Abstract
Epitelial-mesenchymale overgang (EMT) er en mekanisme av ervervet resistens mot hemmere av epidermal vekstfaktor reseptor-tyrosinkinase (EGFR-TKI) i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). De nøyaktige mekanismene for EMT-relaterte ervervet resistens mot EGFR-TKI i NSCLC fortsatt uklare. Vi generert erlotinib-resistente HCC4006 celler (HCC4006ER) ved kronisk eksponering av
EGFR
-mutant HCC4006 celler til økende konsentrasjoner av erlotinib. HCC4006ER celler fått en EMT fenotype og aktivering av TGF-β /SMAD vei, mens mangler både T790M sekundær
EGFR
mutasjon og
MET
genamplifikasjon. Vi ansatt genekspresjon mikromatriser i HCC4006 og HCC4006ER celler for å bedre forstå mekanismen av ervervet EGFR-TKI motstand med EMT. På mRNA nivå,
ZEB1 (TCF8)
, en kjent regulator av EMT, var 20 ganger høyere i HCC4006ER celler enn i HCC4006 celler, og økt ZEB1 proteinnivå ble også påvist. Videre mange
ZEB1
responsive gener, for eksempel
CDH1 (E-cadherin)
,
ST14
, og
vimentin
, ble coordinately regulert sammen med økt
ZEB1
i HCC4006ER celler. Vi identifiserte også ZEB1 overekspresjon og en EMT fenotype i flere NSCLC celler og humane NSCLC prøver med ervervet EGFR-TKI motstand. Short-interfering RNA mot
ZEB1
snudd EMT fenotype, og enda viktigere, restaurert erlotinib følsomhet i HCC4006ER celler. Nivået av mikro-RNA-200c, som kan ha en negativ regulere ZEB1, ble betydelig redusert i HCC4006ER celler. Våre resultater tyder på at økt
ZEB1
kan kjøre EMT-relaterte ervervet resistens mot EGFR-TKI i NSCLC. Forsøk bør gjøres for å utforske målretting
ZEB1
til resensitize TKI-resistente svulster
Citation. Yoshida T, Song L, Bai Y, Kinose F, Li J, Ohaegbulam KC, et al. (2016) ZEB1 formidler ervervet resistens til epidermal vekstfaktor reseptor-tyrosinkinasehemmere i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 11 (1): e0147344. doi: 10,1371 /journal.pone.0147344
Redaktør: Pier Giorgio Petronini, Universitetet i Parma, Italia
mottatt: 23 mars 2015; Godkjent: 01.01.2016; Publisert: 20 januar 2016
Copyright: © 2016 Yoshida et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i papir og dets tilleggsinformasjon filer. Den microarray datasettet ble sendt til Gene Expression Omnibus (GEO) med tiltredelse antall GSE71587
Finansiering:. Arbeidet ble delvis finansiert med tilskudd fra Moffitt kreftsenter SPORE i Lung Cancer (P50-CA119997), NCI 1R01 CA121182 og Colorado Lung Cancer SPORE NCI-CA58187 (HD, PN, RMG). Dette arbeidet har også vært støttet delvis av molekylærbiologi og Sekvense Core, den Tissue Core, og microarray kjernen i H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, en NCI utpekt Comprehensive Cancer Center (P30-CA076292). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for fordelen av epidermal vekstfaktor-reseptor-tyrosinkinasehemmere (EGFR-TKI) i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) hos pasienter med
EGFR
mutasjon [1], ervervet resistens mot disse behandlinger er et viktig klinisk problem. Selv om T790M sekundære
EGFR
mutasjon [2] og
MET
genamplifisering [3] kan til sammen står for 70% av denne motstanden, mekanismer for de resterende 30% er uklare. Epitel-mesenchymale overgang (EMT) er negativt assosiert med EGFR-TKI følsomhet i NSCLC [4-7]. I tråd med disse resultatene, nyere studier rapportert EMT som en mulig mekanisme for ervervet EGFR-TKI motstand hos NSCLC cellelinje modeller [8,9]. Videre EMT ble observert i et delsett av NSCLC pasienter som utviklet EGFR-TKI motstand [10,11]. Men detaljerte mekanismer for EMT-relaterte ervervet resistens mot EGFR-TKI i NSCLC, samt strategier for å overvinne den, forblir uklart [8,9]. Flere signalveier, for eksempel FGFR [6,12], TGF-p [8,9], og WNT [13], så vel som transkripsjonsfaktorer, slik som sink finger E-box-bindende homeobox 1 (ZEB1) [ ,,,0],14], har vært innblandet i EMT prosessen.
EMT gjør epitelceller til å få en mesenchymale fenotype assosiert med økt migrasjon (for anmeldelser [15-20]). Det er en viktig mekanisme for plastisitet under utvikling og reparasjon av vev. Det er involvert i sårheling, fibrose, og stamcelle biologi og bidrar til utviklingen av sykdommer-lignende organ fibrosis og cancer. EMT er aktivert i kreftceller og involvert i invasjonen, metastaser, stilk-lignende egenskaper, og motstand mot vanlige antineoplastiske midler [15,21,22]. EMT er indusert av TGFp, andre vekstfaktorer, og hypoksi og omfatter transkripsjonsfaktorer som sneglen, Twist, ZEB1 /ZEB2, og E12 /E47 for å modifisere den transkripsjonelle maskiner, endring av translasjon og proteinstabilitet, ekspresjon av ikke-kodende RNA, og alternativ spleising [16,23,24]. Klassiske funksjoner i EMT er tap av celle-celle adhesjon og cytoskeletal omprogrammering. Low E-cadherin og høy vimentin og N-cadherin uttrykk er klassiske EMT markører. På E-cadherin promoter, de histon demetylase LSD1 forbinder med Snail, transkripsjonsfaktor som er involvert i tidlige stadier av EMT induksjon, noe som tyder på epigenetiske modifikasjoner under EMT [25,26]. Faktisk ble H3K27 acetylering redusert i ZEB1-indusert EMT i lungekreftceller [27]. Nylig ble det molekylære funksjoner knyttet til EMT definert av en integrerende tilnærming i lunge adenokarsinom og pekte på en sammenheng mellom cytoskeletal og aktin-bindende proteiner, EMT fenotype og invasive egenskaper [28]. Interessant er EMT forbigående og reversible, og nye kliniske legemiddelselskap rettet mot EMT er under utvikling [29].
Vi etablerte HCC4006ER (erlotinib-resistente) celler som en modell av EMT-relaterte ervervet resistens mot EGFR-TKI av kronisk eksponering av sensitive HCC4006 NSCLC celler som inneholder en
EGFR
mutasjon (ekson 19, L747-A750del INSP) til økende konsentrasjoner av erlotinib. Vi undersøkte globale endringer i genuttrykk å identifisere molekyler og stier som kan bidra til EMT-relaterte ervervet EGFR-TKI motstand i NSCLC. I tillegg ble uttrykket nivået av mikro-RNA-200c (MIR-200c) undersøkte basert på rapporter som MIR-200c negativt regulerer ZEB1 og EMT prosessen [30-32].
Materialer og metoder
Reagenser
LBH589, erlotinib, BIBW2992, WZ4002, BEZ235, og AZD6244 ble kjøpt fra Chemie Tek (Indianapolis, IN). PD173074, LY364947, salinomycin og IWP2 ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). CNTO328 ble levert av Centocor, Inc. (Horsham, PA). CL-387785 ble kjøpt fra AXXORA (San Diego, California). Stamløsninger av disse reagensene i 100% DMSO ble fortynnet direkte i media til angitte konsentrasjoner. Menneskelig TGF-β1 ble kjøpt fra R . D Systems (Minneapolis, MN)
Cell kultur
HCC4006, H1975 og H358-celler ble oppnådd fra ATCC (American Type Culture Collection). Cell identitet ble bekreftet av STR-analyse (ACGT, Inc., Wheeling, IL), og cellene ble bekreftet å være mycoplasma negativ med PlasmoTest Mycoplasma Detection (InvivoGen, San Diego, California). Celler ble opprettholdt i RPMI 1640-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) ved 37 ° C og 5% CO
2
Generation of EGFR-TKI-resistente celler.
HCC4006ER (erlotinib-resistente) celler ble generert ved eksponering av HCC4006 celler som inneholder en
EGFR
mutasjon (ekson 19, L747-A750del INSP) for å gradvis økende konsentrasjoner av erlotinib, begynner på 3 nM for 3 måneder. Etter innledende tilpasning ble erlotinib konsentrasjonen gradvis økes til 4 mikrometer. H1975 BIBW-R og H1975 WZ-R celler ble generert ved eksponering av H1975 celler som inneholder en
EGFR
mutasjon (ekson 21; L858R og ekson 20, T790M) for å gradvis økende konsentrasjoner av BIBW2992 (irreversibel EGFR-TKI afatinib ) eller WZ4002 (T790M selektiv EGFR-TKI), begynner på 3 nM, i 3 måneder. Etter innledende tilpasning ble BIBW2992 eller WZ4002 konsentrasjonen gradvis økes til 3 mikrometer eller 15 mikrometer, henholdsvis. Enkelt celle kloner av disse cellene ble oppnådd ved seeding ved svært lav tetthet.
Status for
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjoner
Totalt genomisk DNA fra foreldre og resistente celler ble fremstilt ved bruk av DNeasy Blood ComboSyn, Paramus, NJ). CI 1, CI = 1, og CI. 1 indikerer antagonistiske, additive og synergistiske effekter, henholdsvis [35]
RTK matrise
HCC4006 og HCC4006ER celler ble inkubert i RPMI medium med 5 % FBS i 24 timer inntil ~ 80-90% av celle konfluens. Fosforylering nivåer av flere reseptor tyrosin kinaser (RTK), inkludert de av EGF, FGF, PDGF, insulin, VEGF, EPH, AXL, og MER familier (blant annet), ble undersøkt ved hjelp av Proteome Profiler Menneskelig Phospho-RTK rekke kit ( R 25 ug protein ble fremstilt for hver prøver. Primære antistoffer mot EGFR (# 2232), MET (# 3127), pY1234/Y1235-MET (# 3129), Y1289-HER3 (# 4791), pT705-STAT3 (# 9131), pS536-NFkB-p65 (# 3031) , pS465 /467-SMAD2 (# 3101), Akt (# 9272), pS473-Akt (# 9271), Erk (# 9102), pT202 /T204-Erk (# 4377), og PARP (# 9542) ble oppnådd fra Cell Signaling (Beverly, MA). Primære antistoffer mot pY1068-EGFR (# 44-788G) ble oppnådd fra Invitrogen. Primære antistoffer mot vimentin (BDB550513) ble kjøpt fra BD Biosciences (San Diego, California). Primære antistoffer mot ZEB1 (sc25388), fibronektin (sc29011), HER3 (sc285), E-cadherin (sc8426), N-cadherin (sc7939), PTEN (sc7974), Snail (sc28199), Slug (sc15391), Twist (sc6269 ), og Lamin A /C (sc20681) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California). Primære antistoffer mot p-aktin (SigmaA-1978) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich. Pepperrot-peroksidase-konjugert geit anti-mus (NXA931) og anti-kanin (NA934V) sekundære antistoffer ble oppnådd fra Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).
Etablering av HCC4006ER celler med stabil HER3 overekspresjon
En grønn fluorescerende protein (GFP) retroviral plasmid ble sjenerøst gitt av Dr. Florian GREBIEN og Dr. Oliver Hantschel (CeMM Institute, Wien, Østerrike). Subkloning av HER3 inn i retrovirale plasmid og etablering av stabile cellelinjer med overekspresjon ble utført som tidligere beskrevet [36,38]. I korte trekk ble humane cDNA HER3 kjøpt fra Addgene (Cambridge, MA) og amplifisert ved PCR ved anvendelse av forover primer 5′-CACCATGAGGGCGAACGACGCTCT-3 «og revers primer 5′-CGTTCTCTGGGCATTAGCCTT-3». Den HER3 PCR-produkt ble satt inn i pENTR D-TOPO vektor og innføres deretter i pfMSCV C-Strep-HA IRES GFP-GW vektoren ved Gateway LR ClonaseTM II enzymblandingen Kit (Invitrogen). Retrovirus ble pakket i Phoenix HEK293-celler fra ATCC (Manassas, VA) og anvendt for å infisere HCC4006ER celler. To uker etter smitte, ble GFP-positive HCC4006ER celler sortert etter FACSVantage (BD Biosciences) i Moffitt flowcytometrisystemer Core.
Migration (Scratch) analyse og photomicroscopy
HCC4006 og HCC4006ER celler ble sådd på 6-cm skåler og inkubert over natten i RPMI medium med 10% FBS for å skape konfluent monolag. Av cellemonolagene ble skrapet i en rett linje med en 1000 mL pipettespissen og inkubert i ytterligere 12 timer. Cell utseende ble sett på med et Olympus CKX41 invertert mikroskop (Olympus, Center Valley, PA) og fotografert med en Infinity Ett kamera med Infinity Capture /Analyze-programvaren (Lumenera Corp., Ottawa, ON).
TGF-β1 ELISA
HCC4006 eller HCC4006ER-celler (5 x 10
5) ble sådd i 6-brønns plater og inkubert over natten i RPMI med 10% FBS. Mediet ble erstattet med serum-fri RPMI med eller uten erlotinib (1 uM) og inkubert i ytterligere 24 timer. Supernatanter ble samlet inn for ELISA for human TGF-β1 (R MetaCore, California) [40]. Nettverksdata ble integrert og visualisert ved Cytoscape (https://cytoscape.org/) [41]. Vår microarray datasettet ble sendt til Gene Expression Omnibus (GEO) med tiltredelse antall GSE71587.
kvantitativ real-time RT-PCR-analyse
Etter isolering av RNA som ovenfor, kvantitativ real-time RT -PCR ble utført som tidligere beskrevet [14,42]. Tidligere rapporterte primere ble brukt for ZEB1, sneglen, Slug, E-cadherin, EpCAM, ESRP1, ST14, vimentin, N-cadherin og FGFR1 [14].
ZEB1 overekspresjon i H358-celler
Den ZEB1-genet ble klonet inn i pcDNA5-FRT-TO og transfektert inn i H358-FlpIn Trex celler, etterfulgt av seleksjon for resistens mot 5 ug /ml blasticidin og 100 ug /ml hygromycin, som tidligere beskrevet [14]. 6-myc-ZEB1 overekspresjon ble indusert i stabilt transfekterte celler ved hjelp av 10 ng /ml doksycyklin i 5 dager.
Immunhistokjemisk analyse av ZEB1
Immunohistokjemisk farging for ZEB1 ble utført som tidligere beskrevet [14] . Kort fortalt ble parafininnstøpte tumor skiver deparaffinized i Histoclear og utvannet etterfulgt av antigen gjenfinning i kokende Antigen avsløre Solution. Tumorprøver hadde blitt samlet inn fra kirurgisk resected prøver, som rapportert tidligere [10]). The Institutional Review Board godkjente skriftlig informert samtykke for bruk av kreft vevsprøver ble innhentet fra alle pasienter eller fra deres foresatte (Institutional Review Board ved University of Occupational and Environmental Health, Japan, IRB nummer 08-05). Endogene peroksydaser ble inhibert (0,3% H
2o
2) og vevene ble permeabilisert med 0,5% Triton (20 minutter). Platene ble blokkert med 3% BSA /5% geiteserum, inkubert i 2 timer med primært kanin-anti-ZEB1 (01:50), og vasket grundig. Slides ble deretter inkubert i 1 time med biotinylerte anti-kanin antistoffer, vasket, og utviklet med Vectastain ABC, ifølge produsentens protokoll (Vector Laboratories, Inc.).
Kvantifisering av MIR-200c
Total RNA ble ekstrahert med TRIzol (Invitrogen). Revers transkripsjon for moden MIR-200c og RNU6B ble utført med 20 ng total RNA med TaqMan mikroRNA revers transkripsjon kit som inkluderer MuLV revers transkriptase (Applied Biosystems, Foster City, California). Den tilsvarende TaqMan mikroRNA assay ble brukt for kvantitativ real-time PCR med GeneAmp 7500-system (Applied Biosystems). Data er uttrykt som prosent av RNU6B, 100×2
-ΔCt, hvor ΔCt = Ct
MIR-200c- Ct
RNU6B.
Transfeksjon av kortinterfering RNA
Pre-validert kortinterfering RNA (siRNA, Invitrogen, katalog nr HSS110549.) ble brukt til å hemme endogen ZEB1. ON-TARGET pluss Non-Targeting negative kontroll bassengene ble hentet fra Dharmacon (Lafayette, CO) og brukt som negativ kontroll. Transfeksjon ble utført med Lipofectamine RNAiMAX fra Invitrogen i motsatt transfeksjon prosedyren som anbefalt av produsenten.
Resultater
Kronisk erlotinib eksponering av HCC4006 celler genererer stabil celle-autonome motstand mot EGFR-TKI uten T790M eller
MET
forsterkning
For å generere EGFR-TKI-resistente kloner fra en
EGFR
-mutant NSCLC cellelinje, utsatte vi EGFR-TKI-sensitive HCC4006 celler med
EGFR
mutasjon (ekson 19, L747-A750del INSP) til økende konsentrasjoner av erlotinib (opp til 4 mm) i 3 måneder. HCC4006ER celler ble svært motstandsdyktig mot både erlotinib og irreversible EGFR-TKI, CL387,785 (fig 1A). Denne motstanden var stabil, som det ikke ble reversert ved å dyrke HCC4006ER celler i opptil 6 måneder i erlotinib fritt medium (S1 fig). Vi har også etablert 5 enkelt celle kloner av HCC4006ER celler (HCC4006ER-S1 til -S5 celler), som ble hver individuelt motstandsdyktig overfor erlotinib i samme grad som bulk HCC4006ER befolkningen (S2A fig). Dermed blir resistente fenotype var stabil og celle-autonome.
A, HCC4006 og HCC4006ER-celler ble behandlet i 72 timer med økende konsentrasjoner av erlotinib eller CL387,785. Data generert av cellenes levedyktighet assay (CellTiter-Glo) er uttrykt som en prosentandel av verdien for ubehandlede celler. Feilstolpene representerer SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. B, HCC4006 og HCC4006ER cellene ble inkubert i 24 timer ved ~ 80-90% av celle konfluens. Hele cellelysat fra hver cellelinje ble oppsamlet og underkastet Proteome Profiler Humant Phospho-RTK Array Kit for å undersøke nivået av fosforylering av flere RTK’er. Oppdages fosfo-RTK på tabellen er sirklet. De stedene i de fire hjørnene av RTK matrisen er positive kontroller. C, HCC4006 og HCC4006ER cellene ble inkubert i 6 timer ± erlotinib (1 uM). Cellelysater ble utsatt for protein uttrykk analyse med antistoffer mot pEGFR, EGFR, pMET, MET, pHer3, HER3, PTEN, Pakt, Akt, Perk, Erk, og β-aktin.
Vi har undersøkt
EGFR
genet status for begge følsomme og resistente celler for sekundær T790M mutasjon i ekson 20. selv HCC4006ER celler beholdt ekson 19 L747-A750del INSP, T790M ble ikke oppdaget selv med PCR-inntrenger analyse [34], som er mer følsom enn direkte sekvensering (data ikke vist). I tillegg fant vi ikke
KRAS
hotspot mutasjoner (ekson 1 G12V og exon 2 Q61H, data ikke vist), som er assosiert med primær EGFR-TKI motstand i NSCLC [43]. For å undersøke andre rapporterte mekanismer for EGFR-TKI motstand som
MET
forsterkning [3], aktivering av IGFR signale [44], eller tap av PTEN protein [45] undersøkte vi viktige molekyler av EGFR veien ved Western blot og ansatt en fosfor-RTK array å kartlegge ulike aktivert RTK. Men observerte vi ingen tidligere identifisert motstand mekanisme for å EGFR-TKI, inkludert oppregulert MET eller IGFR aktivitet (figur 1B) eller tap av PTEN protein i HCC4006ER celler (figur 1C). I form av EGFR-signalering, ble muligheten for erlotinib å hemme EGFR fosforylering beholdt i begge HCC4006 og HCC4006ER celler. Imidlertid fosfo-Akt og ERK nivåene var følsomme som erlotinib bare i foreldre HCC4006 cellene, i motsetning til HCC4006ER celler (figur 1C).
En tidligere studie rapporterte at HER3 medierer PI3K /akt sti signalisering i gefitinib- sensitive NSCLC cellelinjer [46]. Men analyser vår Western blot viste at HCC4006ER celler helt mistet HER3 protein uttrykk sammenlignet med HCC4006 celler, forklarer tapet av HER3 fosforylering i disse cellene observert i RTK matrise og Western analyse (figur 1B og 1C). For å avgjøre om HER3 tap kan forklare motstanden mot erlotinib i HCC4006ER celler, genererte vi HER3 overekspresjon celler (HCC4006ER-HER3 celler) ved hjelp lentiviral infeksjon for å undersøke effekten av erlotinib på celleproliferasjon og EGFR veien. HCC4006ER-HER3-celler opprettholdt deres motstand mot erlotinib (figur 2A), så vel som varighet av fosfo-Akt og fosfo-Erk (figur 2B), i likhet med de opprinnelige HCC4006ER celler og kontroll lentivirus-avledede GFP overekspresjon (HCC4006ER-GFP). Disse resultater indikerer at HER3 tap ikke kjøre erlotinib motstand i HCC4006ER celler.
a, HCC4006ER celler med stabil GFP eller HER3 overekspresjon (HCC4006ER-GFP og HCC4006ER-HER3-celler) så vel som HCC4006 og de opprinnelige HCC4006ER cellene ble behandlet i 72 timer med økende konsentrasjoner av erlotinib. Data generert av cellenes levedyktighet assay (CellTiter-Glo) er uttrykt som en prosentandel av verdien for ubehandlede celler. Feilstolpene representerer SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. B, HCC4006, HCC4006ER, HCC4006ER-GFP, og HCC4006ER-HER3 cellene ble inkubert i 6 timer ± erlotinib (1 uM). Cellelysater ble utsatt for protein uttrykk analyse med antistoffer mot HER3, pEGFR, EGFR, PTEN, Pakt, Akt, Perk, Erk, og β-aktin. C, HCC4006ER-celler ble behandlet i 72 timer med økende konsentrasjoner av erlotinib alene, BEZ235 alene, AZD6244 alene, eller BEZ235 og AZD6244 i kombinasjon. HCC4006-celler ble behandlet i 72 timer med økende konsentrasjoner av erlotinib i 72 timer for å plotte en referansekurve. Data generert av cellenes levedyktighet assay (CellTiter-Glo) er uttrykt som en prosentandel av verdien for ubehandlede celler. Feilstolpene representerer SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. Kombinasjonsindeks (CI) ved IC50 dose BEZ235 kombinert med AZD6244 ble beregnet ved CompuSyn programvare. CI 1, CI = 1, og CI 1 indikerer antagonistiske, additiv og synergieffekter, henholdsvis. D, ble både HCC4006 og HCC4006ER celler inkubert i 6 eller 24 timer ± erlotinib (1 mm), BEZ235 (500 nM), eller AZD6244 (1 mm) som angitt. Cellelysater ble utsatt for proteinekspresjon analyse med antistoffer mot pEGFR, EGFR, pakt, Akt, Perk, og Erk (prøver av 6 timer) eller til PARP sammen med antistoffer mot p-aktin som en lastekontroll (prøver av 24 timer).
med vedvarende fosforylering av Akt og Erk i HCC4006ER celler, undersøkte vi effekten av PI3K /mTOR-hemmer, BEZ235, og MEK-inhibitor, AZD6244. Vi observerte at fosfor-Akt ble aktivert av fosfor-Erk hemming med AZD6244 i både HCC4006 og HCC4006ER celler. Dette fosfor-Akt aktivering indusert av AZD6244 ble ikke fullstendig hemmet av BEZ235 i HCC4006 og HCC4006ER celler (figur 2D). Kombinasjonen av BEZ235 og AZD6244 ikke gjenopprette inhibering av celleproliferasjon eller PARP-spaltning i HCC4006ER celler indusert ved erlotinib behandling i HCC4006 celler, selv om Kombinasjon indeks (CI) i denne kombinasjonen indikerer synergistisk effekt (CI 1) (figur 2C og 2D ). Disse resultater viser at den doble inhibering av Akt og Erk ikke overvinne erlotinib motstand i HCC4006ER celler, selv om fosfo-Akt og Erk ble vedvarende aktivert uavhengig av EGFR svei.
HCC4006ER cellene vise en EMT fenotype med aktivering av TGF-β /SMAD sti
For å finne ut om motstand i HCC4006ER celler var assosiert med en EMT prosess, vi testet celle migrasjon ved hjelp av skrape analyser. I HCC4006ER celler, ble spalten helt lukket i løpet av 12 timer, mens mer enn 12 timer var nødvendig i foreldre HCC4006 celler (figur 3A). Vi fant også at spredning av HCC4006ER celler var betydelig tregere enn foreldre celler (figur 3B), i samsvar med nyere studier tyder på svakere vekst av resistente celler [47]. Flere rapporter har indikert at EMT er assosiert med primær og ervervet resistens mot EGFR-TKI i NSCLC [4-11]. Den økte migrasjon, erlotinib motstand, og redusert spredning av HCC4006ER celler var i samsvar med en EMT prosess. For ytterligere å undersøke denne muligheten, så vi for EMT-relaterte molekyler i HCC4006 og HCC4006ER celler. Viktigere, fant vi tap av E-cadherin og oppregulering av N-cadherin, vimentin, og fibronektin i HCC4006ER celler, som ikke ble berørt av erlotinib behandling (figur 3C). Videre fant vi at alle enkelt celle-resistente kloner (HCC4006ER-S1 til -S5) hadde gjennomgått EMT, samt tap av HER3 protein, ligner på resultatene observert i de opprinnelige HCC4006ER celler (S2B Fig). Forrige studien indikerte at vedlikehold av gefitinib hindret EMT prosessen og hemmet celle migrasjon i gefitinib bestandig NSCLC celler med
MET
-amplification (men uten EMT fenotype) [48]. Men uttrykket nivåer av EMT markører (E-cadherin, N-cadherin, vimentin, og fibronektin) ble ikke påvirket av fortsatt eksponering av erlotinib i 72 timer i HCC4006ER celler (S3A Fig). I tillegg er det muligheten av vandring i HCC4006ER cellene fortsatt var overlegen i forhold til den i HCC4006 celler selv inkubert med erlotinib (S3b Fig). Disse resultatene antydet at EMT fenotype i HCC4006ER celler var stabil uten hensyn til tilstedeværelsen av erlotinib.
A, ble monolag av HCC4006 og HCC4006ER cellene skrapet i en rett linje med en 1000 mL pipettespissen. Monolags bilder med riper ble tatt etter 12 timers inkubasjon. B, HCC4006 og HCC4006ER celler ble sådd ut på 1×10
3 celler /brønn i svart vegg 96-brønners plater, inkubert i RPMI med 10% FBS, og tillatt å vokse i angitte dagene. Data generert av cellenes levedyktighet assay (CellTiter-Glo) er uttrykt som en prosentandel av verdien for ubehandlede celler. Bestemmelsene ble utført in triplo. Barer, SEM. * P 0,0001 for HCC4006 versus HCC4006ER (Student
t
test). C, HCC4006 og HCC4006ER cellene ble inkubert i 6 timer ± erlotinib (1 uM). Cellelysater ble utsatt for protein uttrykk analyse med antistoffer mot E-cadherin, N-cadherin, vimentin, fibronektin, og β-aktin. D, HCC4006 og HCC4006ER cellene ble inkubert i 6 timer ± TGF-β1 (10 ng /ml) eller erlotinib (1 uM), som angitt. Cellelysater ble utsatt for proteinekspresjon analyse med antistoffer mot pSMAD2 og p-aktin. E, HCC4006 eller HCC4006ER cellene ble inkubert over natten. Mediet ble erstattet med serum-fri RPMI med eller uten erlotinib (1 uM) og inkubert i ytterligere 24 timer. Supernatanter ble samlet opp og underkastet TGF-β1 ELISA. Bestemmelsene ble utført in triplo. Barer, SEM. *
P
0,0001 versus HCC4006 celler med eller uten erlotinib behandling (Student
t
test). F, blir TGF-β-indusert transkripsjon økes ved samtidig behandling med TGF-β og erlotonib i forbigående og transfeksjoner med TGF-p-responsive luciferase konstruksjoner. HCC4006 og HCC4006ER celler ble transient transfektert med p3TP-Lux reporter eller pSBE4 og behandlet med DMSO, 5 ng /ml TGF-β1, 1 uM erlotinib, eller en kombinasjon av 5 ng /ml TGF-β1 og 1 pM erlotinib i 48 timer. Etter 48 timer ble luciferase aktiviteten bestemt som beskrevet i Materialer og metoder.
I samsvar med tidligere studier som viser at TGF-β veien er kritisk for EMT-relaterte ervervet EGFR-TKI motstand i NSCLC [8 , 9], fant vi høyere basale nivåer av SMAD2 fosforylering i HCC4006ER celler. Som forventet, SMAD2 fosforylering økes ytterligere etter TGF-β behandling, og denne økningen var uavhengig av erlotinib behandling (figur 3D). I tillegg, sammenlignet med HCC4006 celler, ble mengden av TGF-β1 i mediet oppregulert i HCC4006ER celler (uavhengig av erlotinib behandling) (figur 3E), noe som tyder på at TGF-β veien ble aktivert sekundært til økt ligand ekspresjon. Aktivering av TGF-β banen i HCC4006ER-celler ble bekreftet ved transfeksjon av TGF-p-responsive luciferase reporter plasmider, pSBE4 og p3TPlux, inn i både HCC4006 og HCC4006ER celler behandlet med 5 ng /ml TGF-β og /eller 1 uM erlotinib . Som kan sees i figur 3F, er TGF-β-drevet transkripsjon høyere i HCC4006ER celler enn i parentale celler ved stimulering av TGF-β uavhengig av tilstedeværelse av erlotinib (figur 3F). *
P
*
P
