Abstract
Bakgrunn
Electrotaxis er bevegelse av heft levende celler som respons på en likestrøm (DC) elektrisk felt (EF) av fysiologisk styrke. Meget metastatisk humane lungekreftceller, CL1-5, vise retnings migrasjon og orientering i henhold dcEFs. For å forstå transcriptional responsen av CL1-5 celler til en DCEF, ble utført microarray analyse i denne studien.
metodikk /hovedfunnene
En stor elektrisk-felt chip (LEFC) ble utformet, fremstille, og anvendt i denne studien. CL1-5-celler ble behandlet med den EF styrken av 0mV /mm (kontrollgruppen) og 300 mV /mm (EF-la-behandlede gruppe) i to timer. Signalveier som involverer gener som uttrykkes forskjellig mellom de to gruppene ble avslørt. Det ble vist at EF-regulerte gener sterkt korrelert til adherens veikryss, telomerase RNA komponent genregulering, og stram veikryss. Noen oppregulert gener som
ACVR1B Hotell og
CTTN
, og noen ned-regulerte gener som
PTEN
, er kjent for å være positivt og negativt korrelert til celle migrasjon hhv. De protein-protein interaksjoner av adherens koplings-assosierte EF-regulerte gener antydet at blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) reseptorer og Efrin reseptorer kan delta i avføle ekstracellulære elektriske stimuli. Vi har videre observert en høy prosentandel av vesentlig regulerte gener som koder for cellemembranproteiner, noe som tyder på at DCEF kan direkte å påvirke aktiviteten av cellemembranproteiner i signaltransduksjon.
Konklusjoner /Betydningen
I denne studien noen av de EF-regulerte gener har blitt rapportert til å være avgjørende, mens andre er nye for electrotaxis. Vårt resultat bekrefter at reguleringen av genuttrykk er involvert i mekanismen electrotactic respons
Citation. Huang CW, Chen HY, Yen MH, Chen JJW, Young TH, Cheng JY (2011) Gene Expression of Human Lung Cancer Cell linje CL1-5 svar på en Direct Current Electric Field. PLoS ONE 6 (10): e25928. doi: 10,1371 /journal.pone.0025928
Redaktør: Eshel Ben-Jacob, Tel Aviv University, Israel
mottatt: 16 februar 2011; Godkjent: 13 september 2011; Publisert: 05.10.2011
Copyright: © 2011 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er delvis finansiert av National Science Council of Taiwan (https://web1.nsc.gov.tw/) (kontrakt nr. 98-2113-M-001-013-MY2 og 100-2113-M-001 -014 -MY3 ). Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Electrotaxis, også kjent som galvanotaxis, er bevegelse av organismer eller celler som respons på et elektrisk felt (EF). Fysiologisk EF eksisterer ekstracellulært, for eksempel i sår, embryo hud, og kanaler [1], [2]. Det kan også forekomme i grenseflaten mellom tumor og normalt vev [3], [4]. Flere typer av kreftceller, slik som prostata kreftceller, bryst-kreftceller, og lungekreftceller, er kjent for å migrere retnings henhold DCEF, og graden av electrotaxis av disse kreftceller har vist seg å korrelere til de metastatiske egenskaper [5] – [8]. Levende celle electrotaxis er forskjellig fra celle elektroforese siden sistnevnte krever løsgjøring av dyrkede celler fra substratet på forhånd [9]. I tillegg er EF styrke for elektroforese-celle omtrent 100 ganger høyere enn det for electrotaxis [9]. Dessuten har det vist seg at retnings migrering av cellene ble forårsaket av EFs men ikke EF-induserte hendelser som elektro-osmotisk strømmer [10].
Mekanismen electrotaxis er blitt undersøkt for mer enn 10 år. Flere viktige proteiner og gener er rapportert å være involvert. Det er kjent at fysiologisk EF omfordeler epidermale vekstfaktorreseptorer (EGFRs), som fører til katodisk polarisering og aktivering av EGFR-mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) signalveien [11], [12]. EGFR-signalering er nødvendig for EF-dirigert vandring av brystkreftceller [6]. Dessuten syklisk AMP (cAMP) og cAMP-avhengig protein kinase A megle retnings migrering av humane keratinocytter i en DCEF [13], [14]. Beta-4-integrin sammen med epidermal vekstfaktor (EGF) også medierer de electrotaxis av humane keratinocytter gjennom en Rac-avhengig signalveien [15]. Elektriske signaler kontroll sårtilheling gjennom phosphatidylinositol-3-OH kinase (PI3K) -γ og fosfatase og tensin homolog (PTEN) [16]. EF stimulering utløser aktiveringen av Src og inositol-fosfolipid signalering, som polariserer i retning av epiteliale cellevandring [16]. I
Xenopus
embryonale spinal nevroner, GTPases Cdc42, Rac og Rho megle vekst kjegle styring i en fysiologisk EF gjennom tid og rom regulering av GTPase aktivitet og deres effektorer [17], [18]. EF-ledet migrering av rotte-hippocampus-neuroner medieres ved aktivering av Rho-assosiert proteinkinase (ROCK) og PI3K [19]. I tillegg er retningen av den EF-indusert migrering av
Dictyostelium
celler er slått av cGMP og fosfatidylinositol signalering [20]. Det er også rapportert at kalsiumionene spiller viktige roller i den styrte vandring av
Dictyostelium
celler og osteoblastlignende celler [21], [22], som tyder på at kalsium signalveien kan delta i electrotaxis.
de fleste studier som utforsker mekanisme electrotaxis er fokusert på spesifikke gener, proteiner og signalveier. Den globale genekspresjon profilering kan være en tilnærming for å avdekke hele riss av mekanismen. DNA microarray er en velkjent teknologi for genome-wide genuttrykk profilering. Nylig har utført den microarray analyse for electrotaxis studie i menneskelig dermale fibroblaster og epidermale keratinocytter [23], [24]. I humane dermale fibroblaster blir EF-regulerte gener assosiert med cellulære signalveier inkludert TGF-β, G-proteiner, og inhibering av apoptose [23]. I human epidermal keratinocytter, er EF-regulerte gener vist å korrelere med kjemokin, apoptose, JAK-STAT, Wnt, og G-protein MAPK aktiveringssignalveier [24]. Så langt er det ingen forskningsarbeid diskutere den globale virkning av EF på genekspresjon av kreftceller.
tumorcelleinvasjon og metastase er de viktigste årsaker resulterer i høy dødelighet av lungekreftpasienter på fem år. Invasion er den mest kritiske trinn i metastatisk prosess og det skjer gjennom samspillet mellom kreftceller og omkringliggende miljø. Humane lunge adenokarsinomceller, CL1-5, som er en underlinje avledet fra CL1-0, har høyere invasivitet enn CL1-0 [25]. I vår tidligere studie har vi vist at CL1-5 celler migrerer mot anoden og orientere vinkelrett på retningen av DCEF. I kontrast, gjorde CL1-0 ikke vise åpen electrotactic svar [8]. Ettersom den positive korrelasjon mellom metastatiske egenskaper og den electrotactic responsen har blitt observert i nivået av celle bevegelse, er det viktig å ytterligere undersøke innflytelsen av fysiologisk EF på genekspresjon. I dette arbeidet, ble de svært metastatiske CL1-5 celler undersøkt ved hjelp av DNA microarray. Gjennom analyse av EF-regulerte gener og tilhørende signalveier, kan vi forstå mer om rollen til fysiologiske EF i tumormetastaser.
For electrotaxis studien, har vi designet og fabrikkert en microfluidic elektrisk-felt brikke (EFC) som tilveiebringer ensartet DCEF i cellekulturmikrokammeret [8]. Tykkelsen av mikrokammeret er bare 70 um og dermed joule varme kan utelates [8]. Begrensningen til efc er at cellekulturen regionen er for liten til å gi nok celler for mikromatriseanalyse i engangs eksperiment. Derfor en stor elektrisk felt chip (LEFC) gir uniform DCEF er designet og fabrikkert i dette arbeidet for prøvetaking (Figur 1).
LEFC hadde kobler hull for mediet innløp /utløp og agar salt broer. Celler ble dyrket i mikrokammeret (cellekulturen region). Den bredde, lengde og tykkelse av mikro-kammer var 24mm, 75mm, og 70 mikrometer, henholdsvis.
Resultater
LEFC og EF stimulering
Å bygge opp en EF med styrken på 300 mV /mm i cellekultur-regionen, ble strømflyten av 696 uA innført i LEFC ved å påføre spenning på omtrent 21 V på elektrodene (figur 2). Den elektriske effektforbruket i cellekultur regionen ble anslått til å være P = IV = 15.7mW (696 uA × 75mm × 300 mV /mm). Det var forventet at joule-varme kan utelates med en slik lav elektrisk strøm. Den numeriske simulering av DCEF viste en jevn fordeling i cellekultur-regionen (figur 3). Mer enn 85% kultur region ble eksponert i EF fasthet på 300 +/- 15 mV /mm.
A LEFC var integrert med en gjennomsiktig ITO varmeapparat chip, to Ag /AgCl elektroder med fosfat-bufret saltvann (PBS ) som elektrolytt, to agar salt broer (1,5% agar i PBS), en sprøyte pumpe, en DC strømforsyning, en ampere-meter, og en invertert mikroskop.
EF styrke langs den stiplede linjen (mellom de to piler) ble vist. Mer enn 85% kultur område ble utsatt for EF styrke på 300 +/- 15 mV /mm.
I microarray analyse, er 20-30 mikrogram total RNA som kreves for en Genechip, noe som betyr at om lag 10
6 CL1-5 celler er nødvendig for hver replikere. Den cellekultur-regionen til en LEFC er 75 x 24 mm
2, omtrent 40 ganger større enn den for en EFC (3 x 15 mm
2). Det ble testet som CL1-5 celler høstet fra en LEFC kunne nå 10
6 celler per brikke. Med andre ord, kunne en LEFC tilveiebringe tilstrekkelig mengde av total RNA for en microarray eksperiment.
signalveien analyse
Gjennom ANOVA-testen, 1631 probe sett av Affymetrix HG-U133 plus2.0 Array det ble identifisert med statistisk differensialuttrykk mellom kontrollgruppen og den EF-behandlede gruppen (p 0,05). Blant disse 431-probe-sett hadde alle signalintensitetene av de to grupper som er større enn den globale median intensiteten av de seks arrays (= 66,5, fra signalintensitetene av 54675 sonden setter x 3 replikater x 2 grupper). Den 431-probe-sett ble vurdert i signalveien analyse. Tiltredelses antall av disse sonde settene ble sendt til CRSD nettside, der genom-wide iterativ berikelse analyse ble utført. De tre beste signalveier som viser signifikant korrelasjon til EF-regulerte gener ble adherens veikryss, telomerase RNA komponent genet
hTerc
transkripsjon regulering, og tett kobling (tabell 1).
subcellulære lokalisering og biologisk funksjon analyse
EF-regulerte gener ble kategorisert basert på den subcellulære plasseringen av sine protein produkter. Proteinet database Swiss-Prot og Ensembl ble henvist til. Hvis et protein ble plassert i «cellemembran» som er vist i Swiss-Prot, eller den inneholdt «signalpeptid og transmembrandomene» som er vist i Ensembl, det ble kategorisert som en cellemembranprotein i denne studien. Basert på definisjonen, ble 6545 probe sett av HG-U133 Plus2.0 rekke anses å representere gener som koder for cellemembranproteiner. Her undersøkte vi betydelig regulerte gener med brette endring som er større enn 1,5 eller mindre enn 1 /1,5 (EF-la-behandlede gruppen /kontrollgruppen). Blant 88 gener som møtte kriteriene ble 18 gener anerkjent for å kode cellemembranen protein. Prosentandelen er 18,2% (= 16/88). Til sammenligning vi tilfeldig valgt 88 sondesett fra sonden sett av HG-U133 plus2.0 matrise (unntatt sonde sett av kontrollsekvenser) og undersøkt hvor mange prosent av gener som koder for cellemembranprotein. Den gjennomsnittlige prosentandelen fra 10 000 drift er 12%.
Kategoriseringen av de 88 betydelig regulerte gener ble vist i tabell 2 (oppregulert) og tabell 3 (nedregulert). Bortsett fra de gener som koder for cellemembranproteiner, andre ble kategorisert basert på «cellulære komponent» i Swiss-Prot. I tillegg ble de genene som er oppført i tabell 2 og tabell 3 analysert med deres biologiske funksjon i henhold til den Gene Ontologi kommentaren (figur 4). Den microarray analyse Resultatet ble delvis validert ved real-time RT-PCR. De 20 utvalgte gener viste positiv korrelasjon mellom real-time RT-PCR og microarray analysen resulterer i deres uttrykk endring (tabell 2 og 3).
betydelig regulert gener oppført i Tabell 2 (oppregulert) og tabell 3 (ned-regulert) ble kategorisert med sin biologiske funksjon i henhold til Gene ontologi merknader.
Gene uttrykk av rapporterte electrotaxis relaterte gener /proteiner
Vi har også undersøkt microarray analyseresultatene av gener som har blitt rapportert å være korrelert til electrotaxis. Blant de 1631 sondesett identifisert ved ANOVA, de som har alle intensiteter over bakgrunnsnivået (det vil si større enn den globale median) i minst en av de to gruppene ble vurdert. Uttrykket av electrotaxis relaterte gener /proteiner ble diskutert under.
Diskusjoner
EF stimulering
Under EF styrke 300mV /mm, vår tidligere arbeid har vist at CL1 -5-celler har en betydelig tendens til retnings migrasjon og orientering mens CL1-0 celler bevege seg tilfeldig [8]. CL1-5 celler presenterer en tilnærmet konstant bevegelse mot anoden umiddelbart etter at DCEF er slått på. Imidlertid er orienteringen av CL1-5 cellene ikke tydelig før 2-timers eksponering i DCEF. De forskjellige responstiden til EF-la-induserte retnings migrering og celle legeme orienteringen av CL1-5 celler tyder på involvering av forskjellige signalveier i electrotaxis. Dette synspunktet er også foreslått i en fersk arbeid av Hammerick et al [26].
Det antas at genuttrykk endring assosiere med de to electrotactic responser, retnings migrasjon og orientering, kan alle bli oppdaget etter 2 timers behandling av DCEF. Derfor, i denne studien ble utført i mikromatriseanalyse for CL1-5 celler stimulert med 300 mV /mm i 2 timer. Resultatene viste at flere gener var betydelig regulert. Tatt i betraktning den høye kostnaden for DNA mikromatriseanalyse (ca US $ 1000 x 3 x 2 replikater grupper for hvert tidspunkt) startet vi ved å velge den tidsperioden på 2 timer i denne første studie. For ytterligere å skille hvis det regulerte genet ble korrelert til retnings migrasjon eller orientering, microarray analyse av kortsiktig EF stimulering (kanskje 10mins) vil bli fulgt opp i det videre arbeidet.
I denne studien, cellekulturmedium ble erstattet med serumfritt DMEM-medium før den DCEF ble påført. Serum er en kompleksforbindelse som inneholder forskjellige proteiner som vekstfaktorer, cytokiner, og festefaktorer. Under en anvendt DCEF i cellekulturkammer, kan kjemisk gradient av disse proteinene bli generert ved elektroforese. Derfor kan responsen av celler under DCEF bli påvirket av kjemotaksis. For å minimere mulige virkninger av den kjemiske gradient ved å undersøke innflytelsen av DCEF på cellene, ble serumet fjernet på forhånd. Vårt tidligere arbeid har vist at DCEF induserer retnings migrasjon og orienteringen av CL1-5-celler i serumfritt medium [8]. Resultatene tyder på at DCEF kan indusere electrotactic responsen av levende celler uten kjemisk stimulering. Noen forskjellige typer celler viser også electrotactic respons i serumfritt medium, så som neural crest celler, hippokampale neuroner, og CHO-celler [27] – [29]
Ikke desto mindre er cellene omgitt av en rekke av. vekstfaktorer og cytokiner
in vivo
som også kan spille roller i electrotaxis celler. I vår tidligere studie har CL1-5 celler blitt observert å migrere mot anoden både i serumfritt [8] og i serum-inneholdende (film S1) medium under et påført DCEF. Det er et viktig videre arbeidet for å sammenligne den EF-regulert genekspresjon i serumholdig medium, og at det i serumfritt medium. Den samtidige virkning av EF og den kjemiske gradient kan således bli undersøkt. Slikt arbeid kan hjelpe oss å finne ut av kandidat vekstfaktorer og cytokiner som deltar i mekanismen electrotaxis.
signalveien analyse
Under behandlingen av DCEF, observerte vi differensial regulering av seks gener som var kjent for å være involvert i adherens krysset veien (hsa04520, KEGG) (tabell 1). Fire gener
ACVR1B product: (1.51-fold),
FYN plakater (1,21 ganger),
WASF3 plakater (1,2 ganger), og
ACP1 product: ( 1.18-fold) ble vist å være oppregulert.
ACVR1B product: (A aktivin reseptor, type IB) koder for et type I aktivin reseptor, som er et transmembran serin /treonin-kinase-reseptor, og er essensiell for signalering. Aktivin reseptor-signalisering regulerer prostate epitelial celle adhesjon og er forbundet med prostata cancer metastase [30] i. Proteinet tyrosin kinase Fyn (kodet av
FYN, Fyn
onkogen relatert til
SRC
,
FGR
,
JA
) er et medlem av Src -familie kinaser som er viktige i integrin-mediert celle adhesjon og migrering [31]. Aktivering av Fyn fremmer migrasjon av plateepitel carcinom-celler [32].
WASF3 plakater (WAS protein familie, medlem 3), også kjent som
WAVE3
, koder for et protein medlem av WAVE familien som formidler aktin omorganisering og celle bevegelse. Det har blitt rapportert at WAVE3, som er regulert nedstrøms PI3K, konsentrerer i lamellipodia i forkant og formidler celle migrasjon og lamellipodia formasjon [33].
uttrykk for
PVRL1 product: ( 1 /1.97-fold) og
ACTG1 product: (1 /1.05-fold) ble vist å være undertrykt av den anvendte DCEF.
PVRL1 plakater (poliovirus reseptor-relaterte 1), også kalt
nectin-en
, koder for et kalsium-uavhengig celle-celle adhesjon protein. Nectin-1 spiller en rolle i organiseringen av adherens knutepunktene i epitel og endotelceller [34], [35].
ACTG1 plakater (Actin, gamma 1) koder for et cytoplasmatiske aktin funnet i nonmuscle celler. Actins er vel kjent å være involvert i forskjellige typer av celle motilitet, og vedlikehold av cytoskjelettet. Den påførte DCEF forbedret uttrykk for
ACVR1B
,
FYN
, og
WASF3
, som kan i sin tur øke migrasjon av CL1-5. Det ble foreslått at EF-redusert heft (
PVRL1
↓) bidro til økt bevegelighet. Undertrykkelse av
ATCG1
var mindre i forhold til endring av andre gener. Det har vist seg at migreringshastigheten CL1-5 forsterkes ved å bruke en DCEF til cellekulturen region [8].
Vi ytterligere undersøkt forholdet mellom proteinproduktene av disse seks gener. Den analytiske verktøy MetaCore (GeneGo) ble brukt til å bygge opp nettverk av direkte eller indirekte protein-protein interaksjon. Interaksjonene og den subcellulære lokalisering av proteinene er vist i figur 5. Det ble observert at Fyn, ACP1, og c-Src ha direkte interaksjon med to typer reseptorer, blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) reseptorer og Efrin reseptorer [36 ] – [43].
C-Src
ble vist å være 1,3 ganger oppregulert ved DCEF i denne studien. PDGF-reseptorer har blitt implisert å bli aktivert av fysiske krefter som endrer konformasjonen til reseptoren [44]. Nettverkene antydet at PDGF-reseptorer kan bli stimulert av DCEF og deretter aktivert Fyn, c-Src og c-Abl, som påvirkes aktivering av WAVE3 [45] – [47]. Den aktiverte WAVE3 senere regulert omorganiseringen av aktin cytoskjelettet og dermed påvirket cellen morfologi og motilitet [48]. Resultatene også antydet at Efrin-A-reseptorer og Efrin-B-reseptorer kan spille roller i å konvertere det elektriske stimuli i biologiske signaler. Imidlertid genekspresjon endringen ble ikke observert i PDGF-reseptorer, Efrin reseptorer, og c-Abl i denne studien. Ekspresjonsnivået og rollen til disse proteinene i electrotaxis må undersøkes nærmere.
Diagrammet viser at den EF oppregulert Fyn, ACP1, og c-Src kan interagere direkte med to typer membranreseptorer, PDGF reseptorer og Efrin reseptorer. Grønn pil: positiv effekt; Rød pil: negativ effekt; grå pil. uspesifisert effekt
Flere EF-regulerte gener ble involvert i transkripsjonsregulering av telomerase RNA komponent genet
hTerc plakater (h_terc, BioCarta), som koder for RNA-komponenten av menneskelig telomerase. RNA-komponenten fungerer som en mal for telomere gjenta [49]. Gjennom behandling av EF, observerte vi at
NFYA plakater (Nuclear transkripsjonsfaktor Y, alfa) og
NFYC plakater (Nuclear transkripsjonsfaktor Y, gamma) ble nedregulert med 1 /1.16- fold og 1 /1,27 ganger, henholdsvis.
NFYA Hotell og
NFYC
kode to subenheter av en trimere kompleks NF-Y protein, som er en aktivator av
hTerc
genet. Den nedregulering av
NFYA Hotell og
NFYC
antydet at uttrykket av
hTerc
kan reduseres på grunn av den påførte DCEF. Siden det er ingen sonde satt for
hTerc
genet i HG-U133 Plus 2.0 array, ble uttrykket av dette genet ikke vist på microarray resultat.
Anvendelsen av DCEF å CL1 -5 celler også forandret uttrykket av viktige gener som er involvert i den stramme krysset veien (hsa04530, KEGG). Fire korrelerte gener
F11R plakater (1,52 ganger),
CTTN product: (1.51-fold),
RAB13 plakater (1,25 ganger), og
EPB41
(1,23-ganger) ble vist å være oppregulert.
F11R
genet (F11 reseptor), også kalt kryss adhesjonsmolekyl-A (JAM-A), er en viktig regulator av tight junction montering og celle migrasjon [50].
CTTN
genet (Cortactin) koder for et protein cortactin som regulerer samspillet mellom komponentene i tilhenger-type veikryss. Det organiserer cytoskjelettet og celleadhesjonsprosesser strukturer av epitel og carcinoma celler. Mange studier har dokumentert en rolle for cortactin i å fremme cellemotilitet og kreft invasjonen [51].
RAB13
genet (medlems RAS onkogen familie) koder en av de små guanosine triphosphatases (GTPases) av RAB underfamilien, som er kjent for å lokalisere den stramme veikryss. Dette proteinet har vist seg å spille en avgjørende rolle i å regulere både i struktur og funksjon av tett veikryss i polarisert epitel-celler [52]. Rab13 protein er også vist å bli aktivert i løpet av epitelial celle spredning-prosessen som omfatter de første trinnene av carcinoma invasjon /metastasering [53]. Genet
EPB41 plakater (Erythrocyte membranproteinbåndet 4,1) koder en av de 4.1 proteiner som kalles 4.1R. De 4,1 familie proteiner er komponenter av kortikale cytoskjelettet underliggende cellemembranen. De bidrar til organiseringen av cellen polaritet, adhesjon og motilitet. De påvirker også transport gjennom membranen og respons på vekstfaktorer [54]. På den annen side,
PTEN product: (1 /1.19-fold) og
ACTG1 product: (1 /1.05-fold) viste seg å være nedregulert.
PTEN
er identifisert som en tumor suppressor og koder for et fosfatidylinositol-3,4,5-trisphosphate 3 (ptdins (3,4,5) P3) – fosfatase. PTEN ned-regulerer intracellulære nivåer av ptdins (3,4,5) P3 og således negativt regulerer PI3K /Akt pathway. Under den påførte DCEF, ptdins (3,4,5) P3 ble rapportert å være polarisert i forkant av differensierte HL60 celler migrerer mot katoden [16]. Det er kjent at PTEN hemmer cellemigrasjon, spredning, og fokale sammenvoksninger [55]. I korte trekk,
F11R
,
CTTN
,
RAB13
,
EPB41
,
PTEN Hotell og
ACTG1
var kjent for å formidle cellemotilitet og /eller cytoskjelettet organisasjon, noe som tyder på at de kan spille roller i electrotactic responsen CL1-5.
konfluent CL1-5 cellemono kunne observeres etter inkubasjon over natten (~20hrs ) i kulturen kammer av LEFC. Det er rapportert at utviklingen av høy motstand elektrisk sel tar 48-timers plating å nå steady-state in tight junction formasjon [56]. Siden den stramme krysset assosierte gener ble observert å være EF-regulert, inferred vi at DCEF kan påvirke tight junction formasjon under stimuleringsperioden. Således vi videre undersøkt genekspresjonen av andre viktige tette koplingskomponenter, så som transmembran-protein occludins og Claudins, og den cytoplasmatiske ZO familien. Det ble imidlertid ikke observert noen signifikant forskjell mellom kontrollgruppen og den EF-behandlede gruppen. Resultatene antydet at DCEF kan påvirke stramt krysset forsamlingen gjennom regulering JAM-A i stedet for occludins, Claudins og ZO familie i transkripsjonsnivået.
For å oppsummere, kan EF påvirke bevegelsen av CL1-5 av regulere adherens krysset og tight junction i transkripsjon nivå. Mange regulerte gener i disse to signalveier er kjent for å korrelere til celle migrasjon. Med unntak av
PTEN Hotell og
ACTG1
, de fleste av genene har ikke blitt rapportert å være EF-korrelert ennå.
subcellulære lokalisering analyse
En kjent mekanismen for electrotaxis er at membranreseptorer redistribuere under påført DCEF og føre den asymmetriske signalisering av cellen [1]. Det foreslås også at EFs kan bli omformet til mekanisk signaler ved den mekaniske dreiemoment øve på glykoproteiner på cellemembranen [57]. Siden cellemembranen proteiner kan bli direkte påvirket av DCEF, ønsker vi å undersøke deres andel i produkter av EF-regulerte gener. Det ble observert å kode for cellemembranprotein omtrent 18,2% av de i betydelig grad regulerte gener (1 /1,5 fold endring ° C; 1,5 eller 66.5) er større enn den til EF-behandlede gruppen (48,7 i gjennomsnitt med alle replikater 66,5).
Beta-4 integrin, kodet av
ITGB4
, er assosiert med alfa-6 inte å være en reseptor for laminins. Det har blitt rapportert at beta-4-integrin og EGF coordinately regulere EF-mediert retningsmigrering via Rac1 i humane keratinocytter [15]. Fra microarray analyse resultat, fikk vi ikke se reguleringen av
EGF
,
ITGB4
, og
Rac1
under DCEF. Imidlertid
ITGB5
som koder for beta-5-integrinet, et annet medlem av integrinfamilien, viste en betydelig oppregulering av DCEF (1,55-fold, tabell 2). Beta-5 integrin er forbundet med alfa-V-integrin til å være en reseptor for fibronectins. Det har blitt rapportert at RNA interferens knockdown av beta-5 inte uttrykk reduserer cellemigrasjon
in vitro Hotell og metastase
in vivo product: [60]. Vårt resultat foreslo positiv korrelasjon mellom oppregulering av
ITGB5 Hotell og forbedret migrasjon av CL1-5 cellene under den påførte DCEF.
Rac og Cdc42 er GTPases som regulerer lamellipodia og filopodia dannelse hhv. De har blitt foreslått å dominere styringen av vekst kjegler cathodally i
Xenopus
embryonale spinal nevroner. Det har også blitt vist at RhoA, hvis aktivering fører til vekst kjegle kollaps, løfter anodally i EF-behandlede vekst kjegler [17], [18]. Rho proteiner regulere dynamisk sammenstilling av cytoskeletal komponenter i flere fysiologiske prosesser, inkludert cellemotilitet. De er kjent for å være involvert i celle-transformasjon og kreft metastasering. I vår microarray analyse, fikk vi ikke se uttrykket endring av
Rac
,
Cdc42
, og
RhoA
under DCEF. Men
DOCK9
, som koder for en bestemt guanin-nucleotide utveksling faktor (GEF) som gjenkjenner og aktiverer Cdc42, ble vist å være oppregulert ved 1.94-fold (tabell 2) [61]. Dessuten,
RhoJ
, som koder for et annet medlem av Rho familien, syntes å være oppregulert ved EF-behandling (tiltredelse # BC025770). For
RhoJ
, signalstyrken av EF-behandlede gruppen (alle replikater 66,5, 91,4 i gjennomsnitt) er større enn for kontrollgruppen (alle replikater 66,5, 32,4 i gjennomsnitt). Nylig er RhoJ funnet å positivt regulere endothelial motilitet og tubule formasjon [62].
EF-guidet vandring av rotte hippocampus nevroner er formidlet ved aktivering av ROCK og PI3K.
