Abstract
Bakgrunn
Sirtuin 1 (SIRT1) fungerer som en viktig regulator av vaskulær endotelial homeostase, angiogenese, og endotelial dysfunksjon. Men den underliggende mekanisme for SIRT1-mediert lungekarsinom angiogenese er ukjent. Heri, rapporterer vi at nikotinamidadenindinukleotid 1 (NAD1) -avhengig deacetylase SIRT1 kan fungere som en iboende negativ modulator av Delta-lignende ligand 4 (DLL4) /Notch signalering i Lewis lungekarsinom (LLC) xenograft-avledet vaskulære endotelceller ( lungekreft-avledet ECS).
hovedfunnene
SIRT1 regulerer negativt Notch1 intracellulære domenet (N1IC) og Notch1 målgener HEY1 og hey2 svar på Delta-lignende ligand 4 (DLL4) stimulering. Videre SIRT1 deacetylert og undertrykt N1IC uttrykk. Kvantitativ kromatin immunoprecipitation (qChIP) analyse og genet reporter analysen viste at SIRT1 bundet til en svært konservert region, som var plassert på ca. -500 bp oppstrøms for transkripsjonsstart stedet Notch1, og undertrykt Notch1 transkripsjon. Hemming av endotelial cellevekst og spirende angiogenese ved DLL4 /Notch signale ble forsterket i SIRT1-forstummet lungekreft-avledet EC og reddet av Notch inhibitor DAPT. In vivo, en økning i proangiogenic aktivitet ble observert i Matrigel plugger fra endotel-spesifikk SIRT1 knock-in mus. SIRT1 også forbedret tumor neovaskularisering og tumorvekst av LLC-xenografter.
Konklusjoner
Våre resultater viser at SIRT1 muliggjør endotelcelle forgrening og proliferasjon for å øke fartøyets tetthet og fremme tumorvekst lunge gjennom nedregulering av DLL4 /Notch signalering og deacetylering av N1IC. Dermed rettet mot SIRT1 aktivitet og /eller genuttrykk kan representere en ny mekanisme i behandling av lungekreft
Citation. Xie M, Liu M, He C-S (2012) SIRT1 Regulerer endotel Notch signale i lungekreft. PLoS ONE 7 (9): e45331. doi: 10,1371 /journal.pone.0045331
Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Storbritannia
mottatt: 24 august 2011; Akseptert: 21. august 2012; Publisert: 18.09.2012
Copyright: © Xie et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Science and Technology Planning Project i Guangdong-provinsen, Kina (nummer 83050) og Stiftelsen Medical Scientific Research i Guangdong-provinsen, Kina (nummer A2009265). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
nikotinamidadenindinukleotid (NAD) -avhengig deacetylase SIR2 regulerer levetid på flere organismer som svar på kalori begrensning [1]. Pattedyr homologer av SIR2 omfatter en familie av syv proteiner, som er referert til som sirtuins (de klasse III histone deacetylases (HDAC) SIRT1-SIRT7), og har blitt karakterisert som viktige regulatorer av flere viktige fysiologiske prosesser knyttet til metabolisme og stress motstand [ ,,,0],2].
Nyere studier har antydet at SIRT1 er en viktig formidler av vaskulær endotelial homeostase, spesielt bidrar til angiogenese, vaskulær tone, og endotelceller funksjoner [3]. Spesielt, er SIRT1 høyt uttrykt i vaskulaturen i løpet av vekst av blodkar, hvor den styrer den angiogene aktiviteten til endotel-celler. I tillegg er tap av SIRT1 resultater i nedregulering av gener relatert til blodkarutvikling og vaskulær remodellering, noe som fører til hemming av angiogenese og spirende forgrenings morfogenese av endotelceller [4].
Notch pathway regulerer mange celle skjebne /avstamning beslutninger i flercellede organismer under normal embryogenese og postnatal utvikling [5]. Ved binding av liganden til Notch kognatreseptoren, er et proteolytisk spaltning kaskade initiert i intramembrane domene av reseptoren. Det siste trinnet spaltning katalyseres av det γ-sekretase proteinkomplekset og fører til frigjøring av det aktive hakk intracellulære domene. Dette proteinfragment deretter translocates inn i kjernen og virker som en kofaktor for å regulere transkripsjon av Notch målgener [6]. I tillegg til de Notch1 og Notch4 reseptorer, vaskulære endotelceller som uttrykker også en taggete, Delta-lignende ligand 1 (DLL1), og den endotelcelle-spesifikt DLL4 [7]. Zhang et al. rapporterte at inaktivering av et enkelt allel av DLL4 førte til embryonisk dødelighet, noe som tyder på at DLL4 /Notch-signalering er nødvendig for vaskulær utvikling. DLL4 ekspresjon i stor grad er begrenset til endotelet for utvikling av fartøyene og tippeceller for å utvikle arterier, hvor den fungerer for å regulere antallet tippeceller for å styre fartøyet spiring og forgrening [8].
Tallrike studier har antydet at endringer i Notch aktivitet kan ha dyptgripende virkninger på endothelial atferd og blodkardannelse. Men lite er kjent om regulering og tilpasning av endotelceller Notch svar på lungekreft angiogenese. I denne studien, isolert vi vaskulære endotelceller fra Lewis lungekarsinom (LLC) subkutane xenoimplantater i endotelceller spesifikke SIRT1 knock-i C57BL /6J mus. Våre resultater viser at endotel-celler som mangler SIRT1 aktivitet blir sensibilisert for Kjær signalering, noe som resulterer i forbedret hakk target-genekspresjon og svekket spire forlengelse i respons til stimulering DLL4. Våre data støtter hypotesen om at Notch signale dynamisk regulert av acetylering og foreslår at SIRT1 fungerer som en rheostat å finjustere endothelial Notch svar.
Resultater
Isolering av Lung Cancer Xenotransplantat-avledet Vaskulær endotelceller (Lung Cancer-avledet ECS)
lungekreft avledet egenkapitalbevis ble isolert fra LLC subkutane transplantater i endotelceller spesifikke SIRT1 knock-in C57BL /6J mus [9] (fig. 1a). Som vist på fig. 1B, lungekreft-avledet egenkapitalbevis demonstrert typisk brostein morfologi og uttrykt CD31, en produsent av modne endotelceller. Dessuten, disse ECS uttrykte høye nivåer av EC-spesifikk endotelial nitrogenoksydsyntase (eNOS), men ikke E-cadherin (Fig. 1C). Disse dataene antyder at Advisor xenogaft ble effektivt anriket på lungekreft-avledet egenkapitalbevis. Disse cellene ble deretter anvendt for den etterfølgende in vitro-eksperimenter.
LLC xenotransplantater ble resekterte fra mus injisert subkutant i den dorsale flanke med LLC celler (3 x 10
6 suspendert i 50 ul PBS) i 30 dager . Etter å ha fjernet åpen nekrotiske vev eller ekstra fet komposisjoner, de hakket vev var bakken på isen ved hjelp av et glass jeksel og ble deretter filtrert gjennom celle siler for å fjerne vev rusk. (A) De CD31-uttrykkende lungecancer-avledede ECS ble isolert fra enkeltcellesuspensjonen ved immunomagnetisk sortering, som vist ved skanning mikroskopi, og dyrket in vitro. (B) CD31 ble påvist i isolerte lungekreft avledet ECS ved hjelp av immunfluorescens. CD31 antistoff farging av lungekreft avledet EC membraner vises i rødt, og kjernefysisk DAPI farging er vist i blått. (C) Totalt protein ble isolert fra anriket lungekreft-avledede ECS, bEnd.3 celler (positiv kontroll), og MLE-12 (negativ kontroll) celler. Western blot analyse ble utført ved hjelp av antistoffer mot eNOS og E-cadherin og β-actin ble brukt som intern kontroll.
Effekt av hypoksi på SIRT1 Expression i Lung Cancer-avledet egenkapitalbevis
SIRT1 ekspresjon ble undersøkt i den lungekreft-avledet ECS, og som vist i fig. S2A, SIRT1 ble sterkt uttrykt i disse cellene. Fordi hypoksi er en funksjon av de fleste svulster, undersøkte vi SIRT1 uttrykk under forskjellige hypoksiske forhold i disse cellene ved hjelp av western blot analyse. Våre resultater tydet på at SIRT1 protein nivåene ble øket i en tidsavhengig måte og nådde maksimal ved 8 timer etter eksponering lungekreft-avledet ECS til hypoksi (fig. 2A). For å avgjøre hvorvidt disse endringene i SIRT1 protein nivåer under hypoksi var på grunn av endringer i SIRT1 gentranskripsjon, vi målte SIRT1 mRNA nivåer ved hjelp av real-time RT-PCR. Våre data indikerer at lignende funn som er observert i SIRT1 protein uttrykk (Fig. 2B). Resultatene viste effekten av hypoksi på SIRT1 uttrykk i lungekreft-avledet egenkapitalbevis.
(A) Western blot analyse av SIRT1 i lungekreft avledet egenkapitalbevis utsatt for hypoksi (2% O
2) for den angitte tiden ved hjelp av et antistoff mot SIRT1. (B) SIRT1 mRNA-nivåer, målt ved sanntids RT-PCR, av total RNA oppnådd fra lungekreft avledet ECS utsatt for hypoksi (2% O
2) i den angitte tidsperioden. Dataene representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter fra hvert tidspunkt utført in triplo. * P. 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen
SIRT1 Negativt Regulerer N1IC av Deacetylering og kontroller Notch målgener i Lung Cancer-avledet egenkapitalbevis
Ved translokasjon til kjernen, den intracellulære domene av Notch1 (N1IC) samvirker med den DNA-bindende protein CSL (oppkalt etter CBF1 i pattedyr, Su (H) i Drosophila, og Lag-1 in Caenorhabditis elegans), noe som resulterer i den transkripsjonelle aktivering av Notch1 genet mål. Fordi N1IC gjennomgår hurtig ubiquitin-formidlet nedbrytning og acetylering kan svekke ubiquitinering [10], undersøkte vi effekten av SIRT1 på N1IC ekspresjon og funnet at inaktivering av SIRT1 ført til økt N1IC protein ekspresjon i respons til stimulering DLL4 (fig. 3A). Samlet utgjør disse resultatene indikerte at SIRT1 negativt regulerer Notch signalering i endotelceller når DLL4 /Notch1 signaler aktiveres.
(A) Lungekreft-avledet egenkapitalbevis ble transfektert med kontroll eller SIRT1 sirnas for 48 timer og dyrket i fravær eller nærvær av DLL4 i ytterligere 6 timer. Deretter ble N1IC protein ekspresjon detektert ved å bruke Western Blot analyse. siRNA-mediert blokade av SIRT1 aktivitet i endotelceller økte endogene N1IC protein nivåer. (B) lungekreft avledet ECS ble transfektert med HA-N1IC, pcDNA-SIRT1, pcDNA-SIRT1 H363Y, eller pcDNA3 (4 ug /mL hver) i 48 t og ble deretter behandlet med eller uten 5 nM NAM i ytterligere 12 h. Etterpå ble celleekstrakter immunopresipitert med et anti-HA-antistoff og utsatt for Western blot-analyse med et anti-acetyl-lysin (øvre panel) eller anti-HA-antistoff (nedre panel). (C) lungekreft avledet ECS ble trippel transfektert med N1IC, den acetyltransferase P300, og økende mengder av SIRT1, og cellene ble lysert 48 timer senere. Sammenlignbare nivåer av N1IC ble immunopresipitert og blottet for acetylerte lysinresidier (IP: HA og IB: anti-acetyl; øvre panel). Blottet ble reprobed for HA, som viste omtrent like nivåer av HA-N1IC (IP: HA og IB: HA, nedre panel). (D) Lungekreft-avledede ECS ble transfektert med N1IC, den acetyltransferase P300, og økende mengder av SIRT1 sammen med den Renilla luciferase reporter og den pGL3-plasmid inneholdende et CBF ildflue luciferase reporter-gen i 24 timer. Deretter ble luciferaseaktiviteten målt ved bruk av en dual-luciferase reporter-analyse. Dataene ble normalisert til den Renilla luciferase-aktivitet (gjennomsnitt ± SD; n = 3). (E) qChIP analyse av SIRT1 belegg på Notch1 proksimale promoter-regionen i lungekreft-avledet egenkapitalbevis. SIRT1 okkupert en bestemt region på -500 bp av Notch1 locus. SIRT1 ble immunopresipitert (IP) med anti-sera SIRT1 (SIRT1 IgG) eller preimmunsera (normal IgG, anvendt som en kontroll) (gjennomsnitt ± SEM; n = 3). * P 0,05 som sammenlignet med kontrollen. (F) luciferasereportergenet analyseresultatene. pGL3, pGL3-Notch1 -500 til 400 (N + 400), eller pGL3-Notch1 + 400-1750 (N + 1750) ble transfektert inn HEK293 celler med eller uten SIRT1. * P 0,05. Feilstolpene representerer SEM. (G) Uttrykk for de Notch målgener HEY1 og hey2 ble vurdert i kontroll siRNA- og SIRT1 siRNA-transfektert lungekreft-avledet egenkapitalbevis, som senere ble transfektert med tom vektor eller N1IC i opptil 48 timer. SIRT1-mangel endotelceller vises markant forbedret HEY1 og hey2 aktivitetsnivået til N1IC overekspresjon. * P 0,05 som sammenlignet med kontrollen. (H) lungekreft avledet ECS ble transfektert med kontroll eller SIRT1 sirnas og behandlet med DMSO eller 20 mM NAM i 24 timer, etterfulgt av inkubasjon med Matrigel i ytterligere 5 timer. Deretter ble røret formasjon evaluert ved hjelp av et invertert fasemikroskop. De søylediagrammer representerer de densitometry resultater. * P 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen
Vi neste testet om SIRT1 negativt regulerer N1IC via deacetylering.. Kort fortalt ble ulike versjoner av HA-merket N1IC (HA-N1IC) uttrykt i lungekreft avledet egenkapitalbevis med vektorer som koder enten SIRT1 eller en SIRT1 mutant mangler deacetylase aktivitet (SIRT1 H363Y). Celleekstrakter ble immunoutfelt med et anti-HA-antistoff og detektert med en immunoblot ved å bruke et antistoff mot acetyl-lysin. Våre resultater viste at ekspresjon av acetylert HA-N1IC var signifikant redusert i celler som uttrykker fullstendig SIRT1, sammenlignet med de proteinnivåene i celler som uttrykker SIRT1 H363Y (Fig. 3B). Imidlertid, når cellene ble behandlet med 5 nm NAM, den SIRT1-mediert inhibering av N1IC acetylering ble lettet. Videre transfeksjon av lungekreft-avledet ECS med N1IC, den acetyltransferase P300, og økende mengder av SIRT1 viste at p300 var i stand til å acetylering N1IC (fig. 3C) og styrke N1IC transkripsjonen aktivitet (Fig. 3D). Men tillegg av SIRT1 avskaffet acetylert form av N1IC og betydelig redusert N1IC aktivitet indusert av P300. Disse resultatene antydet at deacetylases aktiviteten av SIRT1 redusert overflod av acetylert N1IC. Videre aktivering av SIRT1 av SRT1720 eller SRT2183 (aktivatorer av NAD
+ – avhengig deacetylase) redusert endogene N1IC protein nivåer (Fig. S1 A), og blokkerer deacetylase aktiviteten SIRT1 med Sirtuin inhibitor nikotinamid (NAM) økt endogen N1IC nivåer i endotelceller (fig. S1B).
for å definere den mekanismen som SIRT1 undertrykker N1IC uttrykk, undersøkte vi rekruttering av SIRT1 til Notch1 locus som svar på DLL4 stimulering ved hjelp qChIP analyse. Av notatet, er det Notch1 locus tenkt å inneholde mer enn 20 høyt konserverte regioner [11]. Våre data antyder at det SIRT1 bundet til en høyt konservert region, som var plassert ved omtrent -500 bp oppstrøms for transkripsjonsstartsetet av Notch1 (fig. 3E). Dette funnet tyder på at SIRT1 kan direkte styre Notch1 uttrykk gjennom binding til den proksimale promoter regionen Notch1. For å bestemme den funksjonelle konsekvensen av SIRT1 binding til Notch1 locus, ble luciferaserapportørplasmid konstruksjoner som inneholder Notch1 reporter genet transfektert i HEK293 celler. Disse resultatene viste at SIRT1 inhiberte signifikant Notch1 reporter aktivitet når den SIRT1 bindingssetet var tilstede (fig. 3F, N + 400), som ikke ble observert når SIRT1 bindingssetet var fraværende (fig. 3F, N + 1750). Dette bekreftes ytterligere vår observasjon at SIRT1 fortrengt Notch1 transkripsjon ved binding til den Notch1 promoteren.
HEY1 og hey2 er direkte målgener av hakk signalveien i løpet av vaskulær utvikling [12]. For ytterligere å undersøke effekten av SIRT1 på HEY uttrykk, ble SIRT1 uttrykk stilnet i lungekreft avledet egenkapitalbevis av siRNA, og uttrykk for HEY1 og hey2 ble bestemt. Spesielt, SIRT1-mangel lungekreft-avledet egenkapitalbevis overekspresjon N1IC vises en markant forbedret nivå av HEY1 og hey2 aktivitet (Fig. 3G). Tilsvarende ved å stanse all SIRT1 betydelig forbedret HEY1 og hey2 uttrykk i lungekreft-avledet egenkapitalbevis i respons til DLL4 stimulering, mens ble det ikke observert endringer i unstimulated lungekreft-avledet egenkapitalbevis (Fig. S1C). Dette resultatet indikerer at SIRT1 regulering av Notch målgener var avhengig DLL4 stimulering. Videre ble den forbedrede hakk respons til DLL4 av SIRT1-manglende lungekreft-avledet ECS opphevet ved tilsetning av γ-sekretase inhibitor DAPT (fig. S1C). I motsetning til aktivering av SIRT1 signalering ved bruk av de små molekyler SRT1720 eller SRT2183 hemmet DLL4-mediert induksjon av HEY1 og hey2 ekspresjon, noe som indikerer at SIRT1 negativt modulert DLL4 /Notch1 signalering i lungekreft-avledede ECS (fig. S1D).
SIRT1 Regulerer angiogen aktivitet av Lung Cancer-avledet egenkapitalbevis
hemming av endotelial cellevekst ved DLL4 /Notch signale ble forsterket i SIRT1-forstummet lungekreft avledet egenkapitalbevis og ble reddet av Notch inhibitor DAPT (fig. S2A). I sent stadium av angiogenese, til endotelceller selv montere inn i rørene danner nye blodkar [13]. Vi undersøkte effekten av SIRT1 på neovascularization ved å undersøke tube formasjon. Som vist på fig. 3H, rørformet formasjon ble betydelig hemmet i SIRT1-forstummet lungekreft-avledet egenkapitalbevis. Tilsvarende rør dannelse i lungekreft-avledede ECS ble også undertrykt når cellene ble behandlet med den SIRT1 deacetylase inhibitor NAM. For å bekrefte dette SIRT-mediert regulering av endotelceller funksjon, ble tredimensjonale in vitro angiogenese analyser utført ved hjelp av kollagen gel-embedded endotelceller kuler som hadde blitt transfektert med kontroll eller SIRT1 sirnas. Som vist på fig. S2B, den kumulative spire lengdene av kuler i lungekreft avledet ECS transfektert med SIRT1 siRNA var betydelig kortere enn den i kontroll-transfekterte celler. Videre behandling med DAPT avskaffet inhibering av den angiogene respons til lungekreft avledet ECS indusert gjennom SIRT1 stanse, noe som tyder på at SIRT1 er en viktig modulator av endotel angiogen funksjon.
Effekt av SIRT1 på Tumor neovaskularisering i LLC xenotransplantater
for å undersøke hvilken rolle SIRT1 på vaskularisering in vivo, ble en Matrigel plugg analyse utført. I motsetning til pluggene i kontroll C57BL /6J mus, pluggene i SIRT1 knock-in transgene mus viste en rød farge, noe som indikerte at SIRT1 hadde indusert dannelse av nye blodkar. Hemoglobinnivået, noe som er en indikasjon på omfanget av angiogenese, var høyere i Matrigel plugger fra SIRT1 transgene mus enn de fra kontroll C57BL /6J-mus (fig. 4A). For å undersøke effekten av SIRT1 genet på tumor vaskularisering og tumorvekst, ble LLC celler injisert subkutant i SIRT1, SIRT1 H363Y, og villtype C57BL /6J mus. Disse resultatene indikerte at LLC tumorvolum i SIRT1 knock-in transgene mus var 115% av det som ble observert i kontrollmusene 30 dager etter tumorcelle implantasjon. I kontrast, ble tumorvekst i SIRT1 H363Y transgene mus redusert og var lik den som ble observert i villtype mus. Videre er det i de SIRT1 transgene mus, ble tumorvekst redusert når den deacetylase aktiviteten av SIRT1 ble blokkert med administrasjonen av klasse III-HDAC-inhibitor nikotinamid (Fig. 4B). Ved vurdering av microvessel densitet indeks av CD31 antistoffarging den, tumorvekstøkning observert i SIRT1 knock-in transgene mus var assosiert med en økning i tumor vaskularisering. I tillegg er anti-Dll4 behandling viste at den reduserte tumorvekst var forbundet med en tydelig reduksjon i tumor vaskulær tetthet (fig. 4C).
(A) SIRT1 fremmer angiogenese in vivo. Matrigel plugger ble subkutant injisert inn i underlivet for kontroll eller SIRT1-transgene mus, og pluggene ble ekstrahert 7 dager senere for å bestemme graden av vaskularisering. Mengden av hemoglobin tilstede i pluggene ble kvantifisert som en indikator for dannelse av funksjonelle blodkar (gjennomsnitt ± SD; n = 10 for hver gruppe). * P 0,05 som sammenlignet med kontrollen. (B) Endringer i median tumorvolum målt i (kontroll) C57BL /6J, SIRT1, eller SIRT1 (H363Y) mus villtype følgende inokulering med LLC celler for den angitte tidsperioden. * P 0,05 sammenlignet med de SIRT1 mus. (C) Mikrofotografier av CD31 IHC flekker i deler av LLC xenografter (forstørrelse, × 200) fra villtype, SIRT1 eller SIRT1 (H363Y) mus. Når de xenograft tumorvolumene nådde ca 100 mm
3, ble musene randomisert til kontrollgruppen (n = 8) eller den eksperimentelle arm (DLL4 monoklonalt antistoff; n = 10). Den høye forstørrelse felt (× 400) ble analysert for microvessel tetthet telling ved hjelp ImageJ programvare (gjennomsnitt ± SD, n = 10 for hver gruppe). * P 0,05 sammenlignet med de SIRT1 mus. De gjennomsnittlige tumorvolumer i vill-type, ble SIRT1 og SIRT1 (H363Y) mus målt etter 4 uker etter behandling. * P. 0,05 sammenlignet med kontroll
diskusjon
Denne studien utvider rolle SIRT1 for å inkludere den spesifikke modulering av angiogen aktivitet i endotelceller. For å undersøke effekten av SIRT1 på lungekreft angiogenese, vi etablert LLC xenograft modeller med endotelceller spesifikke SIRT1 og SIRT1 H363Y uttrykk i transgene mus. Endotelceller ble med suksess isolert fra LLC-xenotransplantater av SIRT1 transgene mus ved hjelp av CD31-konjugerte magnetiske kuler, samt en rekke trinn for å fjerne alle forurensende tumorceller og leukocytter. Blokade av SIRT1 funksjon avskaffet endothelial tube dannelse og spire dannelse in vitro, som ble opphevet ved Notch inhibitor. Disse resultater antyder at SIRT1-medierte regulering av Notch reaksjonsveien i endotelceller kan moduleres.
I våre studier SIRT1 ble sterkt uttrykt i lungekreft-avledede ECS. Videre har hypoksi vist seg å være en av de viktigste triggere for ny vekst av blodkar i maligne tumorer [14]. Zhang et al. viste at fordi HIC1 (Hypermethylated i Cancer 1) bundet til SIRT1 promoter, den påfølgende reduksjon av CtBP rekruttering redusert transkripsjonen undertrykkelse og indusert SIRT1 uttrykk i lungekreftceller [15]. Vi antok at SIRT1 regulering under hypoksi kan tildeles via endringer i SIRT1 genuttrykk i lungekreft-avledet egenkapitalbevis. Så vidt vi vet, var dette den første studien som viser at SIRT1 uttrykk økes i en tidsavhengig måte under hypoksi i tumor endotelceller.
neste spurt om SIRT1 samhandlet med bestemte transkripsjons partnere i vaskulære endotelceller til formidle sine spesifikke effekter. Guarani et al. [16] tidligere viste at acetylering av N1IC på konserverte lysines kontrollert amplitude og varighet av Notch svar gjennom endret N1IC protein omsetning. SIRT1 forbinder med N1IC og fungerer som en N1IC deacetylase hemmer acetylering-indusert N1IC stabilisering. Konsekvent våre resultater også indikert at SIRT1 deacetylert og undertrykt N1IC uttrykk, noe som førte til økt angiogenic spirende og tubulogenesis regulert av SIRT1 avhengige angiogen signalveien. Enda viktigere, vi viste for første gang at SIRT1 ble rekruttert til en høyt konservert region som ligger ved -500 bp oppstrøms for Notch1 transkripsjonstartsetet, noe som antydet at SIRT1 kan direkte binde til Notch1 promoteren, for derved å hemme genekspresjon. Av notater, SIRT1 negativt regulert Notch1 via deacetylering, og dermed endringer på transkripsjonsnivået av Notch kan også spille en rolle i reduksjon av Notch aktivitet påvirkes av SIRT1. Dette må være lengre bestemt.
HEY er helix-loop-helix (bHLH) transcriptional repressor. HEY familiemedlemmer regnes målgener av Notch1 signal i endotelet fordi deres uttrykk kan være forårsaket av Notch1 [12]. I denne studien undersøkte vi muligheten for SIRT1 til å regulere ekspresjonen av gener som kontrolleres av N1IC, slik som HEY1 og hey2. Etter avtale med rapporter fra Mulligan et al. [17], våre resultater viser at SIRT1 negativt regulert uttrykk for HEY1 og hey2 i lungekreft-avledet egenkapitalbevis. Videre Takara et al. viste at SIRT1 funksjonelt samhandler med hårete og Enhancer-of-delt bHLH repressors [18]. For ytterligere å undersøke effekten av SIRT1 på Notch-mediert cellerespons og tumorvekst, undersøkte vi spire dannelse i lungekreft avledet ECS og fant at inaktivering av SIRT1 svekket spire dannelse og forlengelse. Disse effektene ble reversert ved tilsetning o Notch1 inhibitor DAPT, noe som tyder på at SIRT1 modulerer endotelceller angiogenic funksjoner ved å regulere Notch signalering. Imidlertid inaktivering av SIRT1 ikke helt forhindre spire formasjon. Dermed hypotese vi at i tillegg til Notch1, nye SIRT1-regulert transkripsjonsfaktorer kan også være involvert i vaskulær utvikling, selv om fremtidige studier er nødvendig for å ta rollen som disse ukjente regulatorer i lungekreft.
Guarani et al. rapportert at P300 kan binde seg til N1IC og fungere som en co-aktivator på Notch-regulert arrangører [16]. Videre vår studie viste at p300 var ikke bare i stand til acetylering N1IC men kan også aktivere sin transkripsjon. Enda viktigere, SIRT1 hemmet den acetylerte form av N1IC og betydelig redusert N1IC aktivitet i nærvær av P300. Motsatt behandling med deacetylase inhibitor NAM ført til betydelige økninger i N1IC mRNA uttrykk. Dermed konkluderte vi med at SIRT1 deacetylase aktivitet endret endothelial Notch signalkaskade av deacetylering N1IC og motvirke P300. Hansson et al. viste at MAML1 (Notch coactivator) kan potensere p300 autoacetylation og p300 transkripsjonen aktivering [19]. Men våre resultater tyder på at SIRT1 fysisk samhandler med og undertrykker p300 trans i en NAD-avhengig måte. SIRT1 undertrykkelse av p300 har vist seg å skje via deacetylering av to lysinrester (1020 og 1024) innenfor p300 cysteinrike domene (CRD1) [20]. Fordi P300 er en gating transkripsjonen kofaktor, deacetylering og undertrykkelse av p300 ved SIRT1 kan tjene som en viktig integreringspunkt under stoffskifte og cellulær differensiering.
Ved binding av et trans ligand fra Delta /Jagged familier, Notch trans reseptorer generelt gi signaler som styrer celle skjebne beslutninger. Spesielt er DLL4 kreves for vaskulær utvikling og er sterkt uttrykt i tumorkarene [21]. I tillegg har studier av SIRT1 knock-in mus indikerte at SIRT1 fungerte for å opprettholde neovaskularisering kapasitet som respons på stimulering DLL4 i tumoren vaskulært endotel. For å bestemme funksjonen av DLL4 i løpet av tumorangiogenese i de SIRT1 transgene mus, reduserte vi det DLL4 nivået til stede i en murin tumormodell ved å bruke et anti-DLL4 monoklonalt antistoff. Våre resultater tyder på at hemming av DLL4-Notch signale resulterte i en økt vaskulær tumor tetthet. Overraskende nok vaskulær overvekst fenotype resulterte i inhibering av tumorvekst. En plausibel forklaring kan være at overdreven forgrenings resulterer i en svært kaotisk vaskulære nettverk mangler hierarkiet avgjørende for effektiv retningsblodstrøm. Perfusjon studier viste at hypersprouting tumorvaskulatur var ikke-fungerende [6], som foreslo at blokade av DLL4-Notch signalering kan føre til tumorfartøyet «abnormalization» og hemmet tumorvekst. I endotelceller, modulerer SIRT1 den transkripsjonelle aktivitet av Foxo1 og p53, og aktiverer den enzymatiske aktiviteten av endotel nitrogenoksid syntase (eNOS). Grunn av de mange faktorer nedstrøms angripes av SIRT1 for deacetylering har SIRT1 er antatt å virke som en nøkkel regulator av flere veier som er involvert i tumorvekst og vaskularisering [22]. Våre funn tyder på at pharmacological- eller molekylær-baserte blokade av SIRT1 aktivitet kan representere en lovende og ny tilnærming for å blokkere tumorprogresjon.
Sammen vår studie viser en ny rolle for SIRT1, der SIRT1 fungerer som en celle- autonom negative modulator av Notch signalering, og disse resultatene identifisere reversibel acetylering av N1IC som en viktig molekylær mekanisme som Notch responser kan dynamisk modulert. SIRT1 hemmer den acetylerte form av N1IC og reduserer i betydelig grad N1IC aktivitet indusert av p300, og begrenser derved DLL4 /hakk signale respons og inhibering av tumor angiogenese (fig. 5). Våre resultater tyder på at blokade av SIRT1 aktivitet og /eller genuttrykk kan gi nye muligheter for anti-kreftbehandling.
Vår studie viser at Delta-lignende ligand 4 (DLL4), som er sterkt uttrykt i vaskulære celler i løpet av tumor angiogenese, binder seg til reseptoren og Notch1 initierer proteolytiske spaltninger. Den endelige intramembrane cleavage katalysert av γ-sekretase fører til utgivelsen av den aktive Notch1 intracellulære domenet (N1IC), som translocates inn i kjernen og rekrutterer proteinet MAML1 og histone acetyltransferases (hatter, for eksempel P300) til CSL komplekse. Denne rekrutteringen fører til aktivering av Notch1 målgener HEY1 og hey2. Videre P300 acetylates N1IC og forbedrer sin transkripsjonen aktivitet mens SIRT1 hemmer acetylert form av N1IC og betydelig reduserer N1IC aktivitet indusert av p300, og dermed begrense DLL4 /Notch signale respons og hemme tumor angiogenese.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyr arbeidet ble gjennomført under institusjonelle retningslinjer i Guangdong-provinsen og godkjent av bruk Committee for Animal Care. Godkjenning ble også hentet fra etisk komité av Guangzhou Institute of Respiratory Disease forskning (ID. 2009-2130).
Reagenser og
in vitro
Cell behandlinger
nikotinamid og N – [N- (3, 5-difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S- fenylglysin-t-butylester (DAPT) ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (USA). SRT2183 og SRT1720 ble kjøpt fra Sirtris Pharmaceuticals (USA). DLL4 ble kjøpt fra R & D Systems (USA). Kontrollgrupper ble behandlet med de respektive kjøretøyene. Den anti-DLL4 monoklonalt antistoff (en human IgG1 isotype som kryssreagerer med både mennesker og mus DLL4, 1 mg /ml) var en gave fra MedImmune, LLC (USA).
xenograft modeller,
C57BL /6J mus (hunner, 6-8 uker gamle, som veier 15-22 g) ble kjøpt fra Shanghai SLAC Forsøksdyr Co., Ltd (Kina). Endothelial celle-spesifikke SIRT1-knock-in eller SIRT1 (H363Y) -transgenic C57BL /6J mus ble gitt av den kinesiske Academy of Medical Sciences. For å generere endotelet spesifikke SIRT1 eller SIRT1 (H363Y) -transgenic mus, human SIRT1 cDNA (NCBI ref: NM_012238.4) eller SIRT1 (H363Y) cDNA ble ligert med musen VE-cadherin promoter, og de resulterende kloner ble referert til som VE-S.
