoverensstemmelser i frøet regionen som er kompensert av konservert 3 «sammenkobling [27]. I pattedyr, er spådommer rangeres basert på den antatte effekten av målretting som beregnes ved hjelp av kontekst + score til nettstedene justeringer [28], [29]. TargetScanHuman anser kamper for å kommentere menneske UTR og deres ortologer, som definert av UCSC hel-genom justeringer. Konservert målretting er også påvist innenfor åpne leserammer (ORF).
Pathway analyse.
Pathway analyse ble brukt for å identifisere viktige veier for differensial gener i henhold til Kyoto Encyclopedia of gener og genomer , Biocarta og Reatome databaser. Vi har også brukt Fishers eksakte og khikvadrattester å velge betydelige veier. Terskelen for signifikans ble definert av P-verdi og FDR. Anrikningen Re er gitt ved: (R
e = ENRICHMENT), der er antall differensial gener innenfor bestemt kategori, er det totale antall gener i den samme kategori, er antallet av differensial-gener i hele mikromatrise , og er det totale antall gener i mikromatrise [30], [31], [32].
GeneRelNet (koekspresjon nettverk).
Gene koekspresjon nettverk ble brukt til å identifisere genet interaksjoner [33]. Gene koekspresjon nettverk ble bygget i henhold til den normaliserte signalintensiteten av spesifikke uttrykk gener. For hvert par av gener, beregnet vi Pearson korrelasjonskoeffisient og velge signifikant korrelasjon par for å konstruere nettverk [34].
Innenfor nettverket analyse, graden av genet sentralitet definert som antall linker fra en node til en annen, ble anvendt for å bestemme den relative viktighet [35]. K-Kjernene ble anvendt for graf topologi analyse. K-kjernen i et nettverk var et delnettverk der alle nodene ble koblet til minst «k» andre gener i subnettet. Innenfor en protein-protein interaksjon, k-kjernenett vanligvis inneholder sammenhengende grupper av proteiner [35], [36].
Resultater
Microarray av A549 og A549 /CDDP cellelinjer
Først den cisplatin-motstanden av A549 /CDDP-cellelinjen ble identifisert ved å evaluere den IC50-verdi på A549 /CDDP mot vill A549-cellelinjen. Som vist i figur 1A, er IC50 for cisplatin for medikamentresistente A549 /CDDP-cellelinjen var 17,06 ± 0,68 mg /l som var 3,9 ganger høyere enn for villtype-A549-cellelinjen (4,36 ± 0,78 mg /l). Dette resultat viste at A549 /CDDP-celler var mer resistente overfor cisplatin, enn villtype-celler.
Celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av cisplatin (0,5 mg /l til 128 mg /l). 48 timer senere ble cellelevedyktigheten målt ved hjelp av MTS (A). Varme Kartene viser lncRNA (B), mRNA (C) og mirnas (D) profiler som skiller A549 /CDDP fra A549. Hver prøve ble analysert i triplikat. Både nedregulert (grønn) og oppregulert (rød) RNA ble identifisert i A549.
Så et gen chip studie ble utført i disse to cellelinjer for å undersøke mulige RNA uttrykk endringer i cisplatin motstand i lunge adenokarcinomceller bruker Arraystar sonde datasett som inkluderte 33,045 lncRNAs og 30,215 koding transkripsjoner. Hierarkisk clustering viste systematiske variasjoner i uttrykket av lncRNAs og protein-kodende RNA mellom de to cellelinjer (figur 1B og 1C). Sammenlignet med A549-cellelinjen, 725 sonder av lncRNAs øket og 655 prober ble redusert i A549 /CDDP-cellelinjen. I tillegg ble 625 mRNA differensial probe øker og 846 mRNA probe nedgang funnet i A549 /CDDP cellelinje.
For å undersøke om mikroRNA uttrykket ble endret i cisplatin resistente celler, ble miRNA uttrykk profiler vurdert ved hjelp av Affymetrix miRNA genet chip som inneholdt 1,105 pre-mirnas og 1,105 modne-mirnas sonder. For ytterligere analyse har vi fokusert på modne-miRNAs. Resultatene viste at i A549 /CDDP-celler, 16 mirnas downregulated og 9 mirnas oppregulert i sammenligning med A549-cellelinjen (P 0,05; figur 1D). Microarray data omtalt i denne artikkelen har blitt deponert i National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO), og er tilgjengelig gjennom (GEO) Series tiltredelse antall GSE43494 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /geo/query/acc.cgi?acc=GSE43494).
Validering av microarray data ved hjelp av qPCR
for å validere microarray analyse funn, uttrykket nivået av 8 mRNA som er tenkt å spiller en viktig rolle i legemiddelresistens og 8 lncRNAs som hadde korrelasjoner med forutgående mRNA blant differensial uttrykk RNA, ble analysert ved hjelp av kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR). For lncRNA, viste resultatene at AK123263, CES1P1-001, RP3-508I15.14, AK126698, TP53TG1, og AC090952.4.1 redusert, mens uc003bgl.1 og NCRNA00210 økt i A549 /CDDP (alle P 0,05, figur 2A) . For mRNA ekspresjon av BMP4, CTSB, NKD2, BAG1, TGFB1, EGFR, juni og CUL2 viste statistisk signifikante forskjeller mellom de to cellelinjer (P 0,05; figur 2B). Alle QRT-PCR resultatene ovenfor var i samsvar med microarray. Disse resultater indikerer at et sett av lncRNAs og mRNA blir avvikende uttrykt i cisplatin motstandscellelinjer.
Den relative mengde av hvert mRNA (A) og lncRNA (B) var normalisert til 18S rRNA, og hver miRNA (C ) ble normalisert til U6 snRNA. Data i histogrammet er midler ± SD, * P 0,05, ** P 0,01, *** p 0,001 sammenlignet med A549 (t-test)
5 mirnas blant dem filtrert ble validert til. være vesentlig forskjellig mellom cisplatin resistente cellelinje A549 /CDDP og foreldre A549 cellelinje (P 0,05). Som vist i (figur 2C), nivåene av MIR-17, MIR-21, og MIR-la-7i ble nedregulert i A549 heller enn A549 /CDDP, mens MIR-138 og Mir-194 uttrykk var opp- regulert. Dette funnet er i samsvar med resultatene av microarray hybridisering.
Mikromatrise-basert pathway analyse
Betydelige veier av differensial gener ble sammenlignet med KEGG database for å spesifisere og identifisere mål mRNA mellom 1471 identifisert gener. Disse genene er vist i figur 3A og 3B. Den høye berikelse trasé målrettet av overuttrykt mRNA var involvert i aminoacyl-tRNA biosyntese, DNA replikasjon og protein behandling i endoplasmatisk retikulum. I motsetning til store veier som tilsvarer underexpressed mRNA ut til å være ansvarlig for legemiddelmetabolisme, antigen prosessering og presentasjon og cytokin-cytokin reseptor interaksjoner. Blant disse, de maksimale-beriket-trasé knyttet til spredning og legemiddelmetabolisme foreslo en rolle i cisplatin motstand.
signalveier av forskjellig uttrykt oppregulert mRNA (A) og downregulated mRNA (B). Western blot-analyse av MAPK-reaksjonsveien (C) og cellesyklusveien (D) -nivåer hos A549-celler og A549 /CDDP-celler. P-P44 /42 MAPK, fosfor-P44 /42 MAPK; P-SAPK /JNK, fosfor-SAPK /JNK; P-cdc2, fosfor-cdc2; P-Rb, fosfor-Rb; P-chk2, fosfor-chk2; P-p53, fosfor-p53. Signalveier på kryss mellom forskjellig uttrykt mRNA og spådd målgener fra ulikt uttrykt oppregulert mRNA (E) og downregulated mRNA (F). Pathway analyse ble hovedsakelig basert på KEGG database. P-verdier 0,05 hjelp av tosidig Fishers eksakte test ble klassifisert som å være statistisk signifikant. Den vertikale aksen representerer veien kategori og den horisontale aksen representerer -log10 (p-verdi) av disse viktige veier.
Cellesyklus og MAPK signalveien ble valgte å kontrollere riktigheten av de sti analyseresultater . Sammenlignet med A549 celler, de viktigste faktorene i Cellesyklus fosfor-cdc2 (Tyr15) og fosfor-Rb (ser807 /811) økte i proteinnivå i A549 /CDDP celler representerer oppregulering av Cell syklus sti. Den reduserte av cdc2 negativ regulator fosfor-Chk2 (Thr68) og fosfor-p53 (ser15) forsterket dette resultatet. Også, fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) og fosfo-P44 /42 MAPK (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204), som er de viktigste faktorer av MAPK-signalreaksjonsveien, redusert i A549 /CDDP-cellelinjen. Og disse resultatene oppført i Figur 3C og 3D.
målet mRNA for forskjellig uttrykt mirnas ble beregnet med TargetScan (https://www.targetscan.org/) og ble observert 7,814 relasjonene mellom dem (tabell S3) . Skjæringspunktet satt for de antatte målet mRNA og forskjellig uttrykt mRNA nevnt ovenfor ble valgt. 497 relasjoner igjen etter dette trinnet, som vist i tabell S4. Betydelige trasé for disse genene (P 0,05) antas å være regulert av mirnas henhold til KEGG databasen ble analysert (figur 3E og 3F). De betydelige trasé inkludert Wnt signalveien, transcriptional misregulation i kreft og insulinsignalveier.
Vi siles ut 21 forskjellig uttrykt mRNA i cisplatin motstand celler (tabell S5) som var negativt korrelert og eventuelt regulert av miRNAs. Disse mRNA var involvert i 11 av de banene som var tenkt å spille viktig rolle i cisplatin motstand.
Etablering av genet co-uttrykk nettverk
Pearson korrelasjonskoeffisienter ble estimert for hvert gen og betydelig korrelasjons parene ble fusjonert med mirnas å undersøke lncRNA, miRNA og mRNA co-uttrykk. Nettverksanalyse ble gjennomført for å undersøke hvilke gen eller gener spilt en sentral rolle i cisplatin motstand (figur 4). Gene nettverk ble konstruert av funksjonelle genet foreninger, og er beskrevet i detalj i tabell S6. mRNA som samhandler med både lncRNAs og mirnas ble vektlagt med gul farge. I nettverksdiagrammer, sykkel nodene representerer gener, og kantene mellom to noder representerer samspillet mellom gener kvantifiseres etter grad. Grader i nettverket beskrive antall enkelt gener som regulerer andre gener og representerer størrelsen av syklusen noden. Jo høyere grad, er det mer sentrale genet i nettverket. Kantene mellom to noder ble koblet sammen med ulike mekanismer. LncRNA-mRNA ble spådd av korrelasjonsanalyse for å miste av effektiv forklaring i dag. miRNA-mRNA ble spådd av TargetScan som er den mest brukte metoden for høy gjennomstrømming mikroRNA data mål prediksjon. mRNA-mRNA ble fastsatt basert på KEGG for mange mRNA relasjoner hadde blitt samlet her. LncRNA-lncRNA og miRNA-miRNA ble ikke viste for de er meningsløse. LncRNA-miRNA kan ikke beregnes begrenset av database og teknikk.
LncRNA-miRNA-mRNA-Nettverk av A549 (A) og A549 /CDDP (B). Blå representerer nedregulering og oransje representerer opp regulering. Box nodene representerer mikroRNA, sirkel nodene representerer mRNA, og sekskant nodene representerer lncRNA. Sorte kanter beskrive den mulige sammenhengen mellom lncRNA og mRNA, grønne kanter beskrive hemmende effekt av mikroRNA på mRNA, og røde kanter representerer forholdet mellom mRNA og mRNA.
Clustering koeffisienter ble brukt for å estimere kompleksitet av interaksjoner mellom gener nabo kjernen genet, med unntak av kjerne-genet deltakelse. Jo lavere clustering koeffisient, jo mer uavhengig av kjerne genene var i form av samspill mellom gener i nabo kjerner [35]. Resultatene viste at mange gener som FN1, CTSB, EGFR, og TGFB1; lncRNAs inkludert BX648420, ENST00000366408, og ENST00000404247; og mirnas som MIR-26a og la 7i potensielt spilt en sentral rolle i nettverket. I subnettet ble mange isolerte mRNA knyttet til Wnt signalveien. De var kandidater for de kan ha en betydelig rolle i cisplatin motstand regulert av lncRNAs.
Nettverket analyseresultater antydet at mRNA kan være co-regulert av ulike lncRNAs sammen med ulike miRNAs. For eksempel kan BAG1 reguleres ved 3 mirnas og 3 lncRNAs på samme tid. Dette fenomenet kan forklare hvorfor noen mRNA spådd som potensielle mirnas mål ikke endret med motsatt retning av den tilsvarende miRNAs.
Konckdown av AK126698 aktivert kanoniske Wnt signalveien og induserte cisplatin motstand i A549-cellelinje
den ovenfor veien analyser har vist at Wnt signalveien og mange isolerte medlemmer av det oppført i relativ isolert nettverk ble vesentlig endret i A549 /CDDP cellelinje. Disse resultatene antydet oss at Wnt signalveien var involvert i NSCLC chemoresistance. Utover det, var nivået på AK126698 nært korrelert med mange medlemmer av Wnt veien (som vist i tabell S7). Dermed ble rollen lncRNA AK126698 i regulering av Wnt signalveien utforsket. Transfeksjon siRNA AK126698-424 og siRNA AK126698-291 i A549-celler resulterte i reduksjon av NKD2 mRNA-ekspresjon som er en negativ regulator av Wnt signalveien (fig. 5A). I mellomtiden, nøkkelen transkripsjonsfaktor i kanonisk Wnt pathway β-catenin ble også økt i proteinnivå etter AK126698 knockdown. Proteininnholdet av fosfo-β-catenin (Ser675), som representerer den β-catenin translokasjon, øket etter behandling av siRNA AK126698. Disse funnene antydet at siRNA AK126698 aktivert kanoniske Wnt /β-catenin signalveien (figur 5B). På samme tid, ble effekten av knockdown AK126698-424 og siRNA AK126698-291 på A549-celle apoptose observeres ved hjelp av annexin-V /PI assay.
