Abstract
Satsingen på onkogen «driver» kinaser med små molekyl hemmere har vist seg å være en svært effektiv terapeutisk strategi i utvalgte ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter. Men ervervet resistens mot målrettet terapi alltid oppstår og er en betydelig begrensning i pasientbehandlingen. ROS1 fusjonsproteiner er en nylig beskrevet klasse av onkogene driver, og NSCLC pasienter som uttrykker disse fusjoner generelt svarer godt til ROS1-rettet behandling. I denne studien, søkte vi å finne mekanismer for ervervet resistens mot ROS1 hemming. For å oppnå dette, analyserte vi tumorprøver fra en pasient som opprinnelig reagerte på ROS1 inhibitoren crizotinib men etter hvert utviklet ervervet resistens. I tillegg genereres vi en ROS1 inhibering bestandig derivat av den innledningsvis følsomme NSCLC cellelinje HCC78. Tidligere beskrevet mekanismer for ervervet resistens mot tyrosin-kinase-inhibitorer, inkludert target kinase-domene mutasjon, target kopiantall vinning, epitelial-mesenchymale overgang, og omdannelse til småcellet lungekreft histologi ble funnet å ikke ligge under motstand i pasientprøven eller resistent cellelinje. Men vi fikk observere en bryter i kontroll av vekst og overlevelse signalveier fra ROS1 til EGFR i resistente cellelinje. Som et resultat av denne bryter, ROS1 hemming-resistente HCC78 cellene ble sensitive for hemning EGFR, en effekt som ble forsterket ved samtidig behandling med en ROS1 inhibitor. Våre resultater tyder på at co-hemming av ROS1 og EGFR kan være en effektiv strategi for å bekjempe motstanden mot målrettet terapi i noen ROS1 fusion-positiv NSCLC
Citation. Davies KD, Mahale S, Astling DP, Aisner DL Le AT, Hinz TK, et al. (2013) Motstand mot ROS1 hemming mediert av EGFR Pathway Aktivisering i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (12): e82236. doi: 10,1371 /journal.pone.0082236
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 17 juni 2013; Godkjent: 22 oktober 2013; Publisert: 13.12.2013
Copyright: © 2013 Davies et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra Kreft League of Colorado til KD Davies, den Boettcher Foundation Webb-Waring Biomedical Research Award til R.C. Doebele, og University of Colorado Lung Cancer SPORE tilskuddet (P50CA058187) til M. Varella-Garcia og R.C. Doebele. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling eller analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. D.L. Aisner har mottatt honorarer fra Abbott Molecular. P.A. Bunn Jr. har mottatt konsulenthonorar fra Pfizer, Novartis, Genentech /Roche, Astrazeneca, Boehringer Ingelheim, Astellas, og GlaxoSmithKline. D.R. Camidge har fått Nemnda honorarer fra Pfizer. R.C. Doebele har mottatt forskningsmidler, konsulenthonorarer, og Advisory Board honorarer fra Pfizer, honorarer fra Abbott Molecular, konsulenthonorarer og Nemnda honorarer fra Boehringer Ingelheim, forskningsmidler fra Imclone, og forskningsmidler fra Eli Lilly. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft, hvorav ca 80-85% kan kategoriseres som ikke-liten celle lungekreft (NSCLC), er den ledende årsak til kreftrelatert dødelighet i verden [1]. Nylig har det blitt klart at NSCLC er en heterogen sykdom som kan i stor grad deles basert på genetiske endringer som skaper dominerende driver onkogener [2]. NSCLC-tumorceller blir ofte «avhengige» på disse aktiverte onkogener, slik at inhibering av deres aktivitet blokker proliferative og pro-overlevelse cellulære signalering, til syvende og sist fører til vekststans og /eller celledød. Viktigere, mange av de onkogene sjåførene oppdaget hittil er aktivert kinaser som kan målrettes av små molekyl hemmere. Gefitinib og erlotinib behandling av NSCLC pasienter som hadde
EGFR
aktiverende mutasjoner og crizotinib behandling av NSCLC huse aktivere
ALK
rearrangements er vellykkede eksempler på denne strategien [3], [4]. Behandling med disse kinase hemmer narkotika resulterer i økt effekt og har mer utholdelig bivirkninger sammenlignet med standard kjemoterapi hos pasienter som er pre-screenet for aktiverings genetiske endringer [5], [6], [7].
til tross for den opprinnelige effekten av gefitinib, erlotinib, og crizotinib i utvalgte NSCLC, ervervet resistens alltid oppstår, vanligvis på mindre enn ett år. På cellenivå, skjer denne motstand ved flere mekanismer. Den første av disse er mutasjon av målet kinase domene som reduserer evnen til medikamentet å inhibere kinase. For eksempel, den T790M-mutasjonen, betegnet den «gatekeeper» mutasjon, reduserer muligheten for EGFR-inhibitorer for å utkonkurrere ATP-binding til EGFR [8]. Denne mutasjonen (sammen med andre langt mindre hyppige resistens-assosierte mutasjoner) er funnet i cellelinje modeller for motstand og i omtrent 50% av pasienter som utvikler oppnådd resistens mot EGFR-hemmere [9], [10], [11]. Den analoge gatekeeperen stilling på ALK, L1196, er på lignende måte funnet å være mutert i ALK fusjons-positiv lunge cancer ved tidspunktet for motstand mot crizotinib og i resistente cellelinje-modeller, som er flere andre aminosyrer hvor mutasjonen reduserer også muligheten for medikamentet til å inhibere kinase [12], [13], [14], [15], [16]. Den andre mekanismen for resistens er amplifikasjon av mål-kinase. I teorien kan en økning i mengden av kinase som er uttrykt av cellen redusere muligheten for medikamentet for å mette målet. Amplifisering av
ALK
-fusjoner er vist i resistente celler og pasienter som har utviklet resistens [13], [14], [16]. I tillegg amplifikasjon av
EGFR
har blitt korrelert med motstand i
EGFR
mutant lungekreft, selv om i de fleste tilfeller det forsterkede allelet havner den T790M-mutasjonen [17], [18]. En annen stor resistensmekanismen aktivering av alternative signalkomponenter. I dette tilfellet, proteiner som er nedstrøms fra, eller som fungerer parallelt til målet kinase blir aktivert og styrte avhengighet av målet kinase for å stimulere utelukkende proliferativ og pro-overlevelse signalering. MET, PI3K, BRAF, IGF-1R, FGFR1, MEK, og ERK1 /2-aktivering har alle blitt observert i EGFR-inhibitor-resistente
EGFR
mutant sykdom og /eller cellelinje modeller [18], [19] , [20], [21], [22], [23], [24]. Aktivering eller forsterkning av EGFR, KRAS, og KIT har tilsvarende blitt observert i crizotinib fast
ALK
omorganiseres pasienter og cellelinjer [14], [15], [16], [25]. Videre, en nylig undersøkelse viste at eksponering for vanlige vekstfaktorer er tilstrekkelig til å fremkalle motstand mot målrettet terapi i kreftcellelinjer fra en rekke forskjellige genetiske bakgrunner, og denne effekten korrelert med en redning fra medikament-indusert AKT og ERK-inaktivering [26]. Endelig har histologiske og morfologiske endringer blitt vist å korrelere med motstand. Spesielt konvertering til kreft histologi småcellet og epitelial-mesenchymale overgang (EMT) er observert hos
EGFR
mutante pasienter og cellelinjer som er resistente mot EGFR-hemmere [11], [18]. De mekanistiske baser bak disse endringene er ikke helt forstått.
ROS1
er en reseptor tyrosin kinase som er nært knyttet til
ALK
, og som
ALK
, gjennomgår det genomiske omleiring som skaper fusjonsproteiner i NSCLC og andre kreftsykdommer [27]. Det er godt etablert at disse fusjonsproteiner virke som onkogene drivere og det ROS1 inhibering er anti-proliferativ i celler som uttrykker ROS1 fusjoner [28]. I tillegg crizotinib, som har aktivitet mot ROS1, demonstrerer effekten i
ROS1
fusion-positiv NSCLC pasienter i en fase I studie [29]. Dermed vurderer suksessen crizotinib i
ALK
fusion-positiv NSCLC, det ser ut til at ROS1 målrettet terapi vil trolig snart bli standarden på omsorg for denne pasientgruppen. Men basert på erfaringer med andre kinase hemmere i lungekreft, det er helt forventet at ervervet resistens mot ROS1 hemming vil oppstå, og dette til slutt vil begrense behandlingstilbud for disse pasientene. Til støtte for dette, en fersk studie rapporterte en klinisk tilfelle av en
ROS1
omorganisering-positiv pasient som utviklet resistens mot crizotinib etter en innledende respons [30]. Pasienten ble funnet å ha gjennomgått en mutasjon i
ROS1
kinase domene som forstyrret narkotika bindende [30]. I denne studien, søkte vi å finne mekanismer for resistens mot ROS1 hemming. Dette ble oppnådd ved bruk av kliniske prøver fra en pasient som ble motstandsdyktig mot crizotinib og en ROS1 hemming bestandig derivat av
ROS1
omorganisert NSCLC cellelinje HCC78.
Resultater
tidligere rapportert identifisering av en NSCLC pasient som uttrykte
SDC4-ROS1
fusjon og vellykket behandling av denne pasienten med crizotinib [28]. Pasienten opplevde 57% tumorkrympning etter to 28-dagers behandlingssykluser. Imidlertid, til tross for kontinuerlig behandling, bevis på sykdomsprogresjon ble oppdaget omtrent 18 uker etter starten av behandlingen. På dette tidspunkt ble en excisional biopsi av den vandrende tumor tatt. Målrettet sekvensering av denne motstandsdyktig biopsiprøve avslørte at, i likhet med forbehandlingen biopsi, hele
ROS1
kinase domene var villtype (WT), som betyr at
ROS1
kinase domene mutasjon var ikke mekanismen for resistens (tabell 1). Snapshot analyse indikerte også WT status over vanlig muterte rester i flere andre kjente onkogener (inkludert
EGFR
,
KRAS
, og
BRAF
) i både forbehandling og etter -resistance prøver (tabell 1). Vi deretter undersøkt kopiantall gevinst på
ROS1
fusjonsgenet som en mulig mekanisme for motstand. Dette ble oppnådd ved anvendelse av fluorescens
in situ
hybridisering (FISH) med prober til både 5 «og 3′ regioner av genet. Den midlere enkelt 3»-signal (på vegne av fusjonsgenet) antall pr tumorcelle var 1,7 i pre-behandlingsprøve og 1.82 i den post-motstand prøve, en ikke-signifikant forskjell (figur 1A). Dette funn antydet at kopitallet vinning var ikke resistensmekanismen i denne pasientens tumor. Den post-motstand prøven avdekket et tap i enkelt 5 «signal; men dette er ikke forventet å være funksjonelt signifikant (figur 1A). Vi har bekreftet at fusjonsgenet ble uttrykt ved tidspunktet for motstand, og at forholdet mellom lange (
SDC4
ekson 2 fusjonert til
ROS1
exon 32 (SD2, R32)) til å kort (
SDC4
ekson 2 smeltet til
ROS1
ekson 34 (SD2; R34)) varianter var lik den forbehandling prøve (Figur 1B). Morfologisk undersøkelse av prøver som er tatt på motstand demonstrert fyldige epiteloide celler med en stor atom til cytoplasma-forhold, fremtredende nukleoli, og eosinofil cytoplasma, lik den forbehandling biopsi (figur 1C). Disse resultatene antydet at små celletransformasjon ikke hadde funnet sted. Til slutt, ingen morfologiske tegn på EMT, slik som celledelte spindling, ble observert, og biopsi tatt på motstand viste negativ immunhistokjemisk farging for vimentin, en EMT markør (figur S1). Mangelen på bevis for disse vanlige resistensmekanismer var forenlig med oppregulering av alternative signal som underliggende mekanismen av resistens mot crizotinib i denne pasienten.
(A) Pre-behandling og post-motstand pasientprøver analysert ved pause- bortsett FISH analyse for
ROS1
. Røde prober er til 5′-regionen av ROS1 og grønne prober til 3′-regionen. Verdier representerer gjennomsnitt antall signaler per celle. Singelen 3 «signal (verdier understreket) er tegn på den
ROS1
fusjon genkopitallet. (B) RT-PCR, ved hjelp av primere til
SDC4 Hotell og
ROS1 Hotell som spenner hvis smeltepunkt, utført på forbehandling og etter motstand tumorprøver. SD2, R32 er «lange» varianten (sammensmelting av
SDC4
ekson 2 til
ROS1
ekson 32) og SD2, R34 er «kort» variant (sammensmelting av
SDC4
ekson 2 til
ROS1
exon 34). (C) Hematoxylin og eosin farging av pre-behandling og post-motstand pasientprøver.
For å skape en cellelinje modell av motstand mot ROS1 hemming, vi kronisk behandlet
SLC34A2-ROS1
uttrykke NSCLC cellelinje HCC78 med økende konsentrasjoner av ROS1 inhibitor TAE684. Denne metoden har vært brukt tidligere for å skape resistente modeller for både EGFR-hemmere i
EGFR
mutante celler og crizotinib i
ALK
omorganiseres celler, og mekanismene observert i disse modellene har korrelert med hva som er observert hos pasienter [13], [15], [19]. Vi valgte å bruke TAE684 (en ikke-klinisk forbindelse) over crizotinib (et legemiddel med klinisk aktivitet mot ROS1) fordi crizotinib har en relativt høy IC
50 i HCC78-celler og bare en svært smale vindus utganger mellom IC
50 og off-target aktiviteter av medikamentet [28], [31]. Med andre ord, ved hjelp av TAE684 for å gjøre cellene resistente overfor inhibering ROS1 istedenfor crizotinib, var vi i stand til å sikre en mer fullstendig inhibering av den ROS1 fusjonsprotein ved doser som ikke utviser off-target-anti-proliferative effekter. Etter ca fire måneder for kultur i økende konsentrasjoner, er motstandsdyktig deriverte av HCC78 linje, som vi kalt HCC78-TR, var i stand til å formere seg normalt i 500 nM TAE684. Innledende forsøk på å øke dosen i kultur ytterligere var mislykket, slik at 500 nM ble ansett som et maksimum, og cellene ble dyrket kontinuerlig i dette konsentrasjon av medikament. Når sensitiviteten av disse celler overfor TAE684 ble analysert i proliferasjonsanalyser, ble det fastslått at IC
50 av TAE684 var større enn 1 um (figur 2A). Dette ligner på andre NSCLC cellelinjer som ikke inneholder ALK eller ROS1 fusjoner (H322 og HCC4006), noe som tyder på at anti-proliferative effekter i denne serien er trolig på grunn av off-target aktiviteter. HCC78-TR-celler var også mindre følsom for crizotinib, og igjen, nivået av følsomhet var mer lik celler som ikke uttrykker ALK eller ROS1 fusjoner (figur 2B). Men desensitivisering var spesifikke for ROS1 hemming, som HCC78-TR celler beholdt sin følsomhet for pemetrexed, en FDA-godkjent kjemoterapi for ikke-plateepitel lungekreft (figur 2C). Motstanden mot ROS1 inhibering var ikke avhengig av en kontinuerlig dyrking i nærvær av 500 nM TAE684, fordi celler som ble tatt ut av stoffet forble bestandig i opp til 6 måneder og 47 passasjer (fig S2).
Celler ble behandlet med TAE684 (A), crizotinib (B), eller pemetrexed (C) som enkelt-midler i 3 dager og deretter analysert ved hjelp av MTS-analyse. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 3-7). Beregnet IC
50 verdier for TAE684: foreldre HCC78 = 0,14 mikrometer, HCC78-TR = 1,09 um, H322 = 1,42 mikrometer, og HCC4006 = 1,15 mikrometer. Beregnede IC
50 verdier for crizotinib: foreldre HCC78 = 0,79 um, HCC78-TR = 1.95 um, H322 = 4,13 mikrometer, og HCC4006 = 3.03 pm. Beregnet IC
50 verdier for pemetrexed: foreldre HCC78 = 11 nM og HCC78-TR = 14 nM. HCC78-TR cellene var betydelig mindre følsom enn foreldre HCC78 celler til TAE684 (p 0,000005) og crizotinib (p 0,05), men ikke pemetrexed (p 0,05). Som bestemmes av studentens paret t-test
Sekvensering av foreldre HCC78 og HCC78-TR celler indikerte at kinase domene
ROS1
var WT for begge linjene, noe som tyder på at
ROS1
mutasjon var ikke ansvarlig for motstanden mot ROS1 hemming (tabell 1).
EGFR
,
KRAS
, og
BRAF
ble også funnet å være WT i begge cellelinjene (tabell 1). FISH-analyse viste at HCC78-TR-celler tapt en kopi av
ROS1
fusjonsgenet i forhold til den parentale linje (en kopi i forhold til 2 kopier, henholdsvis), hvilket antyder at kopiantall vinning av fusjonsgenet var ikke resistensmekanismen (figur 3A). Som et resultat av den genomiske tap av en kopi av fusjonsgenet, mindre
SLC34A2-ROS1
mRNA ble uttrykt i HCC78-TR-celler (Figur S3). Selv om betydningen av redusert fusjons genekspresjon er uklart, tvunget ekspresjon av et aktivert ROS1-fusjonsprotein (SDC4-ROS1) i HCC78-TR-celler ikke re-sensibilisere dem til TAE684 (figur S4). vises Omtrent 40% av HCC78-TR celler en økning i antall kopier av 5 «regionen
ROS1 plakater (fra to eksemplarer til fire eksemplarer), selv om dette ikke er forventet å være funksjonelt viktig som 5 «regionen utviser ikke kinase-aktivitet (figur 3A). I tillegg gjorde morfologi av HCC78-TR cellene ikke visuelt skiller seg fra foreldrenes HCC78 linje, noe som tyder på at konvertering til en liten kreft morfologi celle lunge skjedde ikke (figur 3B). Ved mRNA kvantifisering,
CDH1
nivåene var like i de to cellelinjer og
VIM
nivåer ble redusert tre ganger i HCC78-TR linjen (figur S5). Disse resultatene tyder på at EMT var ikke resistensmekanismen. Til slutt, vi ikke observere betydelige økninger i mRNA uttrykk for noen av ATP-bindende kassett transporter familie gener i HCC78-TR-celler, noe som tyder på at økt legemiddelutstrømningen mest sannsynlig ikke står for motstanden mot ROS1 hemming (tabell S1).
(A) Foreldre HCC78 og HCC78-TR celler analysert ved innbrudd fra hverandre FISH analyse for
ROS1
. Røde prober er til 5′-regionen av ROS1 og grønne prober til 3′-regionen. Verdier representerer antall signaler per celle. Singelen 3 «signal (verdier understreket) er tegn på den
ROS1
fusjon genkopitallet. I HCC78-TR linje, to populasjoner eksistert som skilte basert på antall av 5 «skredtatte. (B) Representative lyse felt bilder av foreldrenes HCC78 og HCC78-TR celler.
Vi spurte om motstanden mot ROS1 hemming kan skyldes endringer i nedstrøms cellesignalering. Foreldre HCC78 og HCC78-TR-cellene ble behandlet med et doseområde av TAE684 i 4 timer og deretter cellelysatene ble analysert ved hjelp av western blot. I likhet med hva vi tidligere har rapportert, TAE684 behandling redusert ROS1 autofosforyleringsaktivitet og aktivering fosforylering av SHP-2, AKT, og ERK1 /2 i foreldre HCC78 celler (figur 4A) [28]. Som spådd fra genomisk kopiantall tap av
ROS1
fusjonsgenet og redusert mRNA uttrykk, de HCC78-TR cellene uttrykte mindre av fusjonsproteinet enn foreldrelinjen og ROS1 autofosforylerings kunne ikke påvises. Reduksjonen i mengden av ROS1 fusjonsprotein korrelert med en reduksjon i den basal fosforylering av SHP-2. Men til tross for fusjonsproteinet tap, basalnivåer av fosforylert ERK1 /2 var lik den parentale linje og basalnivåer av fosforylert AKT var større enn i den parentale linje. Viktigere, gjorde TAE684 behandling ikke fører til de-fosforylering av AKT eller ERK1 /2 i resistente celler. Lignende resultater ble observert med crizotinib behandling (figur 4B).
Celler ble behandlet med TAE684 (A) eller crizotinib (B) i 4 timer. Lysater av cellene ble deretter analysert ved Western blot ved anvendelse av de angitte antistoffer.
Reduksjonen i mengden av uttrykt ROS1 fusjonsprotein, utholdenhet av basal AKT og ERK1 /2-aktivering, og den manglende hemming av AKT og ERK1 /2 av ROS1 inhibitorer antydet at en alternativ signalveien ble aktivert i HCC78-TR-celler. I et forsøk på å identifisere oppregulert pathway komponentene, utførte vi to fosfo-protein-array-eksperimenter: en som undersøkes reseptor-tyrosinkinaser (RTK’er) og en som analyseres nedstrøms kinaser (blant andre proteiner). Som vi har sett tidligere, uttrykte foreldre HCC78 linjen fosforylert EGFR og MET når undersøkt med fosfor-RTK array (figur 5A) [28]. Den HCC78-TR linjen fortsatt uttrykt fosforylert EGFR, men fosfor-MET ble betydelig redusert (figur 5A). Ingen andre vesentlig fosforylerte reseptor-tyrosin-kinaser ble observert. Som forutsagt fra western blot-analyse ble AKT fosfo-S473 øket i HCC78-TR-celler sammenlignet med de parentale celler, som var flere fosforyleringsseter på p53 (figur 5A). Disse var de eneste forskjellene observert av fosfor-protein array.
(A) Phospho-RTK (øverst) og fosfor-kinase (nederst) rekke analyser utført på ubehandlet foreldre HCC78 og HCC78-TR celler. Proteiner av interesse er merket. Umerkede flekker på hjørnene av begge sett av arrays er positiv kontroll. (B) Foreldre HCC78 og HCC78-TR-celler ble behandlet med TAE684, gefitinib, eller en kombinasjon av begge deler i 4 timer. Lysater av cellene ble deretter analysert ved Western blot ved anvendelse av de angitte antistoffer. (C) Parental HCC78 (P) og HCC78-TR (T-celler) ble ubehandlet, behandlet med 1 uM gefitinib i 4 timer, og ble behandlet med 100 ng /ml EGF i 10 minutter. Lysater av cellene ble deretter analysert ved Western blot ved anvendelse av de angitte antistoffer.
Vi har tidligere vist at EGFR-signalering er delvis aktiv i den paren HCC78 linje, som et potent anti-proliferativ effekt av TAE684 kunne bare oppnås med samtidig behandling med EGFR-hemmer gefitinib [28]. På grunn av de observasjoner som EGFR var den eneste betydelig fosforylerte RTK i HCC78-TR linje, og at AKT, som vanligvis aktiveres på nedstrømssiden av EGFR, var mer tungt fosforylert i HCC78-TR linje, har vi antatt at kanskje EGFR-signalisering hadde vært videre engasjert i resistente celler. For å teste denne hypotesen, behandlet vi foreldre HCC78 og HCC78-TR celler med 200 nM TAE684, 1fiM gefitinib, eller en kombinasjon av begge deler i 4 timer. Igjen, fosfor-AKT og fosfor-ERK1 /2 var følsomme for TAE684 behandling i foreldrelinjen, men ikke den HCC78-TR linjen (figur 5B). Men situasjonen ble snudd når disse linjene ble behandlet med gefitinib, med nedstrøms signal være sensitive i HCC78-TR linje, men ikke foreldrelinjen (figur 5B). Lignende effekter ble observert med kjemisk distinkte EGFR-hemmere erlotinib, lapatinib, og afatinib, noe som tyder på at effekten skyldtes on-target EGFR hemming (figur S6). Dermed hadde WT EGFR blitt den dominerende driveren for vekst og overlevelse signalveier i HCC78-TR celler. Denne endringen i cellulær signalisering korrelert med en beskjeden økning i totale EGFR-nivåer i HCC78-TR-celler sammenlignet med foreldre HCC78-celler (figur 5C). Autofosforylering av EGFR, som bestemt ved western blot ved anvendelse av en cocktail av fosforyleringssete-spesifikke antistoffer, var relativt lav i begge cellelinjer. Imidlertid, ved stimulering med EGFR-ligand EGF, ble autofosforylering øket, og var høyere i HCC78-TR-celler (figur 5C). mRNA kvantifisering viste at de fleste EGFR-ligander ikke var signifikant mer uttrykt i HCC78-TR-celler, med unntak av NRG1 som oppviste en 4 ganger økning i mRNA-nivåer (figur S7).
På grunn av bryteren i kontroll av vekst og overlevelse signalveier fra ROS1 til EGFR i HCC78-TR-celler, en hypotese vi at proliferasjonen av disse cellene vil være følsomme for EGFR-inhibering. For å teste denne hypotesen, behandlet vi begge foreldre HCC78 og HCC78-TR celler med gefitinib som en enkelt-agent i spredning analyser. Som vi tidligere har rapportert, gjorde gefitinib ved konsentrasjoner opp til 5 mikrometer ikke påvirke spredning av foreldre HCC78 celler (Figur 6A) [28]. Imidlertid medikamentet beskjedent hemmet proliferasjonen av HCC78-TR-celler (figur 6A). Lignende effekter ble observert med erlotinib (data ikke vist). Vi har da antatt at, siden HCC78-TR-celler fremdeles uttrykte en viss, om enn reduserte nivåer av ROS1 fusjonsproteinet, ville et fullstendig anti-proliferativ effekt indusert ved gefitinib krever ko-inhibering av ROS1. For å teste denne hypotesen, behandlet vi HCC78-TR celler med en dose rekke gefitinib i kombinasjon med 500 nM TAE684 (konsentrasjonen av stoffet som disse cellene ble kontinuerlig dyrket i). Tilsetningen av 500 nM TAE684 hadde ingen anti-proliferativ effekt i seg selv; Men det ytterligere sensibiliserte cellene til gefitinib behandling (figur 6B). Under disse forhold, HCC78-TR-celler var ikke like følsom som HCC827 NSCLC-cellelinjen som er drevet av E746_A750del EGFR. Dette er forventet fordi aktiverende mutasjoner i EGFR styrke sin tilhørighet til EGFR kinase hemmere [32]. Imidlertid HCC78-TR-celler var like eller mer følsom enn de WT EGFR-uttrykkende NSCLC linjer H358 og H322, henholdsvis (figur 6B). Disse to cellelinjene er blitt rapportert å være svært følsom for gefitinib når sammenlignet med andre WT EGFR-uttrykkende NSCLC-linjer [33]. Viktigere, i HCC78-TR-celler, ble betydelig anti-proliferativ aktivitet observert ved klinisk relevante doser av gefitinib (~ 1 mm) når den kombineres med ROS1 hemming [34].
(A) Foreldre HCC78 og HCC78- TR-celler ble behandlet med gefitinib som en enkelt-middel i 3 dager og deretter analysert ved hjelp av MTS-analyse. (B) Foreldre HCC78 og HCC78-TR celler ble behandlet med 500 nM TAE684 og gefitinib, og HCC827, H322 og H358-celler ble behandlet med mono gefitinib i 3 dager og deretter analysert av MTS analysen. Beregnet IC
50 verdier: foreldre HCC78 (under 50% med mono TAE684), HCC78-TR = 0,86 mikrometer, HCC827 = 0,04 mikrometer, H322 = 5 mikrometer, og H358 = 1,0 UM. Alle verdier representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 4).
Som en proof-of-concept som EGFR aktivering kan de-sensitiv ROS1 fusjonsdrevne celler til ROS1 hemming, undersøkte vi effekten av ligand-induserte reseptoraktivering på sensitivitet. For å oppnå dette, utførte vi proliferasjonsanalyser undersøke sensitiviteten til TAE684 i fravær eller nærvær av EGFR ligand EGF. Vi har funnet at tilsetning av EGF ved begynnelsen av analysen vesentlig ufølsomme foreldre HCC78 cellene til inhibering av ROS1 (figur 7A). I motsetning til dette, EGF hadde ingen effekt på følsomheten av HCC78-TR-celler, noe som var forventet på grunn av den allerede maksimal ufølsomhet av denne linje (
cf
figur 2A). Mekanistisk, desensitization i foreldre HCC78 celler korrelert med en redning av EGF fra TAE684-indusert de-fosforylering av AKT og ERK1 /2 (figur 7B).
(A) Foreldre HCC78 og HCC78-TR celler ble behandlet med TAE684 i 3 dager med eller uten tilsetning av 100 ng /ml EGF og deretter analysert ved hjelp av MTS-analyse. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 3). Beregnet IC
50 verdier for TAE684: foreldre + bil = 0,18 mikrometer, foreldre + EGF = 0,57 mikrometer, HCC78-TR + bil = 1,39 mikrometer, og HCC78-TR + EGF = 1.45 mikrometer. EGF vesentlig ufølsomme foreldre HCC78 men ikke HCC78-TR-celler til TAE684 som bestemmes av studentens paret t-test (p 0,05). (B) Sperre HCC78-celler ble behandlet med TAE684 i 4 timer, EGF i 10 minutter, eller en kombinasjon av begge. Lysater av cellene ble deretter analysert ved Western blot ved anvendelse av de angitte antistoffer. (C) Cutò-2-celler ble behandlet med TAE684 i 4 dager med eller uten tilsetning av 100 ng /ml EGF og deretter analysert ved hjelp av MTS-analyse. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 3). Beregnede IC
50 verdier for TAE684: + kjøretøy = 0,2 pm og + EGF = 0,81 um. EGF vesentlig ufølsomme Cutò-2-celler til TAE684 som bestemmes av studentens paret t-test (p 0,01). (D) Cutò-2-celler ble behandlet med TAE684 i 4 timer, EGF i 10 minutter, eller en kombinasjon av begge. Lysater av cellene ble deretter analysert ved Western blot ved anvendelse av de angitte antistoffer. Fosforylert ROS1 bandene var under deteksjonsgrensen, og ble derfor ikke inkludert.
En cellelinjen ble avledet fra biopsien som ble tatt fra pasientens motstandsdyktig svulst. Realiseringen av en slik cellelinje, som vi har betegnet Colorado Universitetet Thoracic Oncology-2 (Cutò-2), tok omtrent ett år i kultur og ble utført i fravær av en inhibitor ROS1. Når cellene nådde tilstrekkelig passasje antall (mer enn 35 passeringer) og tilstrekkelig vekstraten for eksperimentell analyse, undersøkte vi ROS1 fusjonsgenet status, ROS1 fusjonsprotein uttrykk, og følsomhet overfor ROS1 inhibering. De Cutò-2-celler ble bekreftet å fortsatt vise omorganisering av
ROS1
genet og uttrykker en ROS1 fusjonsprotein (figur S8A, B). I spredningsanalyser, de Cutò-2-celler viste en lik følsomhet for TAE684 og en litt økt følsomhet for crizotinib forhold til foreldre HCC78 celler (Figur 7C og Figur S8C). Interessant, som foreldre HCC78 celler, følsomhet for ROS1 hemming kunne bli redusert med EGF søknad og dette desensitivisering korrelert med redning fra TAE684-indusert reduksjon av fosforylert AKT og ERK1 /2 (figur 7 C og D).
diskusjon
ervervet resistens til målrettede terapier er en stor begrensning for behandling av lungekreftpasienter. Imidlertid kan rasjonelle tilnærminger for å bekjempe resistens utvikles når de molekylære og cellulære mekanismer som ligger bak det er identifisert. I denne studien undersøkte vi resistensmekanismer for å ROS1 inhibering i NSCLC. Dette ble oppnådd ved bruk av tumorprøver fra en NSCLC pasient som ble resistente mot crizotinib og en NSCLC cellelinje som vi har gjort motstandsdyktig mot ROS1 hemming ved kontinuerlig kultur i ROS1 inhibitor TAE684. Ideelt studier gjennomført for å undersøke resistensmekanismer involvere samplingsbanker fra flere pasienter og flere ulike cellelinjer. Men som
ROS1
rearrangements er bare til stede i 1-2% av NSCLC, vi bare hadde tilgang til en pasient som ble resistente mot behandling. Videre, før vår avledning av Cutò-2 linje, HCC78 var den eneste publisert NSCLC cellelinje kjent for å uttrykke en ROS1 fusjonsprotein. Til tross for disse begrensningene, funnene fra denne studien har viktige implikasjoner for
ROS1
omorganisering-positive pasienter som blir resistente mot crizotinib behandling. Før vår studie, hadde bare én publisert rapport identifisert en mekanisme for motstand mot ROS1 hemming. I studien av Awad et al., En
ROS1
omorganisering-positiv pasient som i utgangspunktet svarte på crizotinib men ble motstandsdyktig ble funnet å ha fått en mutasjon ved kodon 2032 av en
ROS1
fusjonsgenet (
CD74-ROS1
). Denne mutasjonen ble vist å interferere med crizotinib binding til ROS1 ATP-bindingssetet [30].
