Abstract
Bakgrunn
Eggstokkreft er den femte største årsaken til kreft dødsfall hos kvinner. Fem års overlevelse for tidlig stadium sykdommen er større enn 94%, men de fleste kvinner er diagnostisert i avansert stadium med fem års overlevelse mindre enn 28%. Bedre hjelp for tidlig deteksjon og pålitelig pasientovervåking for å øke overlevelsen.
Metodikk og hovedfunnene
Bruk av massespektrometri-baserte proteomikk, søkte vi å belyse et ubesvart biomarkør problemstillingen om evnen til å bestemme tumorbelastning kan detekteres av en ovarial cancer biomarkør protein som stammer direkte fra tumorcellene. Siden aggressive serøs epitelial eggstokkreft står for det meste dødelighet, ble en xenograft modell ved hjelp av menneske Skov-3 serøs eggstokkreft kreftceller etablert for å modellere progresjon til disseminert karsinomatose. Ved hjelp av en metode for lav molekylvekt protein berikelse, etterfulgt av væske-kromatografi og massespektrometri-analyse ble en human-spesifikt peptid sekvens av S100A6 identifisert i sera fra mus med fremskreden fase eksperimentelle ovarian carcinoma. S100A6 ekspresjon ble dokumentert hos kreft xenotransplantater så vel som fra eggstokkreft pasientens vev. Langsgående studie viste at serumkonsentrasjonen S100A6 er direkte relatert til tumorbyrde forutsigelser fra en invers regresjon kalibrering analyse av data som oppnås fra en detergent-supplert antigenerobring immunoassay og hel-dyr bioluminescerende optisk avbildning. Resultatet fra dyremodell ble bekreftet i humane kliniske materialet som S100A6 ble funnet å være signifikant forhøyet i sera fra kvinner med avansert stadium eggstokkreft sammenlignet med de med tidlig stadium sykdommen.
Konklusjoner
S100A6 er uttrykt i ovarier og andre kreft vev, men har ikke blitt dokumentert tidligere i eggstokkreft sykdom sera. S100A6 er funnet i serum i konsentrasjoner som korrelerer med eksperimentelle tumorbyrde og med klinisk sykdom scenen. Dataene bety at S100A6 kan være nyttig i å oppdage og /eller overvåking eggstokkreft, når det brukes sammen med andre biomarkører
Citation. Wei BR, Hoover SB, Ross MM, Zhou W, Meani F, Edwards JB , et al. (2009) Serum S100A6 Konsentrasjon Spår Peritoneal tumorbelastning i mus med ovarialcancer og er assosiert med avansert stadium hos pasienter. PLoS ONE 4 (10): e7670. doi: 10,1371 /journal.pone.0007670
Redaktør: Irene Oi-Lin Ng, The University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 25 juni 2009; Godkjent: 29 september 2009; Publisert: 30 oktober 2009
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
Finansiering:. Denne studien ble støttet av egenutført Research Program, Senter for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda , Maryland, og ved en bevilgning fra Instituto Superiore Di Sanita, Italia under USA-ITALY Oncoproteomics Program. BRW og RMD er ansatte i vitenskaps Applications International Corporation-Frederick, Inc., Frederick, Maryland, på oppdrag fra National Cancer Institute utført Research Program (Award N01-CO-12400). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft (OVCA) utgjør bare 4% av krefttilfeller hos kvinner, men det er den femte største årsaken til kreftdød og den mest dødelige gynekologisk kreft i denne populasjonen [1]. I 2008 var det anslagsvis 21,650 nye tilfeller og 15,520 dødsfall i USA [1]. Cisplatin, en platina-basert kjemoterapeutiske innført i 1978, har blitt en viktig del av en OVCA kjemoterapi og har kraftig forbedret resultatet av tidlig stadium OVCA [2]; 5-års overlevelse for stadium I pasienter er større enn 94% (http //: seer.cancer.gov/csr/1975_2006). Dessverre er OVCA sjelden diagnostiseres på et tidlig stadium når sykdommen er begrenset og ofte asymptomatiske. Nesten 70% av OVCA tilfeller oppdages ved spres stadier, dvs. stadier III og IV, der fem-års overlevelse reduseres til 30% eller mindre.
Et presser OVCA forskning prioritet er funnet og validering av biomarkører nyttige for å diagnostisere de mest dødelige typer OVCA, som ofte utvikle seg raskt [3]. Den eneste tilgjengelige FDA-godkjent ikke-invasiv prosedyre for ovarian cancer diagnose hittil er måling av serum CA-125 nivåer. Selv om 80% av pasientene med langt fremskreden OVCA har forhøyede serum-CA-125, er det en høy falsk positiv hastighet som er knyttet til CA-125 test [4] – [6]. Fysiske forhold som for eksempel graviditet, bekkeninfeksjon, godartede cyster, livmor fibroids, eller infeksjon kan også øke serum CA-125 nivåer [7], [8]. Andre kreftformer, inkludert pankreatisk, lunge, bryst, mage og tykktarm kreft har også vist seg å øke serum-CA-125 [4], [8].
veksten av massespektrometri (MS) proteomforskning teknologi har ført til et nytt muligheter for å oppdage spesifikke protein markører for tidlig OVCA deteksjon. Menneskelig serum står som et attraktivt prøven for biomarkører ved hjelp av MS fordi prøven oppkjøpet er minimal invasiv, og serum er standard fysiologiske væske brukes til diagnostiske formål. Imidlertid kompleksiteten og bredt dynamisk område av serumproteinkonsentrasjon foreta analyse av totalt serum proteome utfordrende; serumproteinkonsentrasjoner variere 9 størrelsesordener og 99% av det totale serumproteinmasse er dannet av bare omtrent 22 proteinarter [9]. Slike utfordringer knyttet til serum proteomikk for biomarkører vil ikke bli lett overvinnes [8], [10]. Derfor bør flere eksperimentelle tilnærminger som omfatter MS teknologi og serumprøve behandling undersøkes for å oppdage klinisk relevante OVCA biomarkører. Faktisk metoder så som utarming av rikelige proteiner ved anvendelse av affinitetskolonner og protein fraksjonering er blitt anvendt for å øke sannsynligheten for å avdekke tumor-avledede proteinarter, som ofte i lav overflod [11]. En tilnærming som holder betydelig potensial er analyse av lav molekylvekt serum proteom- /peptidome [12]. Med lav molekylvekt (LMV) proteiner og peptider ofte binde seg til vekt serumproteiner med høy molekyl, og dermed forlenge halveringstidene for den LMW fraksjonen i omløp [13] – [15]. Dermed representerer serum LMV proteom- en attraktiv reservoaret der tumor avledet lave rikelig proteiner og peptider kan bli bedre bevart og potensielt oppdaget.
Utvikling og bruk av OVCA dyremodeller kan tjene som supplerende hjelpemidler i å identifisere og bekrefte prediktiv serum biomarkører. Bruk av dyremodeller har utsikter til å minimere noen av de dype genetiske og miljømessige variasjoner ofte oppstått i menneske proteomet studier hvor objektive kontrollprøver er ofte vanskelig å få tak [16]. Slike studier med humane cancer xenograft modeller har blitt publisert tidligere [17] – [20]. Transplantasjon av humane kreft hos immundefekte mus er en nyttig modell for oppdagelsen av proteomic serum- eller plasmaprofiler som korrelerer med tumorbyrde. Disse modellene har den ekstra fordelen av å tilveiebringe midler for å bestemme om biomarkør av interesse er avledet direkte fra kreftcelle, eller er et produkt av den vertsrespons fordi man kan undersøke tilstedeværelsen av tumorcelle-avledede humane spesifikke proteiner. Target biomarkører som er identifisert ved MS kunne deretter bli ytterligere validert i slike modeller, for derved å øke sannsynligheten for å få en patologisk relevante markør. Følgelig ble en human OVCA musemodell etablert i et forsøk på å skjelne eggstokkreft-avledede proteiner i serum ved hjelp av MS-baserte oppdagelse. Denne tilnærmingen avslørte tilstedeværelsen av S100A6, i tillegg til andre humane proteiner i sera fra mus med OVCA. Uttrykk av S100A6 ble videre undersøkt i humane kreftcellelinjer og vev avledet fra OVCA pasienter. I tillegg ble et system søkt å korrelere mengde serum S100A6 og tumorbelastning i modellen. Sistnevnte Målet bestreber seg på å begynne å ta opp viktige ubesvarte spørsmål angående en svulst størrelse er nødvendig for å tillate
de novo
påvisning av protein signaturer av massen i blodet. Til slutt, søkte vi å validere uttrykk profilen til S100A6 i humant serum ved hjelp av en godt kontrollert klinisk studie sett kvinner med tidlig og avansert stadium eggstokkreft.
Resultater
En generell eksperimentell tilnærming for oppdage LMV serumproteiner med mulig relevans for human OVCA i en musemodell ved hjelp av MS er vist i figur 1. etter intraperitoneal (ip) injeksjon av mus med humane serøse SKOV-3-celler eller OVCA saltvannskontroll, ble blod samplet ved forskjellige tidspunkter mens tidlig og progressive karsinomatose ble modellert. LMV serum proteom- ble analysert for å identifisere proteiner som er spesifikke for, eller mer rikelig i, kreft-bærende mus. Tilstedeværelsen av tumor-avledede S100A6 protein i serum ble ytterligere studert som en kandidat biomarkør ved hjelp av antistoffbaserte analyser. Tumorbyrde ble korrelert med tilstedeværelse eller nivå av serumprotein S100A6 i modellen, som derved kan betraktes som en antatt biomarkør. Grunnlaget for videre validere den kliniske relevansen av disse funnene for OVCA pasienter ble lagt ved å påvise mer rikelig S100A6 i sera fra kvinner med avansert stadium sykdommen, sammenlignet med tidlig stadium sykdommen.
For å finne ut om kreft avledede proteiner har kandidat biomarkør potensial, (A) et bioluminescent xenograft modell, (B) ECLISA, (C) Western blot, og (D) OVCA vevet matrise immunhistokjemi (IHC) blir utnyttet. Dette ble fulgt opp for S100A6 ved analyse av menneskelig pasientsera.
Funn av OVCA Associated serumproteiner
Den eksperimentelle sykdommen utviklet fra neoplastisk celle såing av bukhinnen under engraftment til disseminert karsinomatose , etterligne progresjon fra regional fjern avansert stadium OVCA hos kvinner. All Skov-3-inokulert mus utstilt flere, løst store infiltrerende tan, solide tumornoduler fordelt gjennom bukhinnen ved 4 uker etter inokulering (p.i.). Dette ble fulgt av neoplastiske effusjoner i bukhulen av de fleste SKOV-3-inokulerte mus. Histologisk ble mesenteriets massene består av en morfologisk variabel befolkning på neoplastiske eggstokkene epitelceller. Disse cellene skjedde som expansile, papillær vekster med trabeklene 2-3 celler tykke, eller som faste tett cellulære masser som støttes av begrenset bindevev (figur 2A og B). Alle saltvann-inokulert kontroll mus forble fri for sykdom.
(A) Representant OVCA utstillinger overveiende solid tumorvekst, med bevis for papillær projeksjoner og sporadiske minutt cyster (bar = 25 mikrometer). Inset, høyere oppløsning mikrofotografiet viser cuboidal å kantet pleomorphic microcystic epitel med anisokaryosis og atypiske mitoser av eggstokkreft cellekjerner (bar = 50 mikrometer). (B) OVCA tumor nodul implantatet på uterin infundibulo-ovarie ligament (pilspiss) ved siden av eggstokk (pil) (bar = 25 pm). Tumor implantater fant sted over hele bukhulen, peri-eggstokk bindevev, og invaderte omkringliggende vev som tarmer, lever og membran. Hematoxylin og eosin (H E). Farget, parafininnstøpte vevssnitt
Index sera høstet fra mus med sent stadium karsinomatose 4 uker etter inokulering av 1 x 10
6 SKOV- 3 humane OVCA celler ble analysert ved MS og sammenlignet med kontrollmusesera (første av 3 studiedyrekullene). Dataene ble gransket for å bestemme peptider /proteiner med større Forekomsten i kreft vs. kontrollprøver (spektral count analyse). Samlet analysene ga identifisering av ca 400 peptider som tilsvarer ca 300 proteiner (kombinert menneske og mus database søkeresultat). For å bestemme proteiner med en høy sannsynlighet for differensial overflod, ble resultatene av den spektrale count analyse av det humane protein database search filtrert ved anvendelse av Stillas programvare for å gi proteiner med et minimum av 10 MS /MS-spektra er tilordnet (summen av alle gjentatte analyser) og en statistisk signifikant forskjell i antallet tildelte spektra (kreft kontroll) som målt ved hjelp av en t-test (p-verdi 0.05), eller i det minste en 100% forskjell i de spektrale tellinger ((kreft tellinger – kontrolltellinger) /(gjennomsnittlig kreft og kontrolltellinger) x 100%). Disse resultatene er vist i tabell 1.
Etter identifisering av disse kandidat differensielt rikelig (kreft kontroll) humane proteiner, humane peptidsekvenser som er identifisert ved MS /MS-spektra ble deretter søkt mot en database til mus undersøke om peptidsekvensen var homolog mellom menneske og mus, og for å verifisere hensiktsmessigheten av sekvensen anropet (eller hvis det ikke var tvetydighet i aminosyre betegnelse). Proteiner ble klassifisert ved at (1) human-spesifikke peptider bare, (2) peptider som er homologe til både human og mus, og (3) både 1 og 2 (tabell 1). Proteiner identifisert av menneskelige spesifikke peptider er potensielt større verdi siden de mest sannsynlig stammer fra xenopodet humane kreftceller.
S100A6 ble valgt for videre studier. I tillegg til å møte kriteriene for betydning som er fastsatt for å differensiere kreft forbundet serumproteiner fra kontrollprøver (tabell 1), ble S100A6 betraktet som en kandidat for ytterligere kontroll på grunn av dens økte ekspresjon i en rekke humane kreftformer og dens relativt lille størrelse (10,5 kDa ). I det sistnevnte henseende, S100A6 var attraktiv for dens potensial for å være et intakt protein gitt ved den LMW separasjons strategi som brukes for å anrike for proteiner med molekylvekt mindre enn omtrent 25 kDa. Som vist i tabell 1, ble tre S100A6 peptider identifisert; to sekvenser som er felles for de humane og muse versjoner av dette proteinet (rød og blå skrifter), og ett peptid som er unike for den humane versjon (grønn skrift) (Figur 3A). MS /MS-spektrum som brukes til å identifisere den unike humane peptidet, LMEDLDR, er vist i figur 3B. Den tilsvarende mus-sekvensen har en asparaginsyre i den tredje rest stilling, i stedet for glutaminsyre i den humane sekvensen. Tilstedeværelsen av denne human-spesifikt peptid ble senere bekreftet i en andre MS /MS-analyse utført på serumprøver samlet inn fra tumor-bærende mus i den tredje kohort av dyr (se Materialer og Metoder).
(A ) Justert human og mus S100A6 sekvenser som viser 3 aminosyre-forskjeller mellom de to artene (vertikale linjer). Tre peptider ble påvist ved LC-LTQ MS /MS fra tumor-bærende mus-sera; sekvenser er vist i farger font. Peptider i rød og blå skrift er homologt til human og mus, mens peptidsekvensen i grønn skrift er unik for human S100A6, på grunn av en aminosyre forskjell. (B) MS /MS-spektret av det humane spesifikke S100A6 peptid, LMEDLDR. Denne sekvensen ble ikke påvist i saltvann-inokulert kontroll mus sera.
Uttrykk av S100A6 i OVCA
En anti-S100A6 immunoblot ble utført for å bekrefte tilstedeværelse av intakt S100A6 i mus sera anvendt i MS-analyser. Ved å bruke en tilpasset anti-humant S100A6 antistoff, C1, en 10,5 kDa bånd svarende til molekylvekten av S100A6 ble detektert i sera samlet samlet 4 uker p.i. fra tumor-bærende mus som brukes for innledende MS-analyser (figur 4A). S100A6 ble ikke påvist i sera fra matchet-studie saltvann-kontroll mus. C1 anti-S100A6 immunblot ble også utført på ytterligere serie med sera tatt fra individuelle SKOV-3-celle-injiserte dyr med eksperimentelt sluttstadiet sykdom, så vel som sera fra naive kontrolldyrene; den S100A6 10,5 kDa båndet ble bare observert i sera fra dyr med svulster, ikke i kontroll musesera (data ikke vist). Bevis for S100A6 protein uttrykk i OVCA xenografter og muse abdominal organer ble undersøkt ved hjelp av immunhistokjemi (IHC). S100A6 immunolabeling ble observert i tumorvevet, men ikke i området mesenteriet eller abdominale organer (tarmer, lever, nyre, urinblære, milt, bukspyttkjertel, uterus og ovarier) (figur 4B og C).
(A) immunoblot-analyse for tilstedeværelsen av S100A6 i sammenslått rå sera fra kreft-bærende mus (1) og saltvann kontrollmusene (2). Sera ble anvendt i LMW proteinfraksjon forberedelse for MS-analyse i biomarkører. (B) OVCA xenografter uttrykke S100A6 som analyseres ved IHC. Tumor xenograft implantat på tarm mesentery avslører S100A6 protein begrenset til tumor, med mangel på immunolabeling i tilstøtende tarmen og mesentery. (C) Serie seksjon fra vev er vist i B, kan anvendes for IHC reaksjonskontroll, viser mangel på immunreaktivitet når primær S100A6 antistoff utelates fra IHC. Immunoperoxidase, hematoxylin counterstain (Bars = 50 mikrometer).
Den potensielle kliniske relevansen av å finne S100A6 i sera fra mus med Skov-3 xenografter ble videre undersøkt ved å undersøke uttrykk av S100A6 i andre OVCA menneskelig pasient avledet prøver ved hjelp av Western blot. I paret kreft og matchet normal eggstokklysatene fra 2 pasienter ble S100A6 forhøyet i carcinoma vev i forhold til sine matchet ikke-neoplastiske eggstokkreft vev (Figur 5A og B). Menneske OVCA-avledede cellelinjer uttrykte ulike nivåer av S100A6 (figur 5C og D). Alle OVCA celler testet, bortsett fra OVCAR-4 og cellelinje avledet fra klar celle ovarie carcinoma (ACI-89-2), uttrykt S100A6 over bakgrunnsnivået (normal eggstokk).
(A og B) Sammenkoblet lysater av OVCA (kreft) og tilstøtende normal eggstokk vev (normal) fra 2 OVCA pasienter ble blottet for S100A6 uttrykk. SKOV-3 cellelysat ble anvendt for sammenligning. (C og D) S100A6 ekspresjon i OVCA cellelinjer fra NCI60 (SKOV-3, OVCAR-3, 4 og 5) samt cellelinjer avledet fra OVCA pasienter (se også Materialer og Metoder).
for ytterligere å avgrense differensial S100A6 uttrykk i menneskelige OVCA pasient vev, undersøkelse av ondartede, borderline, godartede, og noncancerous eggstokkreft vev ble utført ved hjelp av IHC. Vevssnitt mangler S100A6 immunoreaktivitets, lik observasjoner i IHC negativ reaksjon kontroll, ble ansett som negativt. Immunoreaktivitets klart over negativ kontroll ble tildelt som positivt. Prøvene med få antall svakt positive celler ble ansett som usikre. Blant 140 ondartede OVCA prøver, 116 (83%) var positive for S100A6 immunolabeling (tabell 2). Høy S100A6 positiv forekomst (over 80%) ble observert i alle typer av maligne OVCA med unntak av klare cellekarsinom, hvorav bare to av fire prøver var S100A6 positive. Nesten 85% av godartede adenomer viste positiv S100A6 reaktivitet i tillegg; merking intensitet var sammenlignbar med ondartet OVCA. Ingen åpenbar sammenheng mellom merking intensitet og kreft stadium eller klasse ble observert. I motsetning til normale eggstokk-vev og tilstøtende ikke-neoplastisk vev til tumorer oppviste begrenset eller ingen S100A6 merking. Disse resultatene, viser S100A6 ekspresjon i en rekke pasientavledet epiteliale ovarie cancer-cellelinjer og vev, fastslå at ekspresjon av S100A6 i OVCA er ganske vanlig. I denne sammenheng, å finne human-spesifikke S100A6 peptidsekvensen i serum fra humane OVCA-bærende mus indikerer at S100A6 kan ha nytte som en kandidat for overvåking av protein OVCA. Videre positivt uttrykk for S100A6 i godartet og ondartet OVCA, i motsetning til sin virtuelle fravær på overflaten av normal eggstokk, foreslår S100A6 kan være egnet som en markør i bildediagnostikk for å hjelpe finne og bekrefte eggstokkene proliferative endringer.
serum S100A6 nivå korrelerer med OVCA tumor Burden
for å avgjøre om mengden av S100A6 i serum kan brukes som et korrelat for å estimere tumorbyrde,
in vivo
bioluminescent bildebehandling og en modifiserte ELISA assay (ECLISA) ble brukt. Først, for å gi estimater av tumorbyrde i celletall, ble 35 dyr injisert med varierende antall luciferase uttrykke Skov-3 celler (Skov-3-Luc) og
in vivo
bioluminescent fotonsignaler ble kvantifisert (andre kohort , human Ovarian Cancer dyremodell, Materialer og metoder). Regresjonsanalyse ble utført på (log
10) foton utgangs vs. (log
10) antall inokulerte celler til å produsere et standard kalibreringskurve (figur 6A). En invers forutsigelse ligning (se Materialer og Metoder) ble avledet fra den regresjonsanalyse for å få estimater av celle tall, dvs. forutsagt tumorbelastning fra foton fluksen utgangen fra levende dyr.
(A) Photon fluks målinger innhentet fra mus som bærer definerte antall bioluminescerende SKOV-3-Luc celler i bukhulen. Regresjonsanalyse ble utført på (log
10) foton utgangs vs. (log
10) antall inokulerte celler til å produsere en standard kalibreringskurve ved hjelp av en invers forutsigelse ligning (se Materialer og Metoder). Dette ble brukt til å forutsi tumorbelastning fra foton flux målinger (se også figur 6C). (B) Sammenligninger av serum S100A6 i tumorbærende (T, lukket sirkler) og saltvann-inokulert kontroll mus (SC, åpne sirkler). Serum S100A6 konsentrasjoner, testet som individuelle prøver fra flere mus ved ECLISA (plottet som individuelle verdier med horisontal linje på medianverdien), var signifikant forskjellig mellom T vs SC på hver av tre ganger testet etter vaksinasjon, 9 dager (p = 0,015) , 15 dager (p = 0,036) og 21 dager (p = 0,0031) (Wilcoxon Rank Sum test). (C) Sammenheng mellom estimat av tumorbyrden i OVCA karsinomatose og konsentrasjonen av serum S100A6, målt ved ECLISA fra tumorbærende mus (r = 0,79, p 0,0001).
For å avgjøre om serum S100A6 nivåer eskalerte som tumorbyrde økt med tid på studiet, mus ble injisert med Skov-3-Luc eller saltvann (tredje kullet, human Eggstokkreft dyremodell, Materialer og metoder). På dager 9, 15, 21 og 28 etter injeksjon, alle Skov-3-Luc-inokulert mus var optisk fotografert for å få foton utgang fra voksende kreft. Photon flux data ble deretter omgjort til estimater av
in vivo
tumorcelle byrde. Ti dyr hver fra tumor-bærende og kontrollgruppene ble avblødd og fjernet fra undersøkelsen på hvert tidspunkt; serum S100A6 nivået ble kvantifisert ved ECLISA for alle studie mus. Sammenligninger av serumkonsentrasjon S100A6 fra tumor-bærende mus og saltvann-injiserte kontroller viste at så tidlig som i 9 dager p.i., var det signifikant høyere serum S100A6 konsentrasjonen i tumorbærende mus, lenge før noen identifiserbare tumormasser var til stede; den betydelige differensial serum S100A6 nivå vedvarte gjennom dagen 15 til dag 21 p.i. (Figur 6B). De fleste dag 28 p.i. serumprøver ble brukt for MS /MS-analyse, og antall gjenværende serumprøver var utilstrekkelig for statistisk sammenligning.
Sammenhengen mellom tumorbelastning og serum S100A6 nivå i prøver fra disse samme Skov-3-Luc -injected mus ble søkt neste. Når tumorbyrden (celleantall) ble plottet mot serum S100A6 proteinkonsentrasjon i disse dyrene, resultatene indikerte en meget signifikant korrelasjon (r = 0,79, p 0,0001); serum S100A6 konsentrasjon var større når tumorbelastning økte over tid for dyr som er gitt SKOV-3-Luc (figur 6C). Mengden av S100A6 i saltvann-injiserte kontroll mus forble i nærheten av en basalnivået hele studien tidspunkter, typisk tilnærmet den nedre grense for S100A6 ECLISA deteksjon (figur 6B, SC). Økende konsentrasjoner av S100A6 ble også observert i sera samlet opp i serie ved 1, 2 og 4 uker p.i. fra individuelle mus innenfor den opprinnelige kohort av 20 mus som fikk foreldre Skov-tre cellelinje (data ikke vist).
Serum S100A6 nivåer i menneskelig OVCA Study Stiller er knyttet til sykdom Stage
I for å finne ut om det var en sammenheng mellom forhøyet S100A6 protein og tumorbelastning hos kvinner med OVCA utførte vi et pilotforsøk ved hjelp av en velkontrollert human klinisk studie sett av 66 diagnostiske serumprøver som var tilgjengelig for oss gjennom USA-ITALIA Oncoproteomics Program. Sera hadde blitt innhentet før behandling fra kvinner med tidlig stadium (I-IIb) og border OVCA (n = 23), og fra kvinner med avansert stadium (IIc-IV) sykdom (n = 43). Immunoblotter, med C1 anti-S100A6, ble utført på en omvendt fase protein microarray (RPMA) lysbilde. Ved hjelp av denne teknikken, var nivåene av S100A6 funnet å være statistisk forhøyet i serum av kvinner med avansert stadium sykdommen i forhold til de med tidlig stadium svulster (p = 0,031), noe som viser en sammenheng mellom kliniske funksjoner i større tumorbyrde og økte nivåer av S100A6 i OVCA pasienter (figur 7).
scatterplot viser relativ intensitet av serum S100A6 verdier for kvinner med tidlig stadium (åpne sirkler, n = 23) og avansert stadium (lukkede sirkler, n = 43) OVCA. Den tidlige stadium sykdommen gruppen omfatter 2 svulster diagnostisert som border OVCA. Midlene for de relative intensitetsverdiene av analyttkonsentrasjoner vist (horisontale linjer) er vesentlig forskjellig for de to gruppene (p = 0,031, to-prøve t-test), og viser forholdsvis større midlere S100A6 konsentrasjon i sera av avansert stadium pasienter.
Diskusjoner
S100A6 ble identifisert i sera fra mus med menneskelig OVCA ved hjelp av en MS /MS-basert bottom-up proteomikk strategi i et forsøk på å oppdage kandidat biomarkører avledet fra tumormasse . Det humane tumor-opprinnelse S100A6 ble etablert for modellen, og serumkonsentrasjonen av S100A6 korrelert med mengden av eksperimentelle kreft tilstede. Ytterligere kliniske relevansen ble demonstrert gjennom oppdagelsen av potensialet for serum S100A6 å korrelere med tumorbyrde ved hjelp av humane kliniske studie sett.
I løpet av discovery fasen, ble et serum separasjon metode for å isolere LMW proteomet ansatt for å berike proteiner /peptider som sirkulerer i forholdsvis lav overflod, adressering kompleksiteten av hele serum proteome. Den menneskelige Skov-3 cellers xenograft mus modell gitt mulighet til å evaluere artsforskjeller i arbeidet med å klassifisere kreft-assosiert proteom- som enten tumor-avledet (human) vs. vertsrespons (mus). Mer i dybden kliniske valideringsstudier er garantert å undersøke potensialet for serum S100A6 å tjene som en kandidat biomarkør for evalueringen av kvinner med OVCA, spesielt for overvåking av tilbakefall. Denne forutsetningen er understøttet av følgende bevis: (1) nærvær av en human-spesifikt peptid sekvens av S100A6 i sera, (2) deteksjon av S100A6 protein ekspresjon i eksperimentelle tumorer, men ikke i omkringliggende ikke-neoplastiske musevev, (3) en positivt og direkte korrelasjon mellom S100A6 serumkonsentrasjon og tumorbelastning i xenograft-modell, (4) påvisning av forhøyede S100A6 ekspresjon i vev og cellelinjer fra OVCA pasienter, men sjelden i normal eggstokk, i dette og andre studier [21], [22 ], og til slutt, (5) vesentlig heving av analytten i sera hos kvinner med avansert stadium OVCA lignet med kvinner med tidlig fase sykdom. Begrense innledende screening hos mus til Skov-tre cellelinje i dette tilfellet derfor ikke være til hinder for å identifisere en mulig klinisk surrogat biomarkør for ytterligere validering. Ytterligere menneskelige OVCA vev assosierte proteiner ble også rapportert i serum ved hjelp av denne tilnærmingen, og disse kan bli testet ytterligere for kandidat biomarkør potensial ved hjelp av strategien brukt her.
S100A6 ble forfulgt for første validering som en kandidat serum biomarkør grunn sin tilknytning til kreft progresjon [22], [23]. S100A6 er et lite kalsiumbindende protein som tilhører S100 proteinfamilie. De rundt 25 medlemmene av S100 familien er preget av 2 EF-hånd strukturer og sannsynligvis ha kalsium sensor funksjon [24]. S100 proteiner har blitt implisert i en rekke fysiologiske og patologiske prosesser, inkludert celleproliferasjon, differensiering og intracellulær signalisering, selv om deres eksakte funksjon gjenstår å bli definert nærmere [24] – [27]. Med hensyn til S100A6, er dens ekspresjon normalt finnes i fibroblaster og epitelceller [28], og forhøyet S100A6 har blitt rapportert i en rekke humane krefttyper, inkludert karsinomer i tykktarm, bukspyttkjertel, bryst, eggstokk, lunge og skjoldbruskkjertel [29] – [35]
det er motstridende rapporter om rollen S100A6 spiller i kreft.. Vimalachandran et. al. [29] studerte uttrykk mønster av S100A6 som det gjaldt klinisk utfall i kreft i bukspyttkjertelen og S100A6 uttrykk var en negativ prognostisk faktor. Høy, spesielt kjernekraft, uttrykk for S100A6 var assosiert med en dårlig prognose. I tillegg har en trinnvis økning av S100A6 i bukspyttkjertelen kreft blitt rapportert [36]. I motsetning til dette forhøyede nivåer av S100A6 redusert mobilitet av osteosarcom-celler og ble assosiert med reduserte klinisk tydelig metastaser [37]. Tilsvarende ble øket S100A6 uttrykk forbundet med en overlevelsesfordel for ikke-småcellet lungekreft [35]; S100A6 ble demonstrert i 2 lungekreftpasienter «sera, og i pleuravæske av en. I foreliggende studie har vi utvidet verdien av S100A6 å inkludere det som en OVCA serum biomarkør ved å vise positiv ekspresjon i humane OVCA ved hjelp av immunhistokjemi, samt en forbindelse mellom S100A6 serumnivåer og tumorbelastning i både mus og humane pasienter. Det faktum at S100A6 er utarbeidet av en rekke humane kreftformer, tyder på at bruken som eneste biomarkør kan møte potensielle falske positive tilfeller, beslektet med CA-125. Derfor, som omfatter S100A6 til et panel av kreft biomarkører representerer en logisk tilnærming for å bli forfulgt.
Den lave forekomsten av OVCA gjør etablere og validere kliniske biomarkører ved hjelp av humane prøver vanskelig. Bare en i 2500 postmenopausale kvinner er anslått til å bli påvirket av OVCA årlig [38], [39]. På grunn av denne lave forekomsten krever befolkningen screening et stort antall pasienter, og derfor er svært dyrt for OVCA biomarkører og validering. Av denne grunn er anvendelse av en dyremodell kan være et kostnadseffektivt middel for å tilveiebringe prekliniske data for å rettferdiggjøre en stor klinisk validering. Utnytte OVCA dyremodeller for dette formålet krever troskap til både eksperimentelle mål og rekapitulere hovedsymptomene ved sykdom hos mennesker biologi.
