Abstract
cysteinprotease legumain er involvert i flere biologiske og patologiske prosesser, og proteasen er funnet over-uttrykt og forbundet med en invasiv og metastatiske fenotype i en rekke faste tumorer. Følgelig har legumain blitt foreslått som et prognostisk markør for visse krefttyper, og et potensielt terapeutisk mål. Likevel, informasjon om hvordan legumain fremskritt ondartet progresjon sammen med regulering av sin proteolytisk aktivitet er uklare. I dette arbeidet, ble legumain uttrykk undersøkt i kolorektal kreft cellelinjer. Betydelige forskjeller i mengder av pro- og aktive legumain former, sammen med forskjellige intracellulære fordelingsmønstre, ble observert i HCT116 og SW620 celler og tilsvarende subkutane xenografter. Legumain er tenkt å bli plassert og bearbeides til sin aktive form først og fremst i endo-lysosomene; men er fortsatt den subcellulære fordelingen stort sett uutforsket. Ved å analysere subcellulære fraksjoner, ble en proteolytisk aktiv form av legumain finnes i kjernen av begge cellelinjer, i tillegg til den kanoniske endo-lysosomalt bosted.
In situ
analyser av legumain uttrykk og aktivitet bekreftet endo-lysosomal og kjernefysiske lokaliseringer i dyrkede celler, og enda viktigere, også i seksjoner fra xenografter og biopsier fra pasienter med kolorektal kreft. I de HCT116 og SW620-cellelinjer atom legumain ble funnet å utgjøre ca. 13% og 17% av den totale legumain, respektivt. I likhet med tidligere studier på atom varianter av relaterte cystein proteaser, ble legumain vist seg å behandle histone H3.1. Oppdagelsen av atom lokalisert legumain lanserer en helt ny arena for legumain biologi og funksjoner i kreft
Citation. Haugen MH, Johansen HT, Pettersen SJ, Solberg R, Brix K, Flatmark K, et al. (2013) Nuclear Legumain aktivitet i tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (1): e52980. doi: 10,1371 /journal.pone.0052980
Redaktør: Matthew Bogyo, Stanford University, USA
mottatt: 07.06.2012; Godkjent: 22 november 2012; Publisert: 10 januar 2013
Copyright: © 2013 Haugen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har blitt sjenerøst støttet med tilskudd fra Sør-Øst RHF [HSO, # 2011142], www.helse-sorost.no; Norsk Forskningsråd under Funksjonell genomforskning Program [FUGE, # 158954 /S10], www.forskningsradet.no/fuge; Søren og Jeanette Bothners arv og Den Norske Kreftforening [# PR-2006-0272], www.kreftforeningen.no; Universitetet i Oslo; Anders Jahres stiftelse for fremme av vitenskap; Astrid og Birger Torsteds Foundation; og Nansen-stiftelsen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Legumain, eller AEP (asparaginyl endopeptidase), tilhører den cystein protease familien C13 i klanen CD henhold til Merops Peptidase Database [1]. Den ble først oppdaget i bønner [2] og blod fluke (
Schistosoma mansoni
) [3] før Chen og medarbeidere beskrev pattedyr versjon i 1997 [4]. Pattedyr protease er klart homolog med legumain fra ikke-pattedyrarter og bevaring langs evolusjonære avstamning antagelig indikerer funksjonell betydning. Det humane pro-enzym av 433 aminosyrer undergår flere suksessive spaltinger både N- og C-terminalt, hvorav noen krever sur pH, før de når den modne aktive enzymet form. Modningsprosessen er delvis autokatalytisk, men avhenger også av andre proteolytiske enzymer som, sammen med den fullstendig forståelse av aktiveringsprosessen, er ikke fullt ut karakterisert [5] – [7]. Den aktive protease viser meget spesifikt preferanse for substrathydrolyse C-terminalt til asparagin og til en viss grad etter asparaginsyre under mer sure betingelser. De mest potente endogene inhibitorer av legumain er cystatin E /M og cystatin C [8], [9], mens den klassiske kjemiske inhibitor av cystein-proteaser, forbindelsen E64, påvirker ikke aktiviteten legumain [4].
Det er flere rapporter om legumain blir over-uttrykt i et antall av faste tumorer (for eksempel kolorektal og bryst kreft), og dette har også blitt korrelert med en mer invasive og metastatiske fenotype [10] – [12]. Nylig har vi vist et panel av melanomcellelinjer, og fant at legumain ble uttrykt og aktiv i de fleste av cellelinjene undersøkt [13]. I normalt vev, blir legumain mest fremtredende uttrykt i morkaken, nyre og milt [10]. Legumain knock-out mus er født friske og fruktbare, men viser redusert kroppsvekt, avvikende endo-lysosomer med utvikling av nyresvikt og ekstramedullær hematopoiesis i milten [14] -. [16]
Nylig har det vært vist at legumain kan være involvert i celle-proliferasjon er uavhengig av endopeptidaseaktivitet [17]. Videre har legumain blitt vist å aktivere proMMP-2, som delvis kan forklare den observerte sammenheng mellom legumain ekspresjon og metastatisk potensiale [18]. Den strenge substratspesifisitet kombinert med over-ekspresjon i ulike tumortyper har motivert utnyttelse av legumain som et pro-legemiddel aktivator i behandling av kreft, for eksempel ved tilsetning av en spaltbar peptidkjede til doksorubicin eller auristatin [10], [19] og målretting av medikament forbindelser under anvendelse av en legumain enzyminhibitor [20]. Andre kjente biologiske funksjoner av legumain inkluderer autophagic-lysosomal behandling av hepatocellulære proteiner [21], behandling av antigener for MHC klasse II presentasjon [22], og modning i Toll-like receptor signalering [23].
I denne studien, legumain uttrykk og proteolytisk aktivitet ble undersøkt i to kolorektal kreft (CRC) cellelinjer, HCT116 og SW620. Bemerkelsesverdig forskjeller i aktiviteten ble først identifisert og vi videre benyttet disse cellelinjene for å undersøke legumain distribusjon og aktivitet på subcellulære nivåer. Av stor interesse og heller uventet, kjerne proteolytisk aktiv legumain ble avslørt i begge cellelinjer i tillegg til den forventede endo-lysosomalt lokalisering. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved immunfluorescens, immunhistokjemi og
in situ
aktivitetsmålinger i dyrkede celler og transplantater, og også dokumentert i menneskelig CRC svulstvev. Endelig legumain ble vist til proteolytisk spalte histone H3.1
in vitro
avduke en potensiell funksjonell implikasjon av atom lokalisert legumain aktivitet.
Materialer og metoder
Cellelinjer, xenografter og CRC biopsier
RKO, CO205, ble SW48, Colo320DM, HT29, SW620 og HCT116 kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC). KM20L2 og HCC2998 (DCTD Tumor /cellelinje Repository) var velvillig gitt av Dr. Michael R. Boyd (National Cancer Institute, Frederick, MD, USA), samt LS174T [24] og TC7 [25] cellelinjer fra Dr. Richard Hamelin (INSERM, Paris, Frankrike). Cellelinje identitet ble validert av kort tandem repeat analyse for HCT116 og SW620 cellelinjer. Celler ble dyrket i RPMI 1640 (BioWhittaker) inneholdende 10% føtalt bovint serum (Hyclone), 20 mM Hepes (BioWittaker) og 2 mM Glutamax (Invitrogen). Alle cellelinjer ble rutinemessig testet negativt for
Mycoplasma
. Subkutane transplantater fra HCT116 og SW620 ble etablert ved injeksjon av 1 * 10
6 celler i begge flankene av lokalt avlet BALB /c naken (nu /nu) mus [26]. Bolig og alle prosedyrer som involverer dyr ble utført i henhold til protokoller godkjent av Oslo universitetssykehus Animal Care og bruk Committee, i samsvar med de norske forsøksdyr retningslinjer for dyrevelferd. Menneske biopsier ble innhentet fra pasienter under primær kirurgi av antatt eller bekreftet CRC. Studien ble godkjent av Regional etisk komité for Sør-Norge (# S-98080) og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra pasientene.
Cellelysater, klimaanlegg media høsting og subcellulære berikelse
Å oppnå cellelysater for immunblotting, ble sub-konfluente kulturer frittliggende ved hjelp av EDTA (BioWittaker) og vasket 3 ganger i iskald PBS (BioWittaker) før kald lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% NP-40 ) med proteaseinhibitoren blandingen CompleteMini (Roche Diagnostics) ble tilsatt til tørr cellepelleter og stå på is i 15 min. Til slutt ble prøvene ultralydbehandlet og sentrifugert ved 15000 x g i 15 min for å fjerne celleavfall. I prøver for aktivitetsmålinger et lyseringsbuffer (100 mM natriumcitrat, 1 mM dinatrium-EDTA, 1% n-oktyl-beta-D-glukopyranosid, pH 5,8) uten proteaseinhibitorer ble anvendt. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av BCA (bicinchoninic syre) proteinanalysesett (Pierce) eller Bradford-analyse [27]. Alle prøver ble lagret ved -80 ° C. Kondisjonert medium celle ble ervervet ved poding 7,5 * 10
5 celler i 6-brønns plater og dyrket over natten i medium inneholdende serum, deretter vasket og dyrket i ytterligere 24 timer i 1 ml serumfritt medium. Den serum-fritt kondisjonert medium ble sentrifugert ved 15 000 x g i 5 minutter, og supernatanten oppsamlet. Proteiner fra det kondisjonerte medium ble konsentrert ved tilsetning av 4 volumer iskald aceton, forlater prøvene på is i 15 minutter og sentrifugering ved 4 ° C og 12 000 x g i 10 min. Væsken ble fjernet og det utfelte stoffet lufttørket ved romtemperatur før fornyet oppløsning i buffere for immunoblottingforsøk eller aktivitetsmålinger, i henhold til etterfølgende protokoller. Subcellulære anrikning av lysosomer og kjerner ble utført ved tetthetsgradient-sentrifugering i samsvar med Brix
et al.
[28] med separasjon av fraksjonene gjentatt to ganger for å sikre høy renhet. Lyseringsbuffer ble innstilt til pH 5,0 og 7,4 for lysosomale og atomfraksjoner, henholdsvis. Alle andre subcellulære berikelse ble utført i tre paralleller med subcellulære Protein Fraksjone Kit for dyrkede celler (Thermo Scientific) på 5 * 10
6 HCT116-celler og 10 * 10
6 SW620 celler for å oppnå like volum av celle pellets som utgangspunkt materiale i henhold til produsentens protokoll, og med tillegg av vasking av pelleten mellom alle fraksjoner for å sikre høy renhet.
immunblotting og ELISA
prøver ble kjørt på NuPAGE geler 4-12% ( Invitrogen) ved 150 V og romtemperatur ved hjelp av medfølgende MES-buffer (som inneholder SDS) i henhold til produsentens protokoll, og deretter blottet på 0,45 polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore Corp.) i X-cell Sure lock ( Invitrogen) ved 4 ° C i en time i 20% metanol inneholdende Tris-glycin-buffer. Kvaliteten på protein overføringen ble bekreftet ved hjelp Amidoblack for 1D gels. Membranene ble deretter blokkert i en time ved værelsestemperatur i 5% tørrmelk TBST-buffer (Tris-bufret saltvann med Tween 20), og probet med primært antistoff i 5% tørrmelk TBST-buffer i en time ved romtemperatur på følgende konsentrasjoner: legumain geitepolyklonalt antistoff (PAB) (1:1000, R Calbiochem; 219408), cystatin E /M geit pab (1:500, R DakoCytomatation) spesifikt mot tilsvarende arter i én time ved romtemperatur, og deretter vasket 3 ganger. Utvikling ble utført ved hjelp SuperSignal West Dura Utvidet Varighet substrat (Pierce) i henhold til produsentens instruksjoner, visualisert på medisinsk X-ray filmer (Kodak eller Thermo Scientific) og konvertert til TIFF bruker en planfilmskanner (Canon). For densitometry analyserer filmen ble skannet i en kalibrert densitometer GS-800 (Bio-Rad) og kvantifisert ved QuantityOne v.4.6.5 (Bio-Rad). Alle målte kvanta ble normalisert ved hjelp av tilsvarende lastekontroll (α-tubulin). ELISA-målinger av menneskets totale legumain (R Costar, Corning). Etter tilsetning av 100 pl buffer og 50 pl substrat-oppløsning (sluttkonsentrasjon 10 uM) ved enten pH 5,8 eller 7,4, er en kinetisk måling basert på økning i fluorescens i løpet av 10 minutter ble utført ved 30 ° C i en plateleser (Wallac Victor 3 , PerkinElmer) og presentert som enzymenheter hvor en enhet av aktivitet er definert som den mengde enzym som frigjør 1,0 umol av produkt /min, under standardbetingelser som er beskrevet. Immunofluorescens ble utført på celler dyrket på steriliserte glassplater i 6-brønners plater deretter fiksert i 4% PFA og permeabiliserte med 0,2% Triton-X100 før farging med legumain primært antistoff (1:100) og et sekundært antistoff konjugert med Alexa488 (Invitrogen, 1:200, A-11034) i buffer inneholdende 0,1% BSA. Slides ble fremstilt uten tilsetning av primært antistoff. Kjerner ble farget med DRAQ5 ™ (Biostatus) og Dekk montert i Mowiol i 200 mM Tris-HCl, pH 8,5 (Hoechst) før observasjon på laser-scanning confocal imaging system LSM510 eller LSM710 (Carl Zeiss). Bildearitmetikk ble utført i henhold til Jedeszko
et al.
[30] ved hjelp av Image J [31]. Analysen av atom lokalisert legumain ble utført på 5 z-stabler hver bestående av 25-35 seksjoner og hver inneholder 30-40 celler fanget uten mettet piksler.
In situ
aktivitet av legumain i celler og seksjoner vev fra xenotransplantater ble målt ved spalting av substratet Suc-Ala-Ala-Asn-NHNapOME (Department of Biochemistry, University of Cambridge, UK) som tidligere beskrevet, og bekreftet på vev fra legumain knock-out-mus [32], [33] ved hjelp av endelige konsentrasjoner på 1 mM 5-nitro-salicylaldehyd, 0,5 mM substrat og følger med DAPI (Invitrogen) for å visualisere kjerner. Celler som er montert i oktober forbindelse (Tissue-Tek) og xenotransplantater ble skåret i kryostatsnitt (6 uM), og inkubert med 50 pl analyseoppløsning i 10-15 min ved 37 ° C før observasjon ved hjelp av laser-scanning konfokalt avbildningssystem LSM710 eller LSM510, henholdsvis, og ved hjelp av ko-lokalisering modul av Zen 2009 programvare for pseudo-farging (hvit). Slides ble fremstilt ved bruk av buffer uten substrat, epoksy-inhibitoren E64 (Sigma) til en sluttkonsentrasjon på 1 uM eller human rekombinant cystatin E /M (R . D-systemer, 2199-CY ) ble automatisk aktivert ved 37 ° C i 2 timer i sur buffer (50 mM NaOAc, 100 mM NaCl, pH 4,0) ved konsentrasjon 0,1 ug /ul. Bovine legumain ble isolert fra nyre som beskrevet av Yamane
et al.
[35]. Human rekombinant histon H3.1 (New England BioLabs, M2503S) ble tilsatt til 50 ul analysebuffer (50 mM MES, 250 mM NaCl, pH 5,0 eller pH 7,0) med eller uten cystatin E /M og med avsluttende tilsetning av enten aktivt humant eller storfe legumain. Hver Blandingen ble inkubert ved 37 ° C i 2 timer med risting.
Resultater
Legumain og cathepsin L er heterogent uttrykk i CRC cellelinjer
Lysates fra et panel av CRC cellelinjene ble utsatt for separasjon ved hjelp av PAGE og blottet på PVDF-membraner. Ved suksessiv sondering med polyklonale antistoffer, og antall og forskjellige modne former av legumain (øvre panel, fig. 1 og fig. S2A) og kathepsin L (midtre panel, fig. 1 og bunnfeltet, fig. S2A) ble visualisert. Legumain syntes å være til stede i to molekylære masseformer på omtrent 56 og 36 kDa (piler). CRC-cellelinjer viste et bredt utvalg i den totale mengden av legumain, og også i relative mengder av den antatte pro-formen av 56 kDa og den aktive modne formen av 36 kDa, som begge var følsomme for nedregulering av en legumain spesifikk siRNA (fig. S1). Rekombinant human pro-legumain (rhLeg, 5 ng) ble anvendt som kontroll. Cathepsin L var tilstede i de fleste cellelinjer, selv om de høyeste nivåer ble sett i RKO, TC7 og HCT116. I de to sistnevnte, som harbor store mengder moden legumain, den mest dominerende cathepsin L båndet samsvarer med 25 kDa tunge kjede av to-kjede aktiv form (pil). I motsetning til dette viste den RKO cellelinjen samtidig høy ekspresjon av inaktive (30 kDa, enkeltkjedet) cathepsin L og et lavere nivå av aktiv legumain, noe som tyder på at disse cysteinproteaser er utsatt for gjensidig aktivering i tykktarmskreftcellelinjer.
immunoblot av cellelysater fra et panel av CRC-cellelinjer vist høy variasjon i den totale mengden av legumain og cathepsin L, og også i nærvær av de forskjellige modne former. HCT116 og SW620-celler var spesielt interessant som de viser gjensidig utelukkende høy mengde av den aktive (36 kDa) og inaktiv pro-form (56 kDa) av legumain, respektivt. Uncut immunoblotter (Fig. S2A).
Den cellelinjer HCT116 og SW620 viser avvik legumain aktivitet
HCT116 cellene vises hovedsakelig den modne 36 kDa formen av legumain, mens SW620 viste også betydelig mengder av 56 kDa pro-form (figur 1 og TL;. fig. 2B) [6]. Lysater fra disse to cellelinjer ble videre analysert for deres evne til å spalte en legumain spesifikt substrat. Disse aktivitetsmålinger viste en entydig samsvar mellom den observerte intensiteten av 36 kDa-båndet og legumain aktivitet i total lysater (TL Fig. 3B). Videre, HCT116 og SW620-celler ble behandlet med et siRNA spesifikk for legumain viste en 70-90% reduksjon i legumain aktivitet (data ikke vist). Etter å ha etablert bevis for forskjeller i mengden av aktivt legumain i HCT116 og SW620 det var av interesse å bestemme om dette kan tilskrives mutasjoner i Asn323 lokalisert i exon 12, som er blitt hevdet nødvendig for spaltning av pro-enzymet inn i den aktive form [5], [6], [36]. Imidlertid viste sekvense ingen mutasjoner i
LGMN
nukleotidsekvens som tilsvarer spaltningssetet gjenkjenningssete i disse cellelinjer (data ikke vist), og kan således ikke forklare den observerte forskjellen i proteaseaktivitet. Videre cystatin E /M har vist seg som den mest potente endogene inhibitor for legumain og ekspresjon av dette protein, ble derfor undersøkt. Interessant, de cellulære og utskilte nivåer av cystatin E /M ble funnet å være ganske forskjellig mellom de to cellelinjer. I HCT116, to former (14 og 17 kDa) av cystatin E /M ble funnet i kondisjonert medium (CM, Fig. 2B), med mer beskjeden mengde og i hovedsak den 14 kDa-formen i det totale cellelysat (TL). I motsetning til dette uttrykte SW620 ingen påviselige mengder av cystatin E /M verken utskilles eller intracellulært.
(A) immunoblot av legumain i lysosomal (L) og kjernefysiske (N) fraksjoner som er anriket fra HCT116 og SW620 celler ved hjelp av tetthetsgradient sentrifugering. Alle baner var lastet med 15 mikrogram total protein fra hver fraksjon. Purity kontroller av subcellulære fraksjoner ble vurdert ved farging for ARSB (løselig lysosomale protein) og SP1 (atomtranskripsjonsfaktor). (B) immunoblotter av legumain (toppfeltene), cystatin E /M (andre paneler) og cathepsin L (tredje paneler) i beriket subcellulære avdelinger isolert fra HCT116 og SW620 celler ved hjelp av et kommersielt kit: cytosol (C), membraner /lysosomer ( M /L), kjerne løselig (NS), kjernefysisk kromatin bundet (NC), total lysat (TL) og betinget media (CM). Alle baner var lastet med 15 mikrogram total protein fra hver fraksjon, bortsett fra kondisjonert medium hvor proteiner utfelt fra 1 ml ble lastet. Purity kontroller av ulike subcellulære fraksjoner ble vurdert ved farging for α-tubulin (cytosolprotein), ARSB (løselig lysosomal protein), lampe-2 (lysosome membran-assosiert protein), SP1 (kjernefysisk transkripsjon faktor) og histon H3 (kjernefysisk kromatin bundet protein). Ukuttede immunoblot av legumain og cathepsin L (fig. S2C).
(A) Proteolytisk aktivitet av legumain bestemt ved spalting substrat (Z-Ala-Ala-Asn-NHMec) i forhold til totalproteininnholdet i hver subcellulære rommet HCT116 (prikkede søyler) og SW620 (rutete barer) celler etter tettshetsgradient sentrifugeringer. Lysosomale og atom fraksjoner ble fremstilt og analysert ved pH 5,8 og 7,4, respektivt, som viser proteolytisk aktivitet av legumain i både lysosomale og nukleære fraksjoner av begge cellelinjer ved begge pH-betingelser, men størst i lysosom-delen analysert ved pH 5,8. (B) Proteolytisk aktivitet av legumain målt ved pH 5,8 i subcellulære fraksjoner fremstilt av et kommersielt kit ble funnet å være høyest i M /L fraksjoner, men var også tydelig til stede i NS-fraksjonene og observert med bare mindre aktivitet i C-fraksjonene av begge cellelinjer. Ekstracellulær legumain viste ikke noen aktivitet i enten cellelinje (data ikke vist). (C) Totalt legumain mengder (pro- og aktiv form), målt ved hjelp av ELISA i subcellulære fraksjoner (isolert ved anvendelse av et kommersielt kit) og beregnet i forhold til det totale proteininnhold i hver fraksjon var også høyest i de M /L fraksjoner, men klart til stede i NS-fraksjonen.
Aktiv legumain er lokalisert til endo-lysosomal og kjernefysiske avdelinger
legumain er vanligvis betraktet som et protein rettet mot og bosatt i endo-lysosomer, og det har også blitt rapportert å utføre viktige cellulære funksjoner inne i dette spesialiserte rommet [22], mens dens fordeling og egenskaper i andre subcellulære kamrene ikke er klarlagt. For ytterligere å undersøke dette har vi brukt to metoder for å isolere og berike proteiner fra subcellulære avdelinger, et vesen basert på densitetsgradientsentrifugering i sukrose buffer og den andre er en kommersielt tilgjengelig subcellulære isolasjon kit. For å undersøke fordelingen av legumain, ble immunoblotting utført på 15 ug totalt protein lysat fra hver anriket subcellulær fraksjon, i tillegg til totalt cellelysat og tilsvarende betinget vekstmedium (fig. 2). Dette gjorde det også mulig for renhet styring av fraksjonene ved hjelp av ulike proteiner av antatt begrenset distribusjon, som viser høy anrikning av hvert kammer, og med nesten ingen påvisbar kryssforurensning (fig. 2, kammer-spesifikke markører vist nedenfor svarte linjer). I begge subcellulære berikelse metodene det 36 kDa aktive legumain var til stede i vesentlige mengder i det lysosomale (L) og membran /lysosomal (M /L) fraksjoner, samt i kjernekraft (N) og atomoppløselige (NS) fraksjoner i begge begge cellelinjer. Det ble igjen oppfattet at samlet HCT116 forhold til SW620 celler inneholdt et lavere nivå av 56 kDa pro-form i alle subcellulære fraksjoner, bekrefter observasjoner gjort fra totale cellelysater (Fig. 1 og 2), mens 56 kDa prolegumain var også observert i atomfraksjonene i begge cellelinjer. HCT116-celler viste også mindre mengder av 36 kDa-legumain i cytosol (C) og kjerne kromatin bundet (NC) fraksjoner (Fig. 2B og fig. S2C, venstre midtre paneler). Det 56 kDa pro-formen av legumain ble funnet å bli utskilt og detekteres i kondisjonert medium (CM, Fig. 2B), men bare fra HCT116. Av spesiell interesse var det klart tilstedeværelsen av 36 kDa aktive legumain i de nukleære fraksjonene fra begge cellelinjer, i tillegg til det forventede tilstedeværelse i de lysosomale fraksjoner. I tillegg ble subcellulære berikelse utført ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig andre subcellulære isolasjon kit (Qiagen), også viser den nukleære lokalisering av modne 36 kDa legumain (fig. S2B). Når det gjelder endogent uttrykt inhibitor cystatin E /M, bare spormengder av det 14 kDa formen ble observert i både M /L og NS brøkdel av HCT116. Til slutt, subcellulære fordeling av cathepsin L ble også evaluert, og dette protease ble funnet å være mye mindre fremtredende i SW620 sammenlignet med HCT116-celler (Fig. 2B og fig. S2C, nedre paneler), som også var tydelig i de totale cellelysatene (fig. 1 og 2B). I HCT116 den antatte 25 kDa aktive to-kjedede formen av cathepsin L [37] var tydelig til stede i M /L og NS fraksjoner samt i TL og CM, men også til en viss grad i C og NC fraksjoner. Selv om det er tilstede i aktiv form i CM, denne fraksjonen viste også pro-formen av cathepsin L sett av et sterkt bånd på tilnærmet 38 kDa. Den cathepsin L enkeltkjedet form av 30 kDa var hovedsakelig tilstede i M /L og NS fraksjoner av begge cellelinjer. I SW620, ble svakere bånd av cathepsin L kun observert i M /L og NS fraksjoner samt i TL, og også med en svak nærvær av pro-form i CM.
De ulike subcellulære fraksjoner fra HCT116 og SW620-celler ble deretter analysert for deres evne til proteolytisk spalte en legumain spesifikt peptid substrat i forhold til den totale mengde av proteiner tilstede i hver fraksjon målt. I lysosomale og atomfraksjonene separert ved sukrosetetthetsgradienter ble aktiviteten målt ved både pH 5,8 og 7,4, respektivt, for å etterligne fysiologiske betingelser (Fig. 3A). I forbindelse med tidligere studier, de lysosomale fraksjoner viste høy proteolytisk legumain aktivitet, men mer uventede atom fraksjoner av begge cellelinjer målt ved nøytral pH viste også betydelig legumain aktivitet. I de subcellulære fraksjoner ble isolert ved hjelp av kommersielle kit, proteolytisk aktivitet av legumain målt ved pH 5,8 var også høyest i M /L (fig. 3B) fraksjon, imidlertid, i overensstemmelse med tidligere resultater, betydelig legumain aktivitet ble funnet i de nukleære fraksjoner av begge cellelinjer, spesielt de oppløselige fraksjoner (NS). Videre ble legumain uttrykk i de subcellulære fraksjoner som oppnås ved hjelp av kommersielt sett vurderes ved hjelp av sandwich-ELISA er i stand til å detektere total legumain (dvs. både pro- og aktive former) (Fig. 3C). I alle fraksjonene ble observert påvisbare mengder av legumain (i forhold til totalinnhold protein i hver fraksjon), mens de høyeste nivåene ble observert i M /L og NS fraksjoner, som også ses på immunoblot (Fig. 2B). En uventet resultat var mengden og aktiviteten av legumain i de subcellulære fraksjoner fra 10 * 10
6 SW620-celler som ble målt til å være omtrent dobbelt så høy som i fraksjoner fremstilt fra 5 * 10
6 HCT116-celler, selv om alle baner var lastet med 15 mikrogram protein. Men totalt lysatene hele beløpet av legumain (pro- og moden-form) var nesten like, men HCT116 cellene hadde høyere samlet legumain aktivitet i de totale cellelysatene som tilsvarer den observerte mengden aktivt legumain i immunoblotter (Fig. 2B).
in situ
distribusjon av legumain uttrykk
for å undersøke legumain uttrykk
in situ
, HCT116 og SW620 celler ble dyrket på objektglass, immunofluorescently farget og visualisert ved hjelp konfokalmikroskopi (fig. 4A-4D og fig. S3A-S3b). Legumain var hovedsakelig fordelt i perinukleær regionen, muligens tyder majorly lokalisering til
trans
-Golgi nettverk (TGN) og endo-lysosomer, og mest synlig i HCT116-celler (fig. 4A), mens i SW620 celler legumain holdige blemmer dukket opp mer fordelt (fig. 4C). Både HCT116 og SW620 også vist legumain plassert i kjernen av cellene. Ved å visualisere bare atom lokalisert legumain i alle tre ortogonale plan av cellene, ble legumain observert å fordele seg rundt sfæriske strukturer, eventuelt nucleoli, på innsiden av kjernene (fig. 4B og 4D). Ved hjelp av bildearitmetikk på optiske skiver fra fem uavhengige z-stabler, hver inneholdende 30-40 immunofluorescently merkede celler, ble den gjennomsnittlige prosentandelen av intracellulær legumain lokalisert i kjernen i en celle beregnet til 12,8% i HCT116 og 16,5% i SW620 (fig. 5). Ytterligere analyse av de to cellelinjene dyrkes som subkutane transplantater i mus viste sammenlignbare resultater i immunofluorescens merking ved immunhistokjemisk farget for legumain (fig. 4E og 4F, og fig. S3C-S3F), med HCT116 viser intens granulert farging mens SW620 viste en mye mer diffust fargemønster. Videre i xenografter fra begge cellelinjene legumain utstilt heterogene uttrykk, med intenst farget områder, muligens nekrotisk vev. Nuclear lokalisering var mest synlig i celler med generell høy legumain uttrykk, men flekker av legumain flekker ble også oppdaget inne kjerner i de svakere fargede celler (gule piler). Immunhistokjemisk analyse av parafin innleiret tumorvev fra CRC-pasienter, avslørte også heterogene ekspresjon av legumain som var synlig både i kreftceller og de omkringliggende stromale celler (fig. 4G og S3G fig.).
